第八章细菌和噬菌体的重组和连锁课件.ppt

第六章 细菌和噬菌体 的重组和连锁,真核生物基因分离、自由组合及连锁交换均通过有性过程（减数分裂受精）实现。细菌和病毒均属于原核生物不存在严格意义上的有性过程（拟有性过程）。但细菌细胞内除了染色体外还有一些寄生性复制因子(如噬菌体和质粒，也被称为核外或染色体外因子)，它们可以在细胞间传递，并且形成细菌染色体间以及细菌染色体与核外遗传因子间的重组体。这种重组体结构类似于真核生物减数分裂过程中形成的重组体结构。,第一节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位第二节 细菌的遗传分析*第三节 噬菌体的遗传分析,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,一、细菌二、噬菌体三、细菌和病毒是遗传研究的好材料,一、细菌,（一）、相关概念（二）、细菌的突变型（三）、突变型的筛选（四）、建立纯系的方法,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,1、细菌细胞 单细胞原核生物，细胞比较小（约1-2m长，0.5m宽），无核膜，无真正的细胞核，只在菌体中央有一个遗传物质集中区称拟核。 无性繁殖（裂殖法增殖），生长速度快，周期短，20分钟一个世代。易突变。 2、细菌染色体（1）结构: 单倍体，为环状裸露双链DNA(基因带或主染色体)，以折叠或螺旋状态存在；无蛋白质结合，也不形成核小体，所以其染色体的显著特点是：易于接受带有相同或不同物种的基因或DNA片段的插入。（2）大小：长约25-35000m(未螺旋)；（3）复制方式：着膜复制； 分裂特点：均等分裂，无基因重组。,(一)相关概念,一、细菌,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,细 菌 染 色 体 DNA 的 复 制从一个起点开始，向两个方向同时复制，当两个复制方向相遇时，复制就停止。,一、细菌,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,3、质粒： 1n个独立于染色体存在，并能独立自我复制和决定某些性状的环状DNA。附加体：有些质粒能整合到细菌染色体中，在染色体的控制下随染色体一起复制，这类质粒称为附加体。4、菌落： 单个微生物生长繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。,一、细菌,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,大 肠 杆 菌 E.coli,一、细菌,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,E.Coli 的 拟 核,一、细菌,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,1、合成代谢功能的突变型（营养突变型）:野生型（原养型）：具有合成所有代谢与生长所必须的复杂有机物的功能，可在基本培养基上生长。营养缺陷型：一个必需的基因发生了突变，丧失合成某种营养物质能力，不能在基本培养基上生长。 met 甲硫氨基酸缺陷型 met thi 维生素B1缺陷型 thi pur 嘌呤缺陷型 pur ,（二）细菌的突变型,一、细菌,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,2、分解代谢功能的突变型（碳源突变型）： 野生型细菌能利用复杂的不同碳源，也能把复杂分子如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间产物。这些降解功能称分解代谢功能。 一系列降解功能的实现也需要许多基因的表达，其中任何一个基因突变都会影响降解功能的实现。 突变体不能利用特定的物质或碳元素作为能量来源。 lac 乳糖突变型 lac gal 半乳糖突变型 gal ,一、细菌,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,3、抗药性突变型（抗生素抗性突变型）:敏感型：对某种药物缺乏耐受能力的类型（sensitive） 。抗性型：对某种药物有耐受能力的类型（resistance）。 青霉素: Penicillin penr, pens 链霉素：Streptomycin strr, strs4、抗噬菌体突变型： T1噬菌体 Tonr Tons T2噬菌体 Ttor Ttos,一、细菌,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,（三）突变型的筛选,1、选择培养法： 选择培养法是根据菌株在基本培养基和营养（补充）培养基上的生长表现将菌株分为原养型(也称为原生营养型)与营养缺陷型(在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长)。 其它突变类型的筛选、鉴定： 对于其它的突变类型(如温度敏感型)，也可以通过培养条件的选择培养来筛选与鉴定。,一、细菌,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,培养基的类型： 基本培养基：凡能满足某一菌种野生型菌株营养要求的最低成分的 组合培养基。完全培养基：在基本培养基中加入一些富含生长因子的物质，以满 足该菌种各种突变型的需要。补充培养基：在基本培养基中有针对性地加上某一种或几种其自身 不能合成的成分，以满足相应突变型生长需要的培养 基。,一、细菌,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,2、影印培养法：为高效检测、分离混和群体中不同突变型，黎德伯格夫妇设计了影印培养法；该方法原理与选择培养法一致，但是采用影印法将在完全培养基上单菌落同时接种到不同选择培养基上，同时对所有菌落进行选择培养，鉴定效率大大提高。,一、细菌,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,建立纯系的方法纯培养,纯系：由单个细胞繁殖而来的菌落称为纯系。菌种纯：采用平板表面涂布法或划线法获得单株菌落。这种方法获得的纯系，称为“菌种纯”。菌株纯：利用显微操纵器进行菌丝尖端切割等方法获得单个细胞，并直接培养建立纯系，这种方法获得的纯系称为“菌株纯”。,病毒根据宿主划分：植物病毒动物病毒 细菌病毒一般称为噬菌体.,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,噬菌体:指侵染细菌、放线菌以及真菌的病毒。噬菌体侵染细菌后在均匀生长的细菌培养板上形成噬菌斑（plaque）。单一核酸分子（DNA或RNA）称为基因带或染色体。大多数噬菌体含dsDNA 。,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,噬菌斑的形状,二、噬菌体,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,根据噬菌体与宿主细胞的相互关系，可分为：,（一）烈性噬菌体（virulent phage）：仅有裂解周期。侵入宿主细胞后，利用宿主细胞内的物质进行自身遗传物质和蛋白质的合成，组装出子噬菌体，使宿主细胞裂解而释放子噬菌体，这类噬菌体称为烈性噬菌体。 如T噬菌体系列（T1T7）（二）温和性噬菌体：既有裂解周期，又有溶原周期。 侵入后并不使细菌裂解，其DNA不整合到细菌的染色体上，而是以 质粒的形式独立存在于细胞质内。如P1噬菌体；某些噬菌体侵染细菌后，其DNA整合到宿主染色体中，这种处于整合状态的噬菌体称为原噬菌体。 如噬菌体。,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,T4噬菌体从大肠杆菌中释放,三、细菌和病毒是遗传研究的好材料,1、繁殖快, 世代短： 细菌20分钟一代，病毒一小时可繁殖百个。2、便于基因作用的研究：影印培养，可设计各种营养缺陷型，来对应基因的功能。3、便于研究基因突变：单倍体，所有的突变都能立即表现出来，没有显性掩盖隐性的问题，也不存在分离问题 。虽然突变率10-5, 至少需上百个培养皿，但只要培养基上加所希望突变的抗性物质，就有望短期鉴定出来。4、便于研究基因的精细结构：遗传物质简单，只含裸露DNA或RNA，容易受环境条件的影响而发生突变 。5、易管理和化学分析。 一个试管可装很多；易于获得大的数量用于分析。6、可用作研究高等生物的简单模型。高等生物复杂，可用细菌来代替某种研究。,第 一 节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位,第 二 节 细菌的遗传分析*,一、细菌的杂交二、F因子与接合三、高频重组与中断杂交技术四、F因子整合到细菌染色体的过程五、细菌基因的交换过程六、重组作图七、性导,一、细菌的杂交,（一）、质粒的种类（二）、质粒的性质（三）、细菌杂交的发现,第二节 细菌的遗传分析,质粒：细菌中除主染色体之外，能独立自我复制和决定某些性状的遗传单位。可随细胞分裂分配到子细胞中。（一）质粒的种类1、根据质粒在细菌间能否传递分二类：（1）感染性质粒：能从一个细菌体内转移到另一个细菌体内。（2）非感染性质粒：不能从一个细菌体内转移到另一个细菌体内。2、根据质粒存在的状态分：（1）自主复制型质粒：独立于宿主染色体之外。F因子（2）结合态质粒：能插入（整合）到主染色体上，并成为主染色体的一部分。当环境改变时，结合态质粒还能脱离主染色体成为自主复制型质粒。F因子。3、根据质粒的功能分：（1）致育质粒：决定细菌的交配状态。F因子（2）抗性质粒：决定细菌的抗药性，抗某些金属等属性。大肠杆菌中的R因子。（3）分解性质粒等。,1、复制作用：质粒为分子量较小的环状双链DNA分子，能够自我复制。2、与染色体的结合作用：质粒可以独立存在于细胞质中，也可以整合到主染色体上，成为染色体的一部分，这样的质粒特称为附加体。3、质粒的不亲和性：通常含有相同基因的质粒（具有相当程度同源性的两个 质粒）不能稳定地存在于一个细菌中，它们属于同一亲和群。属于不同亲 和群的质粒可以稳定地共存于同一细菌中，它们的DNA缺少同源性。4、消失作用：质粒在寄主细胞内，有时会自行消失。吖黄素处理可使F+变成F-。5、质粒移动性：可以在同种个体间移动（F因子），也可以在种间转移（R因子）。6、每个质粒的结构中都含有与自主复制有关的区域。可转移的质粒具有与转移有关的基因。,（二）质粒的性质,细菌菌株的命名,按照它们所短缺的、不能合成的物质来命名，取前面三个字母，右上角写上负号“-”，或正号“+”，负号代表缺陷型或突变型，正号代表野生型。如 菌株A met- bio- thr+ leu+ thi+ 菌株B met+ bio+ thr- leu- thi- 对抗生素敏感或抗性的品系，也取前面三个字母，不过在右上角写上s或r,代表敏感或抗性。 如 对链霉素敏感的写成strs,对链霉素抗性的写成strr。,1、Lederberg和Tatum（1946），大肠杆菌杂交实验 选用大肠杆菌K-12的两种不同营养缺陷型： A菌株： met - bio- thr+ leu+ thi+ ，甲硫氨酸、生物素缺陷型 B菌株： met+ bio+ thr - leu- thi- ，苏氨酸、亮氨酸、维生素B1缺陷型 方法：混合培养A和B菌株 在基本培养基上涂布培养 结果：平板上长出原养型（ met+bio+thr+leu+thi+）菌落。,塔特姆 （19091975）,莱德伯格（1925）,（三）细菌杂交的发现,细菌的接合试验,2、对上述实验结果的几种可能解释及其分析：,上述试验结果原养型菌落可能产生于：亲本细菌A或B发生了回复突变；亲本细菌A和B泄露了产物，混合后这些产物通过培养基交换，互相补充了对方的不足而得以在基本培养基上生长 互养作用；为了验证这些原养型菌落产生的可能而进行的研究最终表明：这些解释均不成立。,回复突变可能性的排除：,Lederberg和Tatum利用的双营养缺陷型菌株进行试验，已基本排除A或B品系发生回复突变产生原养型细菌的可能。 1、单基因回复突变的频率约为10-6； 2、2个基因同时回复突变的频率则为10-12，3个基因同时回复突变为10-18，频率很低。3、但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高，因此基本可以排除回复突变的可能。,互养作用及其排除：,戴维斯(Dawis, 1950)的U型管试验(结果没有得到原养型细菌，排除了互养作用。)；菌株A met bio- thr+ leu+ thi+ ， 菌株B met+ bio+ thr- leu- thi- 。实验结论：细胞直接接触（结合）是原养型细菌产生的必要条件。两菌株直接接触，发生了杂交，交换了遗传物质，产生与两个亲代菌株不同的野生型met+ bio+thr+ leu+ thi+ 菌株。,微孔滤板: 大分子(DNA)可通过，细菌不能通过。,第二节 细菌的遗传分析,二、 F因子与接合,接合的概念,接合(conjugation)：两种菌株的细胞直接接触后，遗传物质从供体(donor)转移到受体(receptor)的重组过程。,经过上述分析可以认为：在Lederbery和Tatum的试验中，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，称之为接合。,第二节 细菌的遗传分析,遗传物质从供体转移到受体是否为单向转移呢？,观点：细菌接合是同宗配合,海斯（W. Hayes，1953）做了一个杂交实验：链霉素处理的菌株杂交。链霉素：阻止细胞分裂，继而杀死细胞，但杀死前允许交配支持一段时间。 实验1：A菌株met thr+ leu+ thi+ （链霉素处理） B菌株met+ thr- leu- thi- （未处理） 基本培养基 出现菌落（B形成的菌落） 实验2：B菌株（链霉素处理） A菌株（未处理） 基本培养基 未出现菌落（A未形成菌落）,单向转移和F因子,第二节 细菌的遗传分析,认为：细菌接合是异宗配合,A品系在交配后被杀死并不影响杂交结果，表明它是一种供体，可以将遗传物质转移给受体B，而B未受链霉素处理，接受A的基因后，可以分裂并在基本培养基中形成菌落。 A像雄性动物一样，交配后被杀死，不会影响后代。B品系像是一种受体，其可以接受A的基因，但是B受链霉素处理后不能分裂，所以在培养基上不能形成菌落，同时可以看到，B没有遗传物质给A，A不能在基本培养基中生长。 B和雌性动物一样，受孕后被杀死的话，就无法产生后代。,F因子与接合,Hayes等进一步研究发现，细菌菌株之间的差异是由细胞内一种致育因子(fertility factor, F因子；sex factor, 性因子；致育因子)控制的。,F因子存在的状态：以大肠杆菌为例不含有F因子的细菌，记为F （雌性） ；含有F因子的细菌，F因子游离于宿主染色体外，记为F+ （雄性） ；,第二节 细菌的遗传分析,F因子：是可以转移的，能独立增殖的环状DNA分子，供体细胞含有F因子，记作F+。 F+的表面有称作性伞毛的细长纤毛，由此与F-接合。一旦F+与F- 接触后，性伞毛发生改变，成为两细胞间的原生质通道，称为结合管。F因子具有形成性伞毛的基因，因此F因子还可改变细胞表面的构造，以防止F+细菌间的接合。因此，接合只发生在F+与F-之间，而F+与F+间以及F-与F-间是不会发生的。,结合管的形成,F+ F- F+ ：低频重组 F因子转移频率很高（ 1小时后，95% F-F+），但和主染色体之间重组频率很低，重组频率为10-6左右。 接合管的形成：菌株靠近细胞膜融合两细胞间形成接合管 F因子转移：F因子从原点断裂，以原点为先导，边复制边转移（因此叫滚环复制），复制后的F因子转移到另一个细胞中。细胞分开，使F- 变成F+。,第二节 细菌的遗传分析,F+细菌通过纤毛与F- 细菌接触并发生相互作用形成接合管。,F因子出现缺口，双链之一从原点断裂，以原点为先导，从断端转移F因子的一条链到F- 细菌中。,在F+和F-细胞中，F因子边转移边进行两条链的复制（滚环复制）。,第二节 细菌的遗传分析,接合过程：,F因子通过接合管转移完毕，DNA的合成也完成。,接合管消失，细胞分开，F- 细菌变成 F+ 。,第二节 细菌的遗传分析,细胞分裂增殖，从F+细菌产生F+细菌，从F-细菌产生F-细菌。 F+细菌与F-细菌混合培养， F-细菌变成F+细菌。 令外， F+细菌丢失F因子，成为F-细菌。方法：使用吖黄素处理。调节吖黄素的浓度，使这浓度不妨碍细菌的增殖，但可选择性的阻碍F因子的复制，如此培养F+细菌，所有的细菌都能转变成F-细菌。,F因子的特点,F细菌可以把F因子传给后代。F细菌经吖黄素处理F因子丢失，丢失后不再出现。F可以和F杂交，而不能和F杂交。F和F杂交后代皆为F，而且可以以107频率获得重组体后代。,第二节 细菌的遗传分析,三、高频重组与中断杂交技术,在菌株A中发现一个新的菌株，跟菌株B（F-）杂交时，出现重组子的频率很高，几乎比F+XF-杂交高1000倍。此菌株含有F因子，并且F因子通过交换整合到宿主染色体中的菌株,简称Hfr菌株（高频重组菌株）。,1957年，沃尔曼（Wollman.E）和雅各布（Jacob.E）设计了著名的中断杂交试验，他们采用的菌株基因型为： 苏氨酸 亮氨酸 叠氮化钠 噬菌体 乳糖 半乳糖 链霉素 Hfr： thr+ leu+ azir tonr lac+ gal+ strs F- ：thr- leu- azis tons lac- gal- strr,1、中断杂交作图,中断杂交技术：基因从Hfr 细胞按次序转入F- 细胞，根据供体基因进入受体 细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术。,第二节 细菌的遗传分析 二、接 合,不同时间取样搅拌振荡，中断杂交稀释菌液，防止其再度结合 含链霉素的完全培养基 杀死Hfr细菌Strr 细菌菌落影印培养法：影印到只添加azi、gal等不同选择性培养基上培养， 鉴定各基因转移的时间。,将Hfr与F-同时加入装有完全培养基的大试管中混合培养,第二节 细菌的遗传分析 二、接 合,结果如下:,该方法主要根据基因转移的先后次序，以时间（min）为单位，求基因间的遗传距离。,Hfr菌株的基因是按一定的线性顺序从原点依次进入F菌株的，不同基因在F中出现的时间和达到的稳定转移频率不同，基因位点离原点（基因位于染色体上，染色体从一端开始，称为原点或O，以线性方式进入F-细胞）愈近，进入F细胞愈早，反之则晚。,第二节 细菌的遗传分析 二、接 合,thr+ leu+ azir tonr lac+ gal+ 8min + 8.5min + + 9min + + + 11min + + + + 18min + + + + + 25min + + + + + +,随时间的推迟，某个基因的重组率（出现频率）增加；一定程度后，重组率便不再增加。,第二节 细菌的遗传分析 二、接 合,i,i,具有Hfr菌株标记基因的菌落数%,F因子插入的位置及方向,第二节 细菌的遗传分析,大肠杆菌的4种Hfr菌株的基因转移顺序很不相同,重组区：4个插入序列（insertion sequence, IS），插入整合有极性。自主复制区：转移的起点（原点，O）；2个复制起点（Ori T；Ori V）；Ori T是在染色体转移时进行滚环复制时的复制起点，也是转移起点。Ori V是在营养时期，即游离在细胞质中独立复制时的复制起点。DNA复制酶基因； 接合转移区：长33 Kb，性伞毛基因群。,F因子：是一种质粒，由共价环状闭合双链DNA构成，全长94.5 Kb，主要包括：,第二节 细菌的遗传分析 四、F因子整合到细菌染色体的过程,第二节 细菌的遗传分析,第二节 细菌的遗传分析,F因子的插入与Hfr染色体的极性,同一个Hfr菌株的转移起始点以及转移顺序在不同实验中都是相同的，但一个F+品系可产生许多Hfr品系。 这是因为F因子与细菌主染色体交换整合时，F因子的IS与主染色体的IS配对。由于 主染色体的IS有多个，F因子的IS与主染色体的哪个IS配对； F因子的IS插入取向如何 就导致产生的Hfr的转移起点、基因转移顺序以及转移方向都不相同。即由于F因子的插入，使主染色体具有了极性。,第二节 细菌的遗传分析,F因子的整合,第二节 细菌的遗传分析,F因子插入的位置及方向,第二节 细菌的遗传分析,Hfr细胞和F-细胞之间的接合管常会自发断裂，进入的Hfr染色体也随之断裂，一般说很少有整条Hfr染色体转入F-细胞的，转移到受体的部分只是靠近原点的一部分，F因子的主要部份在最后进入受体，所以大部分F因子并没有进入受体。因此：1、F- 细胞得到的只是F因子的一部分，这样受体细胞大多数仍为F-。2、F- 细胞只接受部分的供体染色体，这样的细胞就称为部分二倍体。 部分二倍体：一个完整的基因组和一个不完整的基因组所构成的二倍体。 其中受体的基因组叫内基因子，供体的基因组叫外基因子。 供体与受体的重组是内基因子与外基因子的同源部分配对、交换，产生 重组子。其中单交换产生的是不平衡的部分二倍体线性染色体，而双交 换产生的是有活性的环状重组子和片段。,第二节 细菌的遗传分析 五、细菌基因的交换过程,细菌重组的特点,（a）接合后形成的部分二倍体，包括外基因子和内基因子；（b）内基因子和外基因子之间单交换形成一个线性染色体；（c）双交换形成一个完整的重组染色体和一个游离片段，游离片段随以后的分裂而丢失。,-,细 胞 死 亡,第二节 细菌的遗传分析,小结,1、为什么说细菌和病毒是遗传学研究的好材料？2、细菌的杂交F+ x F-?3、高频重组和中断杂交技术？4、F因子整合到细菌染色体的过程，即形成Hfr的过程？5、细菌基因的交换过程，即 Hfr与F-杂交的基因交换过程？,练习题,