荧光光谱的原理及应用课件.ppt

1,荧光是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。,2,磷光是一种缓慢发光的光致冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线）照射，吸收光能后进入激发态（具有和基态不同的自旋多重度），然后缓慢地退激发并发出比入射光的的波长长的出射光，而且与荧光过程不同，当入射光停止后，发光现象持续存在。发出磷光的退激发过程是被量子力学的跃迁选择规则禁戒的，因此这个过程很缓慢。,3,4,5,主要内容,荧光光谱的基本原理,1,荧光光谱仪的原理、操作及数据处理,2,荧光光谱的应用,3,参考资料,4,6,荧光光谱的基本原理,7,分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；,一、分子能级与跃迁,激发： 基态(S0)激发态(S1、S2激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；失活： 激发态 基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；,第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、电子激发三重态 T1 、T2 ；,8,电子激发态的多重度： M = 2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；,电子激发态的多重度,单重态： 一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。三重态： 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。,9,10,跃迁规则,跃迁前后原子核的构型没有发生改变、跃迁过程中电子自旋没有改变、跃迁前后电子的轨道在空间有较大的重叠和轨道的对映性发生了改变的跃迁是允许的；（S0 S1允许跃迁）,跃迁过程中电子自旋发生了改变、跃迁前后电子的轨道在空间不重叠或轨道的对映性未发生改变的跃迁是禁阻的。（S0 T1禁阻跃迁）,Franck-Condon原理： 在电子跃迁完成的瞬间，分子中原子核的构型是来不及改变的。,11,单重态能级间的跃迁符合光谱选律，跃迁概率大。分子通过吸收辐射而直接被激发到三重态的跃迁是禁阻的，概率很小。,12,雅布隆斯基分子能级图,S 2,13,电子处于激发态是不稳定状态，容易返回基态，在这个过程中通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量，这个过程就称为失活。,激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大。,失活的途径,14,振动弛豫：同一电子能级内以热量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间一般为10-12 s。 激发态分子常常首先发生振动驰豫。,无辐射跃迁失活的途径,通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。,内转换：多重度相同的电子能级中等能级间的无辐射能级跃迁。,15,无辐射跃迁失活的途径,系间窜越：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。含有重原子的分子中（如I、Br等），系间窜跃最常见。,外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。,16,荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（ 多为 S1 S0跃迁），发射波长为 2的荧光； 10-710-9 s 。,辐射跃迁失活的途径,磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（ 多为 T1 S0跃迁）；发射波长为 3 的磷光； 10-4100 s 。,电子由 S0 进入 T1 的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁） S0 激发振动弛豫内转换系间窜越振动弛豫T1 发光速度很慢，光照停止后，可持续一段时间。 磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到，因此磷光很少应用于分析,由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1 ；,17,荧光产生的过程：（1）处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；（2）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过无辐射跃迁降落到第一电子激发态的最低振动能级；（3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光：（4）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级,18,荧光光谱 固定激发光波长物质发射的荧光强度与发射光波长关系曲线，如右图中曲线II。 荧光本身则是由电子在两能级间不发生自旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。磷光光谱 固定激发光波长物质发射的磷光强度与发射光波长关系曲线，如右图中曲线III。 磷光本身则是由电子在两能级间发生自旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。,荧光光谱与磷光光谱,19,光谱图,20,激发光谱 固定发射波长(一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位)，扫描出的化合物的发射光强度(荧光/磷光) 与入射光波长的关系曲线。,二、主要光谱参量,发射光谱 固定激发波长(一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位)，扫描出的化合物的发射光强度(荧光/磷光) 与入射光波长的关系曲线。,吸收光谱 化合物的吸收光强度与入射光波长的关系曲线 。,21,主要光谱参量,吸收光谱反映出的是物质的基态能级与激发态能级之间所有的允许跃迁。 通常状态下的物质的表观颜色大部分时候取决于其吸收特性。,激发光谱则反映的是基态与所有与该荧光发射有关的能级之间的跃迁。其所呈现的关系比吸收光谱要有选择性，但有时候又不如吸收光谱来的直接。,22,激发光谱与发射光谱的关系,a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。荧光的波长总是大于激发光的波长。这是由于发射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2 , 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 2 )。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。,23,产生斯托克位移的主要原因：,1.跃迁到激发态高振动能级的激发态分子，首先以更快的速率发生振动弛豫（其速率在1013/s数量级），散失部分能量，达到零振动能级，一般从零振动能级发射荧光；2.激发态形成后，其分子的构型将很快进一步调整，以达到激发态的稳定构型，这又损失了部分能量；3.发射荧光的激发态多为（，*）态，这种激发态较基态时有更大的极性，因此将在更大程度上为极性溶剂所稳定，使激发态的能量进一步降低。,斯托克位移,24,关于激发光的波长1：决定荧光物质是否能够产生吸收并发射出荧光；能够使荧光物质产生吸收并发射出荧光的激发光的波长并不具有唯一性；在保证激发的前提下，不同激发波长处的荧光发射光谱相同，但荧光强度不同。在进行荧光测定时，须选择激发光波长以保证荧光强度最大。,25,荧光发射是光吸收的逆过程。荧光发射光谱与吸收光谱有类似镜影的关系。但当激发态的构型与基态的构型相差很大时，荧光发射光谱将明显不同于该化合物的吸收光谱。,镜像规则,26,镜像规则的解释,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,基态上的零振动能级与第一激发态的零振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。,27,三、荧光的产生与分子结构的关系,1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。,28,1.化合物的结构与荧光,（1）跃迁类型：* 的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。,（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。,29,30,物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（）表示：与失活过程的速率常数k有关： 凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。,2 荧光量子产率,31,四、影响荧光强度的外部因素,1.溶剂的影响 溶剂极性增加，有时会使荧光强度增加，荧光波长红移。 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。 含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱，磷光增强。 溶剂粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上升，荧光强度下降。,32,2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0以下，温度每降低10， f增加3，在80时， f为1。,33,3 pH值的影响 含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生变化。,34,4.内滤光作用和自吸现象,自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。,内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；,35,5.荧光熄灭剂,荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenching medium)。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。,36,6、散射光,小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。,瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。,拉曼光：光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或稍短的光。,散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长,37,a:320nm或350nm为激发光，荧光峰总是在448nm。 b:将空白溶剂分别在320nm及350nm激发光照射下测定荧光，激发光波长为320nm时，拉曼光波长是360nm，360nm的拉曼光对荧光无影响；当激发光波长为350nm时，拉曼光波长是400nm，400nm的拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。,硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱,38,荧光光谱仪的原理、操作及数据处理,39,荧光光谱仪的基本原理,特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。,40,光源： 高压氙灯发出的光线强度大，而且是连续光谱，通用性较好，但氙弧灯热效应大，稳定性较差，对电压稳定性要求较高。 高功率连续可调激光光源是一种新型荧光激发光源。激光的单色性好、强度大。激光光源近年来应用日益普遍。,41,单色器： 第一单色器选择激发光波长1 （250nm的紫外光），称为激发单色器。 第二单色器选择(测量)发射光（荧光）波长2 ，与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。样品池： 采用低荧光材料，通常为四面透光的石英池。检测器： 光电倍增管。,42,液体,样品准备,1. 溶液样品尽量使用透明的玻璃化溶液，避免在这种汇聚式光路中由于比色皿中溶液的前后吸收不均导致的光谱失真问题。 2. 为安全起见，对于使用挥发性剧毒溶剂的测试，一定要有合适的防护。 3. 易挥发、易变质的溶液最好现配现测。4. 液体样品一般放在带盖石英比色皿（与紫外测试所用比色皿不同，为侧面全透明型）中进行测试。,43,测试准备,由于物质的发射特性和吸收特性是紧密相关的，所以提前做好吸收谱可以有效缩短荧光测试的摸索时间。,对于不知道相关特性的样品，吸收谱的测试比荧光光谱的测试要容易很多。,所以，建议大家先测一下样品的吸收谱，并从中找出感兴趣的吸收峰和特性，在荧光测试时以便参考。,44,光谱测试,开机 电源灯源,2.荧光光谱 固定激发光的波长，选择合适的荧光光谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等测量不同荧光波长处荧光的强度，得到荧光光谱，即荧光强度荧光波长图。,3.激发光谱 在荧光最强的波长处固定荧光波长，选择合适的激发光谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，得到荧光激发光谱。即荧光强度-激发光波长图。,45,4.荧光光谱 在荧光最强的波长处固定激发波长，选择合适的荧光光谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行发射谱的扫描。,5.重复3、4步循环扫描得到理想的光谱图。,7.关机 光源电源,6.保存数据,光谱测试,激发波长一定要小于发射波长。,46,光路狭缝和扫描速度的选择,如果光路狭缝太大，荧光信号太强，容易超出仪器检测范围，损伤仪器；如果狭缝开的太小，荧光信号又太弱，检测比较困难，所以要选择大小合适的狭缝。,如果扫描太快，容易跳峰，忽略特征性的峰信号；扫描太慢则浪费时间。所以只要能扫描得到平滑的光谱曲线就可以了。,47,荧光光谱的应用,48,1.定量依据与方法,(1)定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc,49,（2）定量方法,标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；,50,2 、荧光光谱的应用,51,(1)无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析 见表,52,53,54,与蛋白质或其他大分子结构非共价相互作用而使一种或几种荧光性质发生改变的小分子物质。可用于研究大分子物质的性质和行为。,荧光探针,目前常用的荧光探针有荧光素类探针、无机离子荧光探针、荧光量子点、分子信标等。荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析外，在核酸染色、DNA电泳、核酸分子杂交、定量PCR技术以及DNA测序上都有着广泛的应用。,荧光探针：,55,荧光探针,过渡金属配合物很多能实现较强的红外波段宽带发射，可以有效避开组织体的吸收，可以穿透组织体实现红外成像，克服同位素原子示踪对人体的伤害；寿命处于s 量级，可以用于较大分子的形变和转动扩散研究，当然，结合其特有的发射波段也能对活体环境中的许多扩散和转变过程进行研究。,56,稀土离子是一类核酸探针的检测试剂。在水溶液中仅有Tb()和Eu()发出荧光，与DNA配合后仍保留荧光性能，可特异识别核苷酸。Tb()和Eu()与一些小分子配体配合，由于配体本身性质、中心离子-配体成键及溶剂等因素影响，使配合物的激发态寿命达到ms 级，并发出窄而强的荧光。Tb()和Eu()与小分子的配合物探针通过共价键与靶DNA 共价结合后多用于实时定量荧光PCR 反应产物的分析及杂交测试。,该类探针要求稀土配合物易于合成并且足够稳定，同时荧光发射强度大。Nurmi 等用Tb()和Eu()标记的探针进行实时同步扩增及前列腺特异抗原的测定，信噪比要高于传统的TaqMan 探针，而循环阈值则降低。,荧光探针,57,量子点荧光探针是由-族和-族元素组成的半导体纳米颗粒，将核酸连接到量子点的表面，做成探针，通过体外杂交常规荧光(FISH)分析，发现染色体的异常及变异，可取代一些有机荧光染料进行生物分子检测。研究较多的有CdSe、CdTe、ZnS 等。,荧光探针,58,量子点探针较传统的有机荧光染料具有一定的优越性：首先，荧光光谱范围宽，通过改变纳米晶体材料和尺寸，获得的激光诱导荧光光谱范围在400nm2m；其次，荧光光谱范围可调，稳定性好，荧光寿命长，且可用单一波长的激发光源同时激发不同大小尺寸的量子点，得到不同荧光发射波长的检测信号，相对于有机荧光染料的单一光源激发得到单一荧光发射信号，降低了实验成本并简化了分析步骤。,荧光探针,总之，量子点荧光探针用于生物荧光标记，是一个具有广阔应用前景的领域。,59,利用荧光探针来研究高分子的链结构及高分子材料物化参数通过荧光探针来研究高分子光化学与光物理问题通过荧光探针研究高分子体系的聚合反应过程利用荧光探针研究特殊环境的物理化学性质荧光探针法测定胶束，囊胞等特殊环境的微极性和微黏度荧光探针法测定胶束的聚集数荧光探针研究高分子溶液的Sol-Gel过程和凝胶化点的测定参考书目：高分子光化学导论基础和应用 吴世康著 科学出版社 2019-10出版,荧光探针技术在高分子科学中的应用,60,问题,1.分子失活的途径有哪些？2.影响荧光的主要因素有哪些？3.荧光的应用有哪些方面？,谢谢,骑封篙尊慈榷灶琴村店矣垦桂乖新压胚奠倘擅寞侥蚀丽鉴晰溶廷箩侣郎虫林森-消化系统疾病的症状体征与检查林森-消化系统疾病的症状体征与检查,骑封篙尊慈榷灶琴村店矣垦桂乖新压胚奠倘擅寞侥蚀丽鉴晰溶廷箩侣郎虫林森-消化系统疾病的症状体征与检查林森-消化系统疾病的症状体征与检查,