高效液相色谱的原理与构造课件.pptx
第三讲 高效液相色谱(HPLC)的原理与构造,陆跃乐浙江工业大学 发酵工程研究所,内容概要,一、高效液相色谱简介二、高效液相色谱的固定相和流动相三、高效液相色谱分离公式与术语四、液相色谱仪的基本配置五、检测器的种类和用途六、色谱柱简介,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,2,一、 什么是HPLC？,高效液相色谱： HPLC (High Performance Liquid Chromatography )是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效 能分离手段：高性能色谱柱，高精度输液泵，高灵 敏度检测器广泛应用于各个领域: 医药，环保，石化，生命科学，食品，农业无论在技术上，理论上，还是在应用上仍有较大的 发展空间: 超高压液相色谱(UPLC)的创立,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,3,高效液相色谱的流程,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,4,二、高效液相色谱固定相和流动相,2.1固定相的种类：1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；,（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底；,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,5,（3）化学键合固定相,化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： SiC d. 硅氮键型： SiN,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,6,化学键合固定相的特点：,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；,存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,7,2.液-固吸附分离固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：510 m；,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,8,3.离子交换色谱分离固定相,结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团） 树脂类别：（1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2） 阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,9,4. 空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,10,2.2 液相色谱的流动相,1. 流动相的特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,11,2. 流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,12,3. 流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,13,4. 选择流动相时应注意的几个问题,2022/12/2,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,浙江工业大学 发酵工程研究所,14,2.3 HPLC分类,按流动相和固定相的相对极性分:正相色谱(Normal Phase Chromatography) 固定相的极性大于流动相反相色谱(Reversed Phase Chromatography) 固定相的极性小于流动相有机化合物的极性：分子间作用力(静电引力,偶极力,色散力,氢键力)综合表现的一种描述。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,15,2.4 HPLC的基本类型：,等度： 吸光度相同； 在整个运行过程中溶剂组成保持不变 (60:40 甲醇/水),2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,16,梯度： 在运行过程中溶剂组成变化； 渐变或台阶式变化。 100% H20/ 0% MeOH 到0% H2O/100% MeOH,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,17,三、HPLC分离公式与术语,色谱图：样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称 色谱流出曲线(elution profile)。这是一张由仪器提供的表示分离状况的色谱图，这张色谱图含有丰富的信息，现在我们来测量色谱图并以此对一些基本理论展开讨论。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,18,基线(base line)经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,19,漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。色谱峰(peak)组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,20,峰底基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peak height，h)峰的最高点至峰底的距离。峰宽(peak width，W)峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。半峰宽(peak width at half-height，Wh/2)峰高一半处的峰宽。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,21,峰面积(peak area，A)峰与峰底所包围的面积。,洗脱体积(V)和峰宽(W):,洗脱体积也可按保留时间表示，记作t。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,22,分离度（R）：分离程度的度量,简单来说，分离度即为两峰相对于其峰宽分开得有多远。分离度大于1.5视作完全分离。,时间 0.5 1 2 5,R 1= 21 1/2(1+2),R21= 21 1/2(0.5+0.5) =2R31= 51 1/2(0.5+0.5) =8,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,23,保留因子（k）：保留能力的量度,k是样品与填料作用强度的直接量度。,0.5 1 2 5,k1 = 10.5 0.5 =1k2 = 20.5 0.5 =3k3 = 50.5 0.5 =9,k1 = 10 0,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,24,分离因子（）：峰分离程度的量度,是两个化合物在同一套色谱系统上，保留差异的数值表述。,0.5 1 2 5,= k2 k1 = 20 10,峰2/峰1的= 20.5 10.5 =3峰3/峰1的= 50.5 10.5 =9,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,25,理论塔板数（N）：分离效率的量度,理论塔板数或柱效是一个数值，它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度。,=16 t W 2,=16 5 0.5 2=1600=16 5 2 2=100,W=0.5 W=2 t=5,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,26,分离度方程式（R）：,分离度方程式描述了分离度与分离因子、柱效和保留因子之间的关系。它是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化分离方法的依据。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,27,分离度方程：保留因子k项,k值发生变化，对分离度有何影响？,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,28,分离度R与保留因子k项之间的关系,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,29,分离度方程：分离因子项,当值很小的时候，其很小的变化也可引起R值较大的变动；当值很大的时候，此项接近1。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,30,分离度方程：柱效N项,分离度R与理论塔板数的平方根成正比,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,31,色谱峰对称性的测量方法,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,32,四、HPLC的构造,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,33,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,34,4.1 真空脱气机,系统中气泡的产生：流动相本身存在，梯度淋洗混合后放出气泡；气泡的影响：存在于管路中，系统压力不稳定，实验结果有偏差；存在于单向阀中，易造成液体回流，流量不准确，甚至是 不吸液；存在于检测器中，出现鬼峰，影响检测准确性。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,35,如果所用泵在低压端进行溶剂混合（如 Agilent 1200 系列四元泵），则需要进行脱气，因此必须配备一台真空脱气机或其他脱气系统（如用氦气进行脱气）。单元泵和高压混合泵则通常不需要进行脱气。但在下述情况下，对于等度洗脱或高压混合泵也建议使用真空脱气机：如果在低 UV 波长段、用最高的灵敏度进行检测，如果分析要求使用最佳的进样精度，或如果分析要求保留时间重现性很高（在流速低于 0.5 ml/min 时必须使用）。如果样品或检测对流动相中溶解的氧敏感（降解）。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,36,溶剂瓶中的溶剂在 LC 泵的抽取下流过真空箱内的特殊管状塑料膜。当溶剂经过真空管时，溶剂中溶解的气体将渗过塑料膜进入真空箱。当溶剂离开真空脱气机的出口时，几乎已被完全脱气。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,37,Agilent 1200 系列真空脱气机（G1322A 型）由一个四通道（有四个管状塑料膜）真空箱和一个真空泵构成。打开真空脱气机后，控制电路即开启真空泵，真空泵运行使真空箱内产生部分真空。其压力由压力传感器测定。根据压力传感器的信号，真空脱气机通过打开或关闭真空泵来维持部分真空。,4.2 四元泵,高压输液泵：最高压力可大400 bar；四通道：方便使用，比如：A通道水，B通道乙腈，C通道甲醇，D通道临时流动相。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,38,四元泵包括一个溶剂槽、一个真空脱气机和一个四通道梯度泵。四通道的梯度泵包括一个高速配量阀和一个泵组件。它通过低压混合来产生梯度。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,39,四元泵的液路图,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,40,4.3 自动进样器,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,41,流路中为高压力工作状态；通常使用耐高压的六通阀进样装置；其结构如图所示：,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,42,4.4 手动进样器,Agilent 1200 手动进样器使用Rheodyne 7725i （罗丹尼）七通进样阀。样品经阀前部的进样口打入外接于阀的20 l 样品环。 阀内有陶瓷固定片和Vespel 进样密封。当阀在进样和充样位置之间来回切换时，固定片上的先合后开通路确保流量不被中断。阀装在钢制固定杆上，并能装在LC 系统两侧。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,43,充样位置：在充样位置 ，泵直接和柱子联接( 孔2 和孔3 联接)，并且针口和样品环联接。至少2 到3 倍样品环体积的样品通过针口注入，以便达到好的精度。样品填入环内，过量的样品通过和孔6 联接的排放管排出。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,44,进样位置：在进样位置 ，泵和样品环联接( 孔1 和孔2 联接)。将全部样品从环冲洗到柱。针口和排泄管( 孔5) 联接。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,45,4.5 柱温箱,Agilent 1200 系列柱温箱是用于 LC 的叠放式温度控制柱温箱。它即可作为单独模块使用又可作为 Agilent 1200 系列系统的一部分使用。用它来加热和冷却色谱柱，以达到保留时间重现性的最高要求。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,46,五、检测器,样品在经过色谱柱分离后，各个组分先后进入到检测器中，由检测器进行检测。对检测器的一般要求为：灵敏度高、重复性好、线性范围宽、死体积小、对温度和流量的变化不敏感。高效液相色谱中，常用的检测器可分为两类：溶质性检测器：它仅对被分离组分的物理或物理化学特性 有响应。如紫外、荧光、电化学检测器等。总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应， 如示差折光检测器等。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,47,(1) 紫外检测器,作用原理：依据被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光率的关系遵守比尔定律。比尔朗伯定律数学表达式A=lg(1/T)=KbcA为吸光度，T为透射比，是透射光强度比上入射光强度； K为摩尔吸收系数，它与吸收物质的性质及入射光的波长 有关，c为吸光物质的浓度 b为吸收层厚度。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,48,紫外检测器的特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,49,（2）光电二极管阵列检测器,2022/12/2,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,浙江工业大学 发酵工程研究所,50,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,51,光电二极管阵列检测器,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,52,（3）示差折光检测器,2022/12/2,除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种；,浙江工业大学 发酵工程研究所,53,示差折光检测器,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,54,（4）荧光检测器,2022/12/2,原理：物质受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光，可用荧光检测器检测，而某些不发生荧光的物质也可通过化学衍生转变成能发射荧光的物质而得到检测。,浙江工业大学 发酵工程研究所,55,优点：选择性强，灵敏度高，比紫外检测器高2-3个数量级，可达pg级别甚至更低，也可用于梯度淋洗。高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。缺点：样品适用范围有限，定量分析的范围较窄（104-105）。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,56,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,57,常见的荧光基团：1、二苯乙烯类，目前广为应用的荧光增白剂主体2、香豆素类3、荧烷类（氧杂蒽）4、苯并恶唑类（包括咪唑，噻唑）5、萘二甲酰亚胺类（与4供体）6、噻吩二羧酸酰胺类（与4供体）7、稠环芳烃类（荧蒽）8、苝四甲酰亚胺系列,六、色谱柱,色谱柱是一根填满填料的管子，是液相色谱分离的关键；柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢)和尺寸(内径,长短)不尽相同；管内的填料更是种类繁多,主要分为两大类：硅胶基质聚合物基质色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术。,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,58,色谱柱的一般结构,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,59,色谱柱的装填,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,60,不同填料的选择性差异,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,61,色谱柱填料颗粒尺寸演变的启示,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,62,分离能力的衡量：柱长与颗粒度的比值,2022/12/2,浙江工业大学 发酵工程研究所,63,
