第四讲柠檬酸发酵微生物及发酵机理课件.ppt

第四章 柠檬酸发酵微生物,及发酵机理,第一节 柠檬酸发酵生产菌种,柠檬酸是一种重要的代谢产物，同ATP一样是能量的标志性物质之一，在细胞代谢中位于三羧酸循环的起始点。几乎所有的微生物都活跃地合成柠檬酸，但由于代谢调节作用，在正常情况下大多数微生物累积的量不多。所以，并非所有能产生柠檬酸的微生物都可以作为柠檬酸发酵的生产菌种。 在工业生产上有价值的只有几种曲霉和几种酵母。,1893年首先发现某些青霉能分泌柠檬酸，但实践证明青霉并不适宜作为柠檬酸工业化生产的菌种。后来发现曲霉，特别是黑曲霉能分泌大量的柠檬酸。此外，棒曲霉、文氏曲霉、泡盛曲霉、芬曲霉等也能大量分泌柠檬酸。但是目前用于工业化的生产菌种几乎都是黑曲霉。 以石油、乙酸、乙醇等为原料时，一般是酵母作为柠檬酸的生产菌种。 至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法生产。而最具商品竞争优势的是采用黑曲霉、文氏曲霉和解脂假丝酵母等菌种的深层发酵法。,一. 黑曲霉,早在20世纪30年代我国老一代科学家就开始了柠檬酸生产菌 黑曲霉的选育和发酵技术的研究。我国现有菌种适应性强，生产经验丰富，深层发酵柠檬酸技术目前居世界前列。 我国柠檬酸生产以发酵状态可分为:深层 浅盘 固体 ； 以原料可分为:糖蜜 、淀粉水解糖 、葡萄糖母液、淀粉 、淀粉质原料。,黑曲霉形态特征(一)菌落与菌丝,1.察氏琼脂培养基上:室温培养10 14天，菌落直径达2.53cm，由致密或中度疏松的白色或微黄色菌丝组成;菌丝着生丰富密集的直立分生孢子梗。菌落为碳黑色或深褐色,反面为无色或中央呈淡黄色,有霉味。2.麦芽汁琼脂培养基上:菌落生长较快,室温下2周达5 6cm，平坦,密集遍布炭黑色孢子,反面无色或微黄,稍有霉味。分生孢子头典型地着生于较短的分生孢子枝上,成熟时呈柱状。,3.马铃薯汁葡萄糖琼脂培养基上:菌落有辐射状沟纹,中间炭黑色,四周新生的菌丝为白色,树枝状。 黑曲霉形态结构,(二)分生孢子头 幼时呈球形,渐变为放射形或裂成二瓣或多瓣,柱状,一般700800m,典型大的呈黑色,小而不典型的呈褐色,近球形,较大的不全部着色.,(三)分生孢子梗 自基质生出,长短,大小可变,一般为(1.53m)(1520m),壁光滑,较厚,无色或有淡褐色阴区,尤其是在上半部分。(四)顶囊 球形或近球形,直径一般为(4575m),常有较小者,偶尔也有80m的较大者。,(五)小梗 双层,褐色,遍生.初生小梗随菌种和孢子头成熟度而变化,成熟时有的产生横隔,次生小梗较为均匀。(六)分生孢子 典型的成熟时呈球形,偶尔稍偏,不同菌株大小不同,呈褐色,壁较厚,不规则,粗糙呈现低度或中度突起或毛刺,不连续,表面看似乎排列明显的色条。,目前国内生产用的5016、3008和G23-4菌种的基本特征,5016菌株在察氏琼脂培养基上30培养菌落生长缓慢。在麦芽汁琼脂培养基上生长的菌落，直径为4-7cm，绒毛状，边缘不规则，长圆形，中间凸起，棕褐色至黑色，有棕色液滴，霉味，孢子稀疏。基质菌丝白色，表面菌丝白色，反面无色。分生孢子头全部由基质分出，棕褐色，球形。该菌适合于高浓度薯干粉直接发酵。,3008菌株在察氏琼脂培养基上菌落生长相当缓慢，28培养4-5天，直径仅仅1.5-2.0cm。在麦芽汁琼脂培养基上生长较快， 28培养7天直径可达4.5-5.0cm，分生孢子穗大量繁殖，颜色为炭黑至深褐黑色，无分泌液，反面无色。菌丝隔膜密。菌细胞短而粗，菌球体较小，该菌株更能适应高浓度发酵。,菌株G23-4系由r-144诱变获得。菌落为纯白色，孢子油集中在菌落中央，较细小，均匀，深棕色，菌落边缘的菌丝较长、疏松、呈羽绒状。,生活周期 黑曲霉属半知菌纲,一般只进行无性繁殖,由孢子发芽开始到新孢子形成、成熟,为一个生活周期.,孢子,发芽早期,菌丝迅速生长,由足细胞生出分生孢子梗,孢子梗顶端膨大,成为顶囊,初生小梗形成,初生小梗形成,孢子形成,初生小梗形成,黑 曲 霉 生 活 周 期,初生小梗形成,孢子在液体培养基中培养6-8h开始萌发出芽，长出多根芽，逐渐形成菌丝，菌丝不久即出现分枝。黑曲霉菌丝是多细胞结构，有横隔，其中可育细胞称为足细胞。由足细胞长出分生孢子梗，分生孢子梗顶端泡囊的聚集并与原生质膜的融合，使顶端膨大形成顶囊，上面遍生二层小梗。小梗上长出成链的孢子。这样一个生活周期约50个小时。但是黑曲霉菌丝是不断地生长延长的，孢子也逐渐不断地产生，直至营养枯竭为止。,培养基,国外黑曲霉柠檬酸生产菌的培养基,国内黑曲霉柠檬酸生产菌的培养基,二、解脂假丝酵母 1976年酵母出现在柠檬酸生产中，烃类是最佳碳源，所得柠檬酸产率最高可达14.3mg/ml。酵母的优越性 是它们的烷烃发酵产柠檬酸能力远强于黑曲霉，对烷烃转化率可达56%。主要菌种有：解脂假丝酵母、解脂腹膜胞酵母、季也蒙假丝酵母。,（一）解脂假丝酵母形态特征 在麦芽汁中25培养3d,细胞呈卵形至长卵形，在狭长或宽大的基部上出芽。可能存在假菌丝、真菌丝及节孢子。可形成菌噗，低部可形成菌体沉淀，于 17下培养1个月，则形成菌体沉淀和菌醭，不能发酵。 在麦芽汁琼脂培养基上17培养1个月,菌落呈奶油色,湿润或无光泽,柔软或粗糙,有微皱或粗皱.,在马铃薯或玉米粉琼脂载片培养时,可形成丰富的假菌丝和具有横隔的真菌丝.在真菌丝和假菌丝的顶端或中间,可见单个或成双的芽生孢子,有时还存在节孢子. （二）培养基 解脂假丝酵母生产柠檬酸的培养基如下表 ：,解脂假丝酵母生产柠檬酸的培养基 （g/L ）,第二节 黑曲霉柠檬酸高产菌的 形态特征和生理特征,(一)形态特征1.在麦芽汁培养基上菌丝白色,凸起,边缘整齐,菌落较小,带皱折.2.在察氏培养基上生长较慢,菌落边缘整齐,分生孢子梗短,分生孢子着生较密.,3.菌丝顶端着生稀疏的大型黑褐色孢子穗,成熟后呈开花状而崩裂.4.顶囊呈球形.5.小梗分两层,初生小梗和次生小梗区别明显，初生小梗（3031m）7 m，次生小梗（9 13）m 3.8 m .6.分生孢子串珠状着生,黑褐色,表面粗糙有明显的刺状突起，成熟后遇振动易散落.,(二)生理特征1.能耐高浓度柠檬酸（15%以上）,而不利用和分解柠檬酸。2.耐高浓度葡萄糖,能产生和分泌大量酸性-淀粉酶和酸性糖化酶。前者在pH2.0仍能保持原活力的80%以上，在pH2.5，40 下作用30min尚不失活。后者在柠檬酸发酵的条件下，当pH下降至2.0以下时，仍能保持大部分活力。3.能抗微量金属离子,尤其能抗较高浓度的Mn2+ 、Cu2+ 、 Zn2+ 。4.在深层液体发酵培养时,能形成大量的细小菌球体。,5.在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上,生长不好,生成小菌落,孢子形成能力弱.6.在生长繁殖期,细胞内具有较高水平的氨基酸、NH4+.7.菌丝体内含有低水平的甘油三酯和磷酸酯.8.细胞壁几丁质含量高,但-葡聚糖和聚半乳糖含量低.9.在生长和产酸期,细胞内蛋白质、核酸水平低.10.具有很强的侧系呼吸链活性,此侧系呼吸链不产生ATP.,第三节 黑曲霉柠檬酸生产菌的 选育及保藏,一、黑曲霉柠檬酸生产菌的选育,黑曲霉柠檬酸生产菌的选育,自然选育,诱变选育,:不经人工处理,利用菌种自身突变或直接从自然界中分离筛选的过程。,:通过诱变剂处理来提高菌种的突变频率,扩大变异幅度,从中选出具有优良性状的突变株,（一）黑曲霉柠檬酸生产菌的分离选育,分离筛选,收集相当数量的现有菌种,经分离纯化,挑选出合适的菌株。,采集大量含菌样品,分离筛选优良菌种。,若收集现有菌种则可直接活化、分离、纯化，并测定每个菌株的性能，从中选出最优良的菌株； 若是通过采集含菌样品来分离选育，可根据糖质发酵柠檬酸高产菌主要是黑曲霉，它们具有强大的分解淀粉、蛋白质、果胶、脂肪等物质的酶系特征，可从腐烂植物、水果表皮，也可从含有腐烂未熟水果的酸性土壤中分离。一般讲采集的含菌样品经过适当的增殖培养，或将样品浸出稀释液100mL和10%薯干粉、10%柠檬酸混合，在振荡摇床上于33-35下“富集”培养3-5天，然后进行分离筛选。,麦芽汁琼脂：适用于霉菌、酵母的分离米曲汁琼脂：适用于霉菌、酵母的分离马铃薯琼脂：适用于霉菌、酵母的分离察氏-多氏琼脂：适用于所有霉菌，能分离较多 的菌株酸性蔗糖琼脂：抑制不耐酸的霉菌，适用于耐酸的黑曲霉分离纯化酸性薯干粉平板：分离直接利用薯干粉的耐酸黑曲霉酸性淀粉平板：分离直接利用淀粉的耐酸黑曲霉酸性玉米粉平板：分离直接利用玉米粉的耐酸黑曲霉,1.分离筛选(纯化)培养基,2.分离筛选(纯化)方法,平板划线分离纯化培养 前两种方法不易一次就分离到纯的黑曲霉柠檬酸生产菌株，要反复进行数次。,稀释平板分离纯化培养,小滴分离纯化培养,分离筛选的主要原理是在平板上出现有单孢子形成的肉眼可见的单菌落中，挑选具有以下特征的菌落：（1）成熟时菌落中央稍隆起，出现绒毛状覆盖物者；（2）分生孢子梗短，分生孢子头大，圆形黑色，老熟时开花状；（3）次生小梗少，大部分不分枝； 可获得单孢子的纯柠檬酸生产菌株。,（1）平板划线分离纯化培养,用无菌吸管取上述“富集”培养液于盛有无菌水及玻璃珠的三角瓶中，置于摇瓶上振荡5分钟，使菌悬浮于水中，将接种环经火焰灭菌并冷却后沾一环上述悬浮液于已灭菌的麦芽汁加2%琼脂平板上，划线后，倒置于35-37保温箱中，培养40-44小时。挑取适当的单一菌落，移接到麦芽汁斜面试管培养基上，待检。,1-扇形划线法 2-分区划线法 3-方格划线法 4-连续划线法该法简单、快速、易行、理想的单菌落获得率较低。,取已经灭菌的装有9mL无菌水试管数支，做好标号，另用无菌吸管吸取上述玻璃珠振荡而制得的悬浮液少许，注入1号试管内，充分的摇匀，吸取此悬浮液1mL注入第二支试管中，以此类推，直至最后一支试管，每稀释一管，必须更换一支无菌吸管。再从最后2-3支无菌试管中吸取1mL倒入融化冷却至42-45的麦芽汁培养基中，充分摇匀，静置凝结成平板。倒置于恒温箱中，于3537 下培养4048h，挑取单个菌落，移接到斜面试管培养基中，待检。,（2）稀释平板分离纯化培养,该法简单、易行、分离的菌落较为均匀、单一，纯菌获得率大。,（3）小滴分离纯化培养（a）将待分离纯化的孢子悬浮液接入无菌水中，经多次稀释至1500个活孢子/ml，用校正口径的滴管吸取并滴布在无菌的盖玻片上，把盖玻片小心翻转扣在凹形载玻片的空穴上，穴内加一滴已灭过菌的培养液，盖片与载玻片之间用凡士林密封。 小滴分离培养,在显微镜下检查每个小滴，记下只有一个孢子的小滴位置，把它们置于33 恒温箱内培养25d，挑选出单菌落，于斜面试管培养基上。,该方法操作要细、要严，易分离到单细胞的纯菌株,（b）取与培养皿内径大小相同的滤纸34层，浸泡在溴甲酚绿的培养液中，取出，放在培养皿内，盖好皿盖，一起灭菌。吸取上述稀释好的悬浮液，点布在滤纸上，每皿平均点2025滴，每滴约出现10个菌落。置于33 恒温箱内培养25d，挑选出单菌落，于斜面试管培养基上。,3.摇瓶筛选与性能测定,摇瓶筛选,挑出单一菌落,麦芽汁琼脂斜面,培养6-7d,33,分别接入三角瓶,摇瓶发酵(初筛,复筛),筛选出产柠檬酸高、糖转化率高、产酸稳定性强的菌株,性能测定,抽取发酵液1ml,NaOH滴定酸度,0.1mol/L,纸层析,草酸定性检验,高效液相色谱分析仪,产酸高,测定柠檬酸产量,（二）柠檬酸生产菌的诱变育种,诱变育种是以强烈因子(物理及化学)处理微生物细胞群体(或孢子),促使微生物细胞中遗传物质(主要是DNA)结构发生变化,引起诱发突变,进而设法从大量变异群体中筛选出优良突变株的过程. 诱变育种具有速度快、收效大、方法简单等特点，是柠檬酸生产育种常采用的一种方法。,突变,点突变,染色体突变,碱基对置换,码组错位,染色体结构变化,染色体数目变化,凡是能提高菌种突变率的物质称为诱变剂，按其性质来分有：物理诱变剂、化学诱变剂、以及生物诱变剂三大类。 化学诱变剂种类很多，其中不少化合物能诱发高产酸菌株，效果明显，使用最普遍的是烷化剂。化学诱变剂一般都有毒，而且很多还有致癌作用，使用时必须注意，不能直接口吸，要避免与皮肤直接接触。,常 用 诱 变 剂 及 其 类 别,物理诱变剂,生物诱变剂,ICR是美国抗癌研究所合成的吖啶类氮芥衍生物 。,物理诱变剂和化学诱变剂的主要效应,各种化学诱变剂常用浓度、处理时间等参考资料,1.高产柠檬酸产生菌诱变育种的步骤和方法,出发菌株(根据要求认真选择),孢子悬浮液,“浓缩”过滤培养,麦芽汁平板分离,斜面培养,摇瓶初筛,斜面培养,摇瓶复筛,斜面培养,纯化,复壮,传代试验(共传10代),生产条件试验,扩大生产试验,新菌株鉴定(定名,推广),玻璃珠打散,化学诱变剂处理,稀释,挑出突变菌珠,(每瓶突变株平行做3瓶),(每瓶突变株3瓶),高产柠檬酸产生菌诱变育种注意事项：出发菌株的选择：一般选择具有一定的产酸能力但缺陷较多的菌株为出发菌株，出发菌株通常需要预先进行单菌落分离纯化，得到“纯种”斜面，若菌种不纯，将难获得预期效果。孢子悬浮掖的制备：因变异是发生在核中的DNA上，若一个细胞中含有许多核或许多细胞聚集成团，那么经诱变处理后，同一个菌落中就可能含有发生变异的，和不发生变异的成分，不利于选育。因此一般采用分散的单核细胞或孢子。,不论采用何种诱变方法，柠檬酸产生菌的诱变都采用活化状态的分散孢子进行处理。具体操作为： 出发菌株孢子 麦芽汁斜面 培养78d长出孢子 洗下孢子 液体培养基孢子萌发 离心分离 洗涤从离心管中洗出孢子 转到小三角瓶打散孢子 过滤 单孢子悬浮液 菌丝断片和没有打散的孢子团,转接,35 37,生理盐水,转接,振荡培养45h,H6.0 Tris缓冲液,或磷酸盐缓冲液,同样缓冲液,玻璃珠振荡,宣纸,或脱脂棉,具体诱变处理方法：射线诱变处理：常用的射线源是放射性同位素60Co， 射线照射得到变异株较多，而且获得的遗传性状稳定，可长期用于生产，是改良柠檬酸生产菌种的高效方法。 射线处理剂量常用Gy（戈瑞）或致死率（%）表示，10-2Gy相当于在0时、98kPa压力下，能使1cm3空气产生2.082109个离子对的辐射剂量。辐射剂量与与菌种细胞（孢子）的致死率具有正向的对应关系。对于活化的孢子照射8001200Gy，相当于致死率为90.0%99.9%。,取柠檬酸产生菌的孢子悬浮液（含量10个/ml）20ml置于25ml比色管中，于60Co射线照射，剂量为8001200Gy，照射后的孢子悬浮液稀释成10-4，取0.1ml涂平板。采用的培养基为加富培养基，即在察氏-多氏培养基和酸性平板培养基中添加10g/L蛋白胨和酵母膏。,硫酸二乙酯诱变处理（孢子含量为1106个/ml) 将黑曲霉柠檬酸产生菌的孢子悬浮液（孢子含量为1106个/ml）4.5ml加入2%硫酸二乙酯0.5ml于30下振荡处理5min，再加入75%的硫代硫酸钠10ml解毒10min或稀释10倍后涂平板。,亚硝基胍(NTG)诱变处理 取孢子悬浮液0.9ml，于37恒温水浴中预热5min，加入0.1ml浓度为2mg/ml的亚硝基胍溶液，在水浴中保温处理30min，取出后以3000r/min离心分离，弃去上清夜，用预先冷却的无菌生理盐水或缓冲液进行洗涤离心10次以上，最后用生理盐水恢复到原有体积后，进行平板分离。处理之后，凡接触过的物品都要用2mol/LNaOH液浸泡2d解毒，并用大量水冲洗。,高温诱变处理:将孢子悬浮液置于高温下处理，处理强度以致死率为基准，一般采用80%-95%的致死率，可采用85、15分钟，90、5分钟，100、1-2分钟，处理后进行稀释平板分离。,诱变处理的新方法：复合诱变、原生质体诱变处理。A、复合诱变：60Co-射线处理 高温处理 亚硝基胍处理等低剂量多次复合处理的方法。B、原生质体的诱变处理 采用蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶，先除去柠檬酸生产菌的细胞壁，再采用60Co-射线等诱变剂直接作用于原生质体上，可增加突变率，再通过原生质体的再生，获得优良性状的菌株。,(4)高产柠檬酸突变菌株的筛选,突变株的孢子悬浮液,在以柠檬酸钠为唯一碳源的合成培养基中“浓缩”培养，过滤出去菌丝,过滤液稀释（适当浓度）,指示剂显色平板,酸性薯干粉水解液平板,高柠檬酸高糖察式平板,高浓度Mn 2+, Zn2+等金属离子平板,葡萄糖为唯一碳源合成培养基平板,单氟乙酸平板,标记培养基:(培养34d),变色圈/菌落直径大者,迅速生长者,迅速生长者,生长者,不长或少长孢子者,敏感者,优良新菌株,挑选依据:,再结合菌体形态，及多次初筛、复筛,2.高产柠檬酸菌种选育实例,TD-01菌种的选育 TD01菌种是天津工业微生物研究所从采集148个土样中分离筛选出1220支单菌，产酸2以上的有88株。选择其中数株经多次60Co射线的诱变处理，获得以淀粉为原料的高产柠檬酸菌株，其诱变育种谱系如下：,TD-01菌株在2500L和4000L发酵罐中连续5批中试，平均产酸19.56，周期4天，转化率达97.28。,Co827菌种的选育,Co827菌种室上海工业微生物研究所，从土壤中经酸性平板分离获得的野生黑曲霉628作为出发菌株，经硫酸二乙酯和60Co射线等复合诱变获得的一株高产柠檬酸菌株。1982年用于工业化大生产。它可直接利用薯干粉发酵，产酸达13%以上。平均转化率为95%以上。其诱变谱系如下：,土壤 黑曲霉628,酸性平板分离,硫酸二乙酯处理,1.8%浓度硫酸二乙酯处理40min,麦芽汁富氮培养基平板分离,曲霉D147,60Co射线处理，加富平板及葡萄糖合成培养基平板分离,黑曲霉3008,黑,黑曲霉Co827,二、黑曲霉柠檬酸生产菌的保藏方法,保藏菌种一般出于两种情况，一是为了随时供生产用，要求菌种经常处于一定活化状态，通常保存的是斜面菌种；另一种是为了长期保存，要求菌种处于休眠状态，一般采用砂土管、石蜡封存法和真空冷冻干燥法。保藏目的：使菌种保持活力，不致绝种。保藏条件：干燥、低温、缺氧和缺乏养料等。 这种适合的休眠环境条件能使菌种代谢活动处于最低状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。,菌种保藏方法,斜面低温保藏法,载体吸附保藏法,砂土管保藏法,粒状活性炭保藏法,麸曲保藏法,真空冷冻干燥保藏法,液氮超低温（-196）保藏法,根据保藏要求以及黑曲霉柠檬酸生产菌的特点，黑曲霉的保藏方法主要有以下几种：,（一）斜面低温保藏法 此法是生产中最普遍采用的一种保藏方法。操作步骤： 菌种孢子移接于麦芽汁琼脂斜面后，于35下培养78天，待长满黑褐色孢子后，放在24冰箱中保藏，此法可保藏12个月。优点：简便易行，容易推广，存活率高。缺点：菌株仍具有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种容易发生变异和被污染。,（二）载体吸附保藏法 载体吸附保藏的原理是将菌种吸附固定在适当的载体上，进行干燥保藏，通常使用的载体有砂土、麸皮、谷粒或麦粒、硅胶、粒状活性炭、滤纸等。这些载体对菌种起着一定的保护作用。例：砂土管保藏法（1）砂土制备 不含腐殖质土壤 浸泡洗涤数次至中性 烘干碾碎 筛去粗粒,清水,筛孔为,0.18mm0.18mm,河砂 煮沸30min 倒掉酸水 冲洗至中性 烘干 筛去粗粒（2）无菌砂土管制备砂与土2:3混合 小试管 灭菌30min 冷却 保温过夜培养 再次灭菌 （3）1mL孢子悬浮液 砂土管 接种针搅匀包扎 干燥器 真空干燥8h 盛有P2O5的干燥器 24冰箱,10%稀盐酸,清水,40目或60目筛,0.15MPa蒸汽压力,（三）真空冷冻干燥保藏法 又称冻干法，它通常是用保护剂制备拟保藏柠檬酸产生菌的孢子悬浮液于安瓿（bu）管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水分升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌快。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保存。 在冷冻过程中，添加保护剂，是为避免孢子在冻结和干燥过程中死亡。黑曲霉孢子的保护剂一般采用牛、马、羊血清或者用脱脂牛奶加1%谷氨酸钠。,优点：利用有利于菌种保藏的一切因素，使黑曲霉柠檬酸产生菌的孢子始终处于低温、干燥、缺氧的条件下。保存期可达1年至10年之久。缺点：操作比较繁琐，技术要求较高，而且需要冻干机等设备。,（四）液氮超低温（-196）保藏法 该方法以甘油或二甲基亚砜为黑曲霉的保护剂，在液氮超低温（ -196）下保藏的方法。 -196远远低于微生物新陈代谢作用停止的温度（-131 ），此时菌种的代谢活动已经停止，化学作用也随之消失。 其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。,美国ATCC菌种保藏中心采用该方法作为常规保存方法，以1 /min的制冷速度将菌液从0直降到-35，然后保藏在-150-196 液氮冷箱中。 如果降温速度过快，由于细胞内自由水来不及渗出胞外，形成冰晶就会损伤细胞。 此法操作简便、高效、保藏期可达15年以上，是目前被公认的最有效的菌种长期保藏方法。,第四节 黑曲霉柠檬酸生产菌的纯化与复壮,柠檬酸生产菌种，在生产使用或保存的过程中可能因为稍有不慎，菌种被污染；因环境条件变化和自发突变，日积月累引起菌种生产性能的急剧衰退，造成生产不正常。 菌种退化，是一种可遗传的变异，由于基因突变、连续传代和采用不适宜的培养和保藏条件等引起的，使某种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。,柠檬酸菌种退化的病症主要有： (1)菌种在扩大培养时，生长微弱或过度旺盛，产孢子能力下降或丧失； (2)发酵培养基和操作条件确信无异常情况下，产酸能力普遍下降； (3)发酵液粘度升高，菌丝球形态、大小发生变化； (4)平板分离检查无杂菌，但菌落大小有差别或异常，甚至产孢子能力、孢子的颜色等也发生变化。,引起上述病症的原因有：,环境条件，如培养基成分不适，菌种保藏温度过高；移植菌株间歇时间过长，分离复壮时间间隔过长； 分离复壮效果差，以及杂菌的污染所致；连续传代次数过多，或者菌种有关基因发生自然突变或恢复突变，造成产酸能力下降。,一、黑曲霉柠檬酸生产菌的分纯,黑曲霉柠檬酸生产菌的分纯一般采用第三节介绍的平板划线、稀释涂布、小滴单孢子分离等分纯方法。主要原理：挑选出在平板上出现由单孢子形成的肉眼可见的，具有以下特征的菌落：（1）成熟时菌落中央稍隆起，出现绒毛状覆盖物者；（2)分生孢子梗短，分生孢子头大，圆形黑色，老熟时开花状；（3）次生小梗少，大部分不分枝。 可获得单孢子的纯柠檬酸生产菌株。,分纯目的：除去杂菌，淘汰退化菌株， 挑选高产优良菌株，供生产使用。 一般3-6个月进行一次，若生产不正常，随时进行菌种的纯化。,分纯方法：,1.酸性平板法（简便，能完全排除杂菌干 扰,得耐高浓度的柠檬酸,2.变色指示圈法,菌）,1、酸性平板法A、“富集”培养 将待分纯的菌株接入15%柠檬酸和10%的薯干粉培养基中，置振荡摇床上，于3537下培养，待长出菌落，挑到麦芽汁斜面上培养78天。B、涂平板 将需分纯菌株制成孢子悬浮液，适当稀释后，吸取0.1ml置于预先灭过菌的酸性薯干粉液化液的琼脂平板上，用刮棒摊平，于30 33下培养34d，挑取长出的菌落。 该法简便，能完全排除细菌、放线菌、酵母菌等杂菌的干扰，分离到较纯的耐较高浓度柠檬酸的黑曲霉。,2、变色指示圈法 需纯化的菌株制成孢子悬浮液，经适当稀释后，涂在含有0.04%的察氏-多氏琼脂培养基制成的平板上，于3033下培养。 由于产酸，菌落周围会出现黄色变色圈，在变色圈尚未连成一片时，测量变色圈与菌落直径之比，将比例大者，并具有高产柠檬酸形态特征的黑曲霉挑出来，移接于麦芽汁琼脂斜面上。 将分纯获得的菌株，经反复的摇床发酵试验，筛选出高产柠檬酸的菌株。,二、黑曲霉柠檬酸生产菌退化的预防和复壮,预防方法：1.采用新鲜斜面孢子（保藏时间不宜过长）2.减少传代（下图2-3-2） 生产中使用的菌种是人工变异的高产菌种，这些菌种常伴随着向野生型方向退化，而基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中，繁殖越频繁，复制的次数越多，基因发生变化的机会也就越多。因此尽量避免不必要的接种和传代，把传代次数控制在最低水平，以降低菌种的突变几率。 生产菌种的转接，每移植一代，最好同时移植多只斜面，以供一段时间生产之需。一般采用下图所示的方法。,3.定期分离纯化 定期分离纯化和实验的方法，淘汰保藏物中退化的部分和有可能污染的杂菌，确保常备的斜面孢子是无杂菌且保留有优良性能的孢子。,4.采用孢子传代 黑曲霉柠檬酸产生菌的菌丝细胞常含有许多核，甚至是异核体，用菌丝接种时就会出现衰退和不纯的子代，而孢子一般是单核的，采用孢子传代可防止退化。5.生产选育 在生产中若遇到特别优良发酵过程，一边分析原因，一边将菌丝体分离出来，经试验确认性能优良，甚至优于原菌种，可作为为备用菌种。,（二）黑曲霉柠檬酸生产菌退化的复壮 从菌种衰退的本质可以看出，通常在已衰退的菌种中存在有一定数量尚未衰退的个体。 从已衰退的菌种中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的方法是一种“狭义的复壮”，目前较提倡的是被称为“广义复壮”的一种积极措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取菌种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。复壮方法：1.营养成分引起退化的复壮 2.基因突变-向野生型退化的复壮 3.采用驯化-不经诱变处理的复壮,第五节 黑曲霉柠檬酸生产菌的扩大培养,菌种的扩大培养就是从少量的微生物原种开始，经过数代繁殖培养，为每次发酵提供相当数量的健壮的菌种培养物。 黑曲霉柠檬酸发酵的接种物是黑曲霉分生孢子，所以这一过程又称为干孢子生产。,国内柠檬酸发酵生产的菌种扩大培养普遍采用：,原种,斜面培养,三角瓶麸曲培养,直接接入发酵罐,种子罐培养,发酵罐发酵,一级,二级,三级,三角瓶麸曲孢子培养方式不适应大规模工业化生产发展方向，主要由于：（1）麸曲孢子需求量大，劳动强度大；（2）每批孢子质量不能保持稳定。 因此国外采用干孢子接种的先进方法。即将优良柠檬酸生产菌接种于培养基上，置于供给无菌空气、保湿、保温、密闭无菌的圆盘制曲机中进行培养，待长满成熟的黑褐色孢子，通入3540无菌空气干燥45h，在无菌条件下，收集孢子并分装于玻璃瓶内或塑料袋中密封，于510 干燥条件下储存。,影响种子质量的因素 （1）影响斜面种子质量因素：a.培养基； 黑曲霉在天然培养基上，发育快，着生孢子色深，但产柠檬酸不如合成培养基。 b.碳、氮源； 对于糖蜜发酵菌种来说，蔗糖最适宜着生孢子，麦芽糖次之，而葡萄糖和乳糖不太适宜；孢子着生受氮源影响显著，糖蜜发酵菌种，硫酸铵促使孢子增多，但含量超过1g/L时反而减少。c.培养条件与时间 采用蔗糖合成培养基，在不同培养条件下观察培养时间对孢子质量的影响：在酸性液体培养时以6d为佳，而固体培养以6-8d适宜。固体培养比纸培养或液体培养效果好，酸性固体培养效果更好。,（2）影响三角瓶麸曲质量因素： a.麸皮质量； b.水分； c.麸曲培养条件a 麸皮若霉烂、虫咬不但给灭菌带来困难，而且营养成分减少，不利于黑曲霉生长发育；麸皮若含淀粉和蛋白质过高，黑曲霉菌丝生长旺盛，但孢子着生减少；若麸皮过细，水分又过多，则麸皮松散度受影响，也不利于黑曲霉菌丝生长和孢子着生。b 麸曲水分过少容易形成干曲，影响黑曲霉菌丝生长；水分过大影响麸曲的松散度，同时麸曲培养时热量散发不出来，造成烧曲。c 要保持培养室一定的温度和湿度，并经常换气等。,（3）影响种子罐种子质量因素： a.种子培养基成分； b.通风量a 采用菌丝接种时，种子罐的种子培养基成分比较丰富为宜。b 目前厂家为了缩短种子培养时间，和各厂的设备条件的不同，一般采用自始自终为一个通风量。通风量大，能加速黑曲霉的生长、繁殖、可缩短培养时间。,第六节 柠檬酸发酵机制及代谢调控 柠檬酸合成是葡萄糖经EMP、HMP途径生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定反应生成草酰乙酸，草酰乙酸和乙酰CoA缩合成柠檬酸。 丙 乙酰COA葡萄糖 酮 柠檬酸 酸 草酰乙酸,EMP HMP,氧化脱羧,一、柠檬酸生物合成途径,CO2固定化,细胞的正常代谢途径都遵循细胞经济学原理并受调控系统的精确控制，中间产物一般不会超常积累。 因此，在三羧酸循环中，要使柠檬酸大量积累，就必须解决两个基本问题。第一，设法阻断代谢途径，即使柠檬酸不能继续代谢，实现积累；第二，代谢途径被阻断部位之后的产物，必须有适当的补充机制，满足代谢活动的最低要求，维持细胞生长，才能维持发酵持续进行。 柠檬酸的合成途径如下图所示：,在柠檬酸积累的条件下，TA循环已被阻断。因此，合成柠檬酸所需的草酰乙酸必须由另外的途径来提供。已知丙酮酸（PYR）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）均能经催化作用固定co2而形成草酰乙酸。 经证实，在黑曲霉产柠檬酸阶段主要是通过丙酮酸羧化酶的催化作用，使丙酮酸固定co2而形成草酰乙酸。,研究证明黑曲霉存在两种CO2固定系统，两种系统均需Mg2、K。 其一：丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作用下羧化，生成草酰乙酸。PYR + CO2 +ATP 草酰乙酸 + ADP +Pi其二：磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）在PEP羧化酶作用下羧化，生成草酰乙酸。PEP + CO2 + ADP +Pi 草酰乙酸 + ATP 这两种酶中，其中丙酮酸羧化酶对CO2 的固定作用更大。根据柠檬酸的合成途径，葡萄糖生成柠檬酸的总反应式如下：2C6H12O6 +3O2 2C6H8O7 + 4H2O,柠檬酸产生菌黑曲霉在生长期和产酸期都存在着EMP和HMP代谢。说明葡萄糖的降解是通过两条途径共同完成的。但是，在生长期EMP : HMP为2 : 1，而产酸期两者的比例为4:1，即产酸期有80的葡萄糖是通过EMP代谢的。这是因为在生长期还需要通过HMP提供合成核酸等所需的前体物质。 产酸期葡萄糖主要通过EMP途径降解，对柠檬酸的发酵生产是非常重要的。因为1mol葡萄糖经EMP降解可得到2mol丙酮酸，再经脱羧和CO2固定后，可使1mol葡萄糖合成1mol柠檬酸，这样就能获得较高的糖酸转化率。,柠檬酸生物合成的理想途径 由葡萄糖发酵柠檬酸的理想途径，即葡萄糖生成柠檬酸的碳平衡和能量代谢如图：,C6H12O6,EMP,途径,2C3H4O3,丙酮酸脱羧,CO2固定 C4C2缩合,C6H8O7,柠檬酸,丙酮酸,H2O,2ADP,2ATP,2H2,H2,9ADP,9ATP,3/2O2,3H2O,以上过程总反应式为：,理论转化率：106.7%,C6H8O7H2O理论转化率：116.7%,（一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节1、磷酸果糖激酶调节 正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶（PFK）有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。,二、柠檬酸生物合成的代谢调节,淀粉,葡萄糖,6-磷酸果糖,1，6-二磷酸果糖,磷酸丙糖,磷酸烯醇丙酮酸,丙酮酸,乙酰CoA,草酰乙酸,柠檬酸,CO2,CO2,CO2,NH4,+,Pi,K,+,AMP,ATP,2.Mn2+调节 比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉合成代谢的酶受损伤，这与柠檬酸的积累有关。 锰缺乏时，可导致细胞内NH4 浓度增高，并出现某些氨基酸的积累.因为Mn2+是催化核酸合成的酶所必需的。Mn2+ 的不足能影响某些蛋白质、核酸的合成，使NH4浓度升高，从而解除柠檬酸和ATP对PFK酶的抑制作用并使EMP代谢流畅通，丙酮酸和草酰乙酸水平升高，而使柠檬酸大量积累，这就是锰离子的调节效应。,3.丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。,4、丙酮酸羧化酶的调节 丙酮酸是真菌糖代谢的一个重要分叉点，丙酮酸既可以由丙酮酸脱氢酶催化脱羧生成乙酰CoA,也可以由丙酮酸羧化酶催化经CO2固定反应生成草酰乙酸，CO2固定强度对柠檬酸积累非常重要。保持丙酮酸这两个反应的平衡是获得柠檬酸高产率的一个重要条件。,（二）TCA循环的调节,1、TCA循环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点。 顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活。 黑曲霉线粒体中顺乌头酸酶在催化时，能建立下面的平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7，这个平衡可造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低，从而抑制顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶的活性，就抑制了柠檬酸自身的进一步分解。,2.第二个特点：黑曲霉菌体内-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低时，TCA循环在此被阻断。-酮戊二酸脱氢酶的合成被葡萄糖和NH4阻遏。-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆的反应。,磷酸烯醇丙糖酸,丙酮酸,乙酰CoA,苹果酸,草酰乙酸,柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸,-酮戊二酸,琥珀酸,富马酸,CO2,Fe,2+,CO2,CO2,抑制,-酮戊二酸脱氢酶系,3.氧对柠檬酸发酵的影响 乙酰CoA和草酰乙酸缩合生成柠檬酸过程中要引入一个氧原子，因此氧也可作为柠檬酸生物合成底物。而当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会影响酶的活性，从而导致柠檬酸产酸急剧下降。所以柠檬酸发酵过程中，特别是产酸期，一定要供给充足的氧，以提高柠檬酸产率。,TCA循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为：,（1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键（2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及其微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力。,（3）TCA循环的阻断微弱，导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。,柠檬酸的积累机制归纳：,Mn,抑制蛋白合成,NH4,解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径的畅通,有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链, 由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，就可以源源不断地提供草酰乙酸。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定反应取平衡，保证前体物乙酰CoA和草酰乙酸的提供，柠檬酸合成酶基本上不受调节，增强了合成柠檬酸的能力。,2+,缺乏,-酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏，使黑曲霉中的TCA循环变成“马蹄形”的代谢方式，减弱TCA循环，降低细胞内ATP浓度，另外使-酮戊二酸浓度升高。反过来，又反馈抑制异柠檬酸脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解； 由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7。顺乌头酸水合酶的作用总是总是趋向于合成柠檬酸。一旦柠檬酸浓度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进柠檬酸自身积累，pH降至2.0以下。顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸积累并排出体外。,习题,1、黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征是什么？2、菌种分离筛选（纯化）方法有哪几种？3、单孢子悬浮液制备操作过程？4、菌种保藏有哪两种情况？黑曲霉的保藏方法有哪几种？5、柠檬酸生产菌退化的病症和引起这些病症的原因是什么？6、柠檬酸的合成途径？7、柠檬酸的积累机制有哪些？,thanks,End,