茶叶生物技术第二章茶树细胞工程叶课件.ppt

第一章 茶树细胞工程,植物细胞工程（plant cell engineering）是生物技术中的重要分支，是指在植物细胞水平上进行的遗传操作，是现代遗传学、植物细胞生物学和分子生物学的一个复杂集合体。它是以生命科学为基础，利用生物体系和工程原理生产生物制品和创造新物种的综合性科学技术，是以植物组织培养和细胞的离体操作为基础的实验性很强的一门新兴学科。,第1节 细胞工程理论和技术基础,茶树细胞工程的应用主要有以下几个方面：（1）幼胚、胚珠和子房以及试管受精克服远缘杂交不育性（2）花药、花粉培养进行单倍体育种（3）原生质体融合产生体细胞杂种，扩大遗传变异范围（4）次生代谢产物生产（5）应用基因工程技术获得转基因植株，进行茶树品种改良（6）快速繁殖（7）种质资源保存,植物组织和器官培养,第一节 植物组织培养的一般概念 第二节 植物组织培养的发展 第三节 植物组织培养的应用,2022/12/1,4,第一节 植物组织培养的一般概念,2022/12/1,5,一、植物细胞组织培养的概念, 植物细胞组织培养（Plant Cell and Tissue Culture）：是指在离体（in vitro）条件下利用人工培养基（medium）对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其长成完整的植株。 通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。,2022/12/1,6,主要有:原生质体（Protoplast）培养悬浮细胞培养组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织）培养器官（胚，花药，子房，根和茎）培养其中最常见的是愈伤组织培养。,2022/12/1,7,（广义）又叫离体培养：指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。,（狭义）组织培养：指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。,植物细胞组织培养范畴：,2022/12/1,8,原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面上产生。,愈伤组织（callus）,2022/12/1,9,外植体（explant）：在植物细胞组织培养中，由活体（in vivo）植物体上取下来的，接种在培养基上无菌细胞、组织器官等用于离体培养的材料。,2022/12/1,10,二、植物组织培养的分类,固体培养,液体培养,1. 培养基,固体培养,液体培养,2022/12/1,11,培养基(Culture Medium) 培养基是植物组织培养的重要基质。 培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。,2022/12/1,12,培养基,（1）植物细胞的生长和代谢需要大量无机盐；（2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素；（3）植物细胞需求的氮源一般为无机氮源；（4）植物细胞一般以蔗糖为碳源、浓度为2-5%。,2022/12/1,国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基有： MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基、KM-8P培养基,2022/12/1,14,常用培养基简介1）MS培养基 1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。,2022/12/1,15,MS培养基配制方法,2022/12/1,16,不同营养条件对植物组织培养的影响,生长良好的愈伤组织,无蔗糖,蔗糖浓度只有1%,蔗糖浓度有5%,The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface,Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus愈伤组织.,Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured,Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium,相关知识,2022/12/1,17,No MS saltsNo sign of regeneration from explant at all.,MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shoots,MS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.,不同营养条件对植物组织培养的影响,2022/12/1,2）B5培养基 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。,2022/12/1,19,3）White培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。,2022/12/1,20,4）N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。,2022/12/1,21,配置方法：先配母液，按比例稀释、混合常见母液：不同稀释倍数大量元素母液微量元素母液铁盐母液维生素母液：维生素和某些氨基酸植物激素母液：吲哚乙酸、萘乙酸、苄基腺嘌呤,植物细胞培养基的配制,2022/12/1,22,三） 培养温度和pH等条件温度：适宜温度20-25，酶合成温度因植物种类而异 pH: 植物细胞培养要求稳定pH，一般pH5.8-6.1最好 植物细胞培养过程中pH变化不大溶氧、通气搅拌: 细胞比较大，较脆弱，对剪切力敏感，且耗氧速率较慢，所以通气和搅拌不要太强烈光照：对一些植物酶有诱导作用或抑制作用。 刺激物：在酶合成时期，适当添加。前体的添加：对一些植物酶有诱导作用。如苯丙氨酸刺激物：在酶合成时期，适当添加。微生物细胞碎片 细胞壁碎片、酵母葡聚糖、果胶酶、纤维素酶、,2022/12/1,1. 外植体的获取 2. 植物细胞培养基的选择：MS、B5、White、N6 3. 培养时温度控制：25 左右，20-30 4. 培养时pH控制：5-6，培养基pH为5.5-5.8 5. 溶氧控制：适当通风，但植物细胞需氧不多 6. 搅拌速度控制：植物细胞体积大，较脆弱 7. 光照控制：光照波长、强度、时间均有影响 8. 前体添加：无机离子、真菌提取物 9. 刺激剂的应用：细胞壁碎片、果胶酶、纤维素酶,植物细胞培养工艺,2022/12/1,二、植物组织培养的分类,植株培养器官培养组织培养细胞培养原生质体培养,2、组织培养按培养对象可分为 （外植体）,2022/12/1,25,1. 植株培养(plant culture)：对完整植株材料的培养。,种子苗培养,扦插苗培养,2022/12/1,26,2. 器官培养(organ culture): 即离体器官的培养。,器官培养,根系培养,茎段培养,花器培养,果实培养,种子培养,叶片培养,根据作用和需要的不同，可以包括分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养。,2022/12/1,27,3. 组织或愈伤组织培养(tissue，callus culture) ：是对植物体的各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株.,组织培养,分生组织培养,薄壁组织培养,输导组织培养,2022/12/1,28,4. 细胞培养(cell culture)：是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养.,细胞培养,看护培养,平板培养,悬浮培养,微室培养,2022/12/1,29,5. 原生质体培养(proplast culture)：是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。,原生质体培养,非融合培养,融合培养,2022/12/1,30,三、植物组织培养的生理依据,细胞全能性(cell totipotency)：植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。植物细胞的再生性是指在植物中很多是靠种子生长来产生完整的植株，但也有不少可通过根、茎、叶等器官再生而成为完整的植株的特性。,2022/12/1,31,三、植物组织培养的生理依据,植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、脱落酸、乙烯等生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强弱为2,4-DNAAIBAIAA。细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老，促进芽的产生等作用。常用的有Zip(异戊烯腺嘌呤)、KT、6-BA、ZT等作用强弱顺序为。ZipKT6-BAZT。赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。常用的为GA3。,2022/12/1,32,2022/12/1,33,植物生长调节物质,生长素细胞分裂素赤霉素乙烯,生长素赤霉素细胞分裂素脱落酸乙烯 -植物激素“五兄弟”,向光性：,在单侧光的照射下，植物朝向光源方向生长的现象。,生长素（auxin）的发现,胚芽鞘,1、19世纪末达尔文(C.R.Darwin)实验,实验材料：,胚芽鞘,光,图4,总结上述实验,达尔文提出:,胚芽鞘尖端受单侧光刺激后, 就向下面的伸长区传递影响，造成伸长区背光面比向光面生长快,因而使胚芽鞘出现向光弯曲。,2.1910年詹森（B.Jensen）的实验,结论：胚芽鞘的尖端产生的某种刺激可以透过琼脂片传递给下面一段。,黑暗中,1 2,b,a,3.1914年拜尔（Paal）的实验,去尖端， 把尖端放于胚芽鞘切面的左侧， 胚芽鞘向右侧弯曲生长。,去尖端， 把尖端放于胚芽鞘切面的右侧， 胚芽鞘向左侧弯曲生长。,结论：,胚芽鞘的弯曲生长，是因为尖端产生的影响在其下部分布不均匀造成的。,4、1928年（F.W.Went）温特的实验,朝对侧弯曲生长,不生长也不弯曲,结论：胚芽鞘的弯曲生长确实是一种化学物质引起的，并命名为生长素。,1934年从人尿分离出具有生长素效应的物质吲哚乙酸。1942年从高等植物中分离出生长素，并确认是IAA。在植物体内，具有促进植物生长的功能，除了吲哚乙酸（IAA）外，还有苯乙酸（PAA）和吲哚丁酸（IBA）。,生长素生理作用的应用,顶端优势植物的向光性根的向重力性（向地性）茎的背重力性（背地性）,解除顶端优势,顶端优势,顶端优势现象,顶端优势： 植物的顶芽优先生长，而侧芽生长受抑制的现象。,形成原因： 顶芽产生的生长素向下运输，大量地积累在侧芽部位，侧芽对生长素浓度又比较敏感，使侧芽的生长受到抑制。,重 力,促进,慢,抑制,快,茎的背地性和根的向地性生长,2,1,3,4,根：浓度21，茎：浓度43，,1处生长快，2处生长慢，向地生长,4处生长快，3处生长慢，背地生长,茎的背地性和根的向地性生长,在单侧光线照射下， 背光侧向光侧，背光侧细胞生长快,植物向光性,结果使茎朝向光源一侧弯曲,生长素类似物的应用,(1) 促进扦插的枝条生根,(2) 促进果实发育（培育无籽果实）,(3) 防止落花落果，疏花疏果,（4）用作除草剂,1、促进扦插枝条生根,用一定浓度的生长素类似物溶液浸泡插枝的下端后栽插。,传粉受精后，胚珠发育成种子的过程中产生大量生长素，促进子房发育成果实。,2、生长素促进果实发育（无籽果实）,如何培育无籽果实？,在没有接受花粉的雌蕊柱头上涂上一定浓度的生长素类似物，使子房正常发育为果实，因为没有受精，果实内没有种子。,3、 防止落花落果,农业生产上常用一定浓度的生长素类似物溶液喷洒棉株，可以达到保蕾保铃的效果。,4、杂草的除草剂,如(2，4-D)，适用于麦田、稻田，双子叶植物比单子叶植物对生长素更敏感，用高浓度的除草剂能抑制双子叶植物（杂草）的生长。,2022/12/1,55,生长素（auxin）,吲哚乙酸（IAA，天然），奈乙酸（NAA），二氯苯氧乙酸（2,4-D），吲哚丁酸（IBA），2,4,5-三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）。促进细胞分裂与根分化2,4-D有强烈的愈伤组织诱导能力，但抑制器官分化,2022/12/1,56,细胞分裂素（cytokinin）,激动素 （KT），6-苄基腺嘌呤（6-BA），玉米素 （ZT），异戊烯氨基嘌呤（ 2IP）刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高，抑制根的生长。 细胞分裂素常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。,细胞分裂素,合成部位,主要作用；促进细胞分裂,愈伤组织,2022/12/1,58,细胞分裂素与生长素相互作用,生长素与细胞分裂素的比例被称为“激素杠杆”，决定着发育的方向。当生长素含量高于细胞分裂素时，主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成当细胞分裂素的效应高于生长素时，主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成。,2022/12/1,59,生长素含量高于细胞分裂素,2,4-D 1mgL +6-BA 0.1mgL,2022/12/1,60,生长素含量低于细胞分裂素,2022/12/1,61,赤霉素（gibberelin acid）,GA3促进细胞生长刺激不定胚发育成正常小植株,1926年，水稻感染了赤霉菌,病苗细长，叶色淡绿，比健苗高，病株节间伸长，茎节上逆生不定根，茎杆逐渐变褐，腐烂，其内有白色蜘蛛丝状菌丝。,1935年科学家从培养基滤液中分离出赤霉素（GA）,将赤霉菌培养基的滤液喷洒到健康水稻幼苗上不感染赤霉菌，却有恶苗病的症状,对照,施用5g GA3后第7天,GA3诱导甘蓝茎的伸长 ，产生超长茎,GA3 对矮生型豌豆的效应,促进细胞伸长,促进种子萌发,主要作用,果实发育,2022/12/1,65,乙烯（ethylene）,对芽的诱导具有一定作用 在生理环境的温度和压力下，是一种气体，比空气轻，实验中很难掌握用量，所以一般不使用培养的植物组织也会产生乙烯，如果封口用的是不透气的塑料膜，容器内就会逐渐积累乙烯，严重时可引起培养物的死亡,未成熟的种子,幼根,幼芽,幼叶,合成部位,促进果实着色和成熟,乙烯在常温下是气体。作为生长调节剂用的是乙烯利。,植物细胞全能性（Cellular totipotency）： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 （Haberlandt, 1902）,四、植物组织培养的原理,2022/12/1,68,离体的植物器官、组织、细胞,脱分化,愈伤组织,再分化,根芽,植物体,2022/12/1,69,1.分化（differentiation）: 细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个体发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。,2022/12/1,70,2.脱分化(dedifferentiation): 在细胞组织培养中，一个成熟细胞或分化细胞转变恢复分生能力成为分生状态的过程，即形成愈伤组织的过程。3.再分化(redifferentiation): 植物的成熟细胞经历了脱分化后，即形成愈伤组织能再形成完整的植株，这一过程叫做再分化。,2022/12/1,71,切开胡萝卜，在圆圈处取一块组织P-木质部、C-形成层、X-韧皮部,操作步骤,2022/12/1,形成层开始形成愈伤组织C1-愈伤组织、C2-形成层,操作步骤,2022/12/1,3-4周后完全形成愈伤组织状态（脱分化）组织块失去色素,操作步骤,2022/12/1,把脱分化后的愈伤组织转移到培养基上,操作步骤,2022/12/1,两周左右开始再分化，长出幼苗,操作步骤,2022/12/1,将幼苗移植到外部条件下培养（顺化）,操作步骤,2022/12/1,顺化一个月后的胡萝卜植株,五、操作步骤,2022/12/1,2022/12/1,79,5.初代培养：,芽、茎段、叶片、花、器官等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程,2022/12/1,80,6.继代培养： 更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织、芽）。,2022/12/1,81,7.生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程。,2022/12/1,82,8.驯化移栽：组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使之适应露地或保护地条件的过程。,2022/12/1,83,组织培养技术的蓬勃发展只是近五十年的事，但它的整个历史可以追溯至十九世纪末和上世纪初。,第二节 植物细胞组织培养发展简史,2022/12/1,84,第二节 植物组织培养发展简史,植物组织培养与细胞培养开始于19世纪后半叶，当时植物细胞全能性的概念还没有完全确定，但基于对自然状态下某些植物可以通过无性繁殖产生后代的观察，人们便产生了这样一种想法即能否将植物体的一部分在适当的条件下培养成一个完整的植物体，为此许多植物科学工作者开始了培养植物组织的尝试。,2022/12/1,85,第二节 植物组织培养发展简史,上世纪三十年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说： 细胞是有机体， 一切动植物都是由单细胞发育而来， 即生物是由细胞和细胞的产物所组成； 所有细胞在结构和组成上基本相似； 新细胞是由已存在的细胞分裂而来； 生物的疾病是因为其细胞机能失常。 根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。 对组织培养技术的诞生起到了极大的推动作用。,2022/12/1,86,第二节 植物组织培养发展简史,植物组织培养发展简史可划分为三个阶段：,一、探索阶段,二、奠基阶段,三、迅速发展阶段,2022/12/1,87,第二节 植物组织培养发展简史,一、探索阶段（上世纪初至上世纪30年代中） 1902年德国著名的植物生理学家和植物学家哈伯兰特（Haberlandt） 在Schleiden和Schwann的细胞学说的推动下，提出了高等植物细胞全能性理论。它是植物组织培养的理论依据，对植物组织培养的发展起了先导作用。 植物细胞全能性的理论：即植物的体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力。,2022/12/1,88,第二节 植物组织培养发展简史,二、奠基阶段（30年代中至50年代末） 1934年美国的怀特（White）由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后28年间培养了1600代。 之后，White又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气、pH值、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基，其成分均为已知化合物，包括3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名为White培养基。,2022/12/1,89,第二节 植物组织培养发展简史,与此同时，高特里特（Gautheret） (1934)在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义，并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织， 诺比考特（Nobecourt）由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。,2022/12/1,90,因此，Gautheret，White和Nobecourt一起被誉为组织培养学科的奠基人。我们现在所用的培养方法和培养基，基本上都是由这三位科学家建立的。他们三人的贡献在于：一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素是一种天然的生长调节物质。后来，White于1943年发表了植物组织培养手册专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。,第二节 植物组织培养发展简史,2022/12/1,91,第二节 植物组织培养发展简史,40年代斯库克（Skoog）和崔澂在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素(IAA)对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。即细胞分裂素与生长素比例高时，产生芽；这一比例低时，则形成根；相等则不分化，形成愈伤组织。 器官分化的植物激素控制理论,2022/12/1,92,第二节 植物组织培养发展简史,50年代开始以后，组织培养研究日趋繁荣，10年当中引人注目的进展主要有7项：,1952年，莫雷尔（Morel）和马丁（Martin）通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株；,2022/12/1,93,第二节 植物组织培养发展简史,五十年代缪尔把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂，即实施了看护接种技术，使单细胞培养获得初步成功。米勒等人发现了激动素。不久即知道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加三万倍。,2022/12/1,94,第二节 植物组织培养发展简史,1957年，Skoog和Miller提出植物激素控制器官形成的概念；上述控制器官分化的激素模式变为激动素与生长素的比例关系。这方面的成功发现，有力地推动了植物组织培养的发展。,2022/12/1,95,第二节 植物组织培养发展简史,1958年，美国植物学家斯图尔德（Steward）等人，用胡萝卜根韧皮部的细胞进行培养，得到了完整植株，并且这一植株能够开花结实，首次证实了Haberlandt在五十多年前关于细胞全能性的预言；1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素CTK可促成在顶芽存在的情况下打破腋芽的休眠后来，Murashige利用这一方法发展了快繁技术，广泛的应用于植物的快速繁殖。,2022/12/1,96,第二节 植物组织培养发展简史,综上所述，在这一发展阶段中，通过对培养条件和培养基成分的广泛研究，特别是对B族维生素、生长素和细胞分裂素在组织培养中作用的研究，已经实现了对离体细胞生长和分化的控制，从而初步确立了组织培养的技术体系，为以后的发展奠定了基础。,2022/12/1,97,第二节 植物组织培养发展简史,三、迅速发展阶段科金开创植物原生质体培养和体细胞杂交研究工作。（用真菌纤维素酶从番茄幼根分离得到活性原生质体）；同年植物试管受精首次成功。博尔提出了一个茎尖离体无性繁殖兰花的方法迅速建立起兰花工业；,名贵兰花春日飘香,2022/12/1,98,第二节 植物组织培养发展简史,1962年，Murashige和Skoog发表了促进烟草组织快速生长的培养基组成MS培养基；1964年印度固哈（Guha）和马海舒瓦瑞（Maheshwari）成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，从而促进了花药和花粉培养的研究；以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物培养中获得成功，其数目达到160多种，其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引入注目的成就。,2022/12/1,99,第二节 植物组织培养发展简史,1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。80年代中期以来，对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷，在这方面中国学者做出了重要贡献。,1973年Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体融合，获得了第一个体细胞杂种，Cocking等倡导的原生质体培养和体细胞杂交，研究得到了迅速发展，已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增殖分化生成杂种植株。,2022/12/1,100,第二节 植物组织培养发展简史,（1）微繁技术广泛应用,（2）花药培养取得显著成绩,（3）原生质体培养取得重大突破,概括起来，这一阶段的成就体现在：,（4）基础研究,2022/12/1,101,第二节 植物组织培养发展简史,在整个植物组织培养发展的历史中，我国学者做出多方面的贡献，除了前述的崔徵的研究成效以外，还有李继侗和沈同研究银杏的胚培养，将银杏胚乳的提取物加入培养基，获得成功；李继侗等关于玉米等植物离体根尖培养的研究工作，以及罗士韦关于幼胚和茎尖培养，李正理关于离体胚的研究培养、王伏雄等关于幼胚的研究培养工作。,2022/12/1,102,第三节 植物组织培养的应用,植物组织培养成为生物科学的一个广阔领域，除了在基础理论的研究上占有重要地位以外，还在农业生产中也得到越来越广泛的应用。,2022/12/1,103,第三节 植物组织培养的应用,一、农业上的应用1. 快速繁殖种苗(rapid propagation) 用组织培养的方法进行快速繁殖是生产上最有潜力的应用，包括花卉观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株兰花一年繁殖到400万株。,2022/12/1,104,母株（完整）外植体（母株的一小部分，种子亦可）接种到培养基上长芽（继代增殖）长根（试管外生根亦可）练苗，驯化完整植株,微（快）繁步骤（micropropagation）,2022/12/1,105,第三节 植物组织培养的应用,快速繁殖可用下列手段进行：1.通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽；2.通过根、叶等器官直接诱导产生不定芽；3.通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。,2022/12/1,106,试管快速繁殖应用在下列生产或研究中：(1)繁殖杂交育种中得到的少量杂交种，以及保存自交系、不育系等。(2)繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗。(3)繁殖生产上急需的或种源较少的种苗。 由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。,第三节 植物组织培养的应用,2022/12/1,107,2.无病毒苗(virus free)的培养 植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖，若蒙受病毒病，代代相传，越染越重，甚至会造成极严重的后果。 由于病毒是通过维管束传导的，因此利用尚未分化维管束的茎尖或其他分生组织进行离体培养，就有可能获得脱病毒的试管苗，这样就可以使种植的作物不会或极少发生病毒病。茶树主要以真菌病害为主，很少感染病毒性病害。,第三节 植物组织培养的应用,2022/12/1,108,第三节 植物组织培养的应用,自从Morel l952年发现采用微茎尖培养方法可得到无病毒苗后，微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。若再与热处理相结合，则可提高脱毒培养的效果。对于木本植物，茎尖培养得到的植株难以发根生长，则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗。,2022/12/1,109,第三节 植物组织培养的应用,3.利用细胞工程技术生产茶树次生代谢产物的研究近几年来，研究比较多的为茶多酚和氨基酸的合成。茶多酚类物质不仅是赋于成品茶品质风格的关键物质，而且在医药保健、食品工业等方面也具有重要的应用价值。 黄皓、夏涛等采用正交试验，研究了不同摇床转速、装液量、接种量对茶叶悬浮细胞生长和儿茶素产率的影响，以及光照和蔗糖理化因子对茶树悬浮细胞培养中细胞生长、儿茶素累积的影响。,2022/12/1,110,第三节 植物组织培养的应用,成浩等多年来对茶树愈伤组织悬浮细胞培养中儿茶素的形成进行了一系列的研究，系统地研究了培养基中大量元素、微量元素和有机成分等对儿茶素形成的影响；通过改良培养基，使茶树细胞培养中形成的儿茶素总量提高至细胞干重的30%；同时，分析了不同品种来源的茶树细胞培养在儿茶素形成能力上的差异和细胞筛选的效果。,2022/12/1,111,第三节 植物组织培养的应用,Matsuurat等通过茶树愈伤组织培养生产茶氨酸，在 25暗培养条件下，在 MS+ BA 4.0 mg L-1 + IBA 2.0 mg L-1 的 BI 培养基上，加入 25 mmol L-1 乙酰胺，愈伤组织中茶氨酸含量可达223 mg g-1。钟俊辉等系统地分析了摇床转速、接种量、装液量和培养基主要成分对茶树细胞悬浮培养及茶氨酸生产的影响；提出了茶树悬浮细胞生产茶氨酸的最佳工艺，合成茶氨酸的含量最高达170 mg L-1。小林利彰等研究指出茶树幼茎在脱分化和再分化过程中，组织内氨基酸组成和含量的变化具有特异性，添加 10 mg L-1 吲哚乙酸诱导不定根，随分化率的提高谷氨酸含量下降，而茶氨酸含量急剧上升。,2022/12/1,112,3. 在育种上的应用(breeding) 植物组织培养技术为育种提供了许多手段和方法，使育种工 作在新的条件下更有效的进行。,第三节 植物组织培养的应用,1.倍性育种，缩短育种年限，杂种优势明显。,2.克服远缘杂交的不亲合性和不孕性（胚培养）,3.保存种质,2022/12/1,113,第三节 植物组织培养的应用,例如： 用花药培养单倍体植株； 用原生质体进行个体细胞杂交和基因转移； 用子房、胚和胚珠完成胚的试管发育和试管受精，以及种质资源的保存等等。,2022/12/1,114,4. 工厂化育苗(industrializing propagation) 近年来，组织培养育苗工厂化生产已作为一种新兴技术和生产手段，在园艺植物的生产领域蓬勃发展。,第三节 植物组织培养的应用,2022/12/1,115,第三节 植物组织培养的应用,（ 1 ）工厂化育苗含义：是指以植物组织培养为基础，将外植体接种在人工配制的培养基上，通过控制环境条件，使细胞脱分化、再分化成新的组织、器官，进而培育出与母株一样的批量幼苗的方法。例如：非洲紫罗兰组织培养育苗的工厂化生产。,（ 2 ）特点：繁殖快，整齐、一致，无病虫害，周期短，周年生产，性状稳定。,2022/12/1,116,第三节 植物组织培养的应用,（ 3 ）作用： 有利于繁殖系数低、杂合材料的快速繁殖 有利于有性繁殖优良性状易分离材料的繁殖 有利于保持从杂合的遗传群体中筛选出的表现型优异植株的优良遗传性。 组织培养育苗的无毒化生产，还可减少病害传播。 可以减少气候条件对幼苗繁殖的影响，缓和淡、旺季的供需矛盾。,2022/12/1,117,第三节 植物组织培养的应用,（ 4 ）现状： 世界上一些先进国家园艺植物组织培养技术的迅速发展从60年代就已经开始，并随着生长、分化规律性探索的逐步深化，到了70年代仅花卉业就已在兰花、百合、非洲菊、大岩桐、菊花、香石竹、矮牵牛等二十几种花卉幼苗生产上建立起大规模试管苗商品化生产。,到1984年世界花卉幼苗产业的生产总值已达20亿美元，其中美国花卉幼苗市场总值为6亿多美元，日本三友种苗公司有60的幼苗靠组织培养技术繁殖。1985年仅兰花一项，在美国注册的公司就有100余家，年销售额在1亿美元以上。,2022/12/1,118,第三节 植物组织培养的应用,我国采用快速繁殖技术，也使优良品种达到迅速的推广和应用。 如广东切花菊黄秀风的应用，使菊花变大，长势加强，花色鲜艳，抗病力增强，打开了进入香港市场的渠道，使30多种观叶植物的推广很快遍及全国，丰富了人们的生活，并将自然界的几百个野生金钱莲品种繁种驯化，培养了一批园林垂直绿化的材料，促进了园林业的发展。,2022/12/1,119,第三节 植物组织培养的应用,（ 5 ）制约：植物组织培养也存在一定的困难。首先是繁殖效率与商品需要量的矛盾，有些作物由于繁殖方法尚未解决，因而无法满足生产的需要。其次是在培养过程中如何减少变异株的发生。更重要的是应降低组培苗工厂化生产的成本，只有降低成本，才能更好的投产应用。 总之，随着组织培养这一技术的发展及各种培养方法的广泛应用，使这一技术在遗传育种、品种繁育等方面表现出了巨大的潜力，特别是生物工程和工厂化育苗实施以后，它将以新兴产业的面目在技术革命中发挥重大作用。,2022/12/1,120,要揭开生命活动的秘密，需要多科学、多技术的相互配合，其中植物组织培养技术是不可缺少的，它为遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物工程等提供了一种有效、快速的方法。,二、在遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、 胚胎学、基因工程、生物工程等方面的应用,第三节 植物组织培养的应用,2022/12/1,121,第三节 植物组织培养的应用,因为要揭示生命的奥秘，首先要研究单个基因的作用，研究它在细胞内是如何组装的，如何与其它基因发生联系，如何表达和调控等。分离单个基因，对它DNA进行测序，再对其中的某些碱基实行突变，然后还需要将基因送到受体细胞当中，看表达情况，以确定其功能。接受基因的受体细胞要产生再生植株，就需要通过组织培养的方法才能实现。,2022/12/1,122,中国的中草药是一份人类宝贵的财富，但很多种中草药资源匮乏，产量不足，甚至濒于灭绝。如果能利用组织和细胞培养的方法在实验室内生产，不再依附于自然环境，不仅可以解决现有困难，而且可以通过筛选高产有效成分的细胞系，来提高其药用价值。 比如用培养的人参悬浮细胞，来生产人参皂苷，已在日本等国家形成规模。利用培养的植物细胞和组织细胞作为生物反应器，也可以生产某些蛋白质、氨基酸、抗生素、疫苗等，如用生食蔬菜生产乙肝疫苗正在实验中。,三、 利用组织培养的材料作为植物生物反应器,2022/12/1,123,小结,植物组织培养是指在离体（in vitro）条件下利用人工培养基（medium）对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其长成完整的植株。 按照外植体的不同，组织培养可分为植株培养、组织培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。,2022/12/1,124,