第二章核酸化学课件.ppt

第二章核酸化学,Nucleic Acid Chemistry,核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。,核酸概述,第一节 核酸是遗传物质的载体,一、核酸的发现史1868年，F. Miescher从细胞核中分离得到一种含磷量很高的酸性物质，即现在被称为核酸的物质。,1944年，Avery的转换转化实验,or,and,可分离,1943年，chargaff等证明了DNA中四种碱基的比例并不相等1953年，Watson、Crick发现 DNA双螺旋模型核酶（Ribozyme）,98核中（染色体中） 真核 线粒体（mDNA） 核外 叶绿体（ctDNA）DNA 拟核 原核 质粒（plasmid） 病毒：DNA病毒,二、核酸的种类和分布,核酸分为两大类： 脱氧核糖核酸： Deoxyribonucleic Acid （DNA） 核糖核酸： Ribonucleic Acid（RNA）,RNA主要存在于细胞质中,tRNA rRNA mRNA 其它（4.5SRNA,5SRNA;sRNA;反义RNA,核酶等） RNA病毒,三、分子生物学的中心法则,第二节 核酸的基本化学组成,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,元素组成： C H O N P,核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 -D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,一、戊糖,1. 嘧啶（Pyrimidine）,二、碱基,二、碱基 1. 嘧啶（Pyrimidine）,尿嘧啶uracil,胞嘧啶cytosine,胸腺嘧啶thymine,U,C,T,稀有碱基,腺嘌呤 Adenine,A,2. 嘌呤（Purine）,2. 嘌呤（Purine）,腺嘌呤 Adenine,鸟嘌呤Guanine,A,G,稀有碱基,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。如7甲基鸟嘌呤（核苷酸）：,三、核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,五、核苷酸衍生物,1. 继续磷酸化,2.环磷酸化,cAMP,cGMP,3. 肌苷酸及鸟苷酸,4. 辅酶 NAD、NADP、FMN,IMP GMP,六、多聚核苷酸（核酸）,多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH 与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,5-磷酸端(常用5-P表示); 3-羟基端（常用3-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,DNA RNA,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,第三节 DNA的结构,一、DNA的一级结构脱氧核糖核酸的排列顺序可以用碱基排列顺序表示连接键：3，5-磷酸二酯键磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架碱基形成侧链多核苷酸链均有5-末端和3-末端 DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,2. 基因与基因组,基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位（交换单位）。,基因组（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。包括：核基因组（拟核/核DNA）及核外（质粒/质体DNA/线粒体DNA）,各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小,3. 原核生物基因组特点 重复序列少，编码区占比例大 多以操纵子的形式组织在一起 有重叠基因存在,真核生物基因组特点 以染色体形式存在 重复序列多，非编码区占绝大部分 有断裂基因 （内含子和外显子）,基因组计划 人类基因组计划（Human Genome Project， HGP ） 酵母基因组计划 （YGP） 大肠杆菌（E.Coli）,二、DNA的二级结构 DNA的双螺旋模型,1953年，J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,DNA双螺旋模型要点,B型结构 两条链反向平行，右手螺旋 碱基在内（AT，GC） 碱基平面垂直于螺旋轴 戊糖在外，双螺旋每转一周 为10碱基对（bp）螺距为3.4nm， 0.34nm/ bpA型结构 碱基平面倾斜20，螺旋变粗变短，螺距23nm。Z型结构 左手螺旋，只有小沟,双螺旋DNA的结构参数,稳定双螺旋结构的作用力及破坏双螺旋结构的因素 氢键 碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力） 离子键等而DNA变性剂(热、pH、脲/酰胺、有机溶剂)则破 坏双螺旋结构,DNA的存在形式2-10-30-150-300-700-1400 DNA-核小体-纤丝-突环-花结-螺旋圈-染色体,二、DNA的三级结构,DNA双螺旋的进一步扭曲构成三级结构，负超螺旋（双螺旋的螺旋） 原核 双链环状DNA（dcDNA） 病毒 单链环状DNA（scDNA） 单链线性DNA（ssDNA）,当DNA双螺旋分子在溶液中以一定的构象自由纯在时，双螺旋处在能量最低的状态此为松弛态。如果是这种正常的DNA分子额外的多转几圈或少转几圈，就会使双螺旋中存在张力。当双螺旋分子的末端是开放的，这种张力可以通过链的转动释放出来，DNA将恢复正常的状态。但如果DNA分子的两端是固定的，这种额外的张力就不能释放出来， DNA分子本身就会发生扭曲，用以抵销张力。这种扭曲称为超螺旋，是双螺旋的螺旋。,真核 双链线性DNA（dsDNA）,第四节 RNA的结构与功能,一、结构特点碱基组成 A、G、C、U （AU/GC） 稀有碱基较多，稳定性较差，易水解多为单链结构，少数在局部形成双螺旋分子较小分类mRNA（hnRNA 核内不均一RNA）tRNA rRNA （snRNA/asRNA）少数RNA病毒,二、tRNA,占RNA总量的15一种氨基酸对应至少一种tRNA,分子量25000左右，大约由7090个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。分子中含有较多的修饰碱基。3 -末端都具有-CCA-OH的结构。三叶草二级结构一般有四环四臂组成氨基酸臂、D臂、反密码子臂、TC臂D环、反密码子环、可变环、TC环“倒写的字母L” 三级结构,tRNA的三级结构(76bp),三、rRNA,占RNA总量的80,大肠杆菌5sRNA的结构,四、mRNA和hnRNA,占细胞总RNA的35,真核细胞mRNA的3-末端有一段长达200个核苷酸左右的多聚腺苷酸(polyA)，称为 “尾结构” ，5 -末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为“帽子结构”。,占细胞总RNA的35,五、snRNA （small nucleic RNA 核小RNA） U-RNA、RNP scRNA （small cytoplasmic RNA） asRNA （antisense RNA）,第五节 核酸的性质,二、核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫光外下发出荧光核酸比其各核苷酸的光吸收值之和少30%40%,三、核酸的变性、复性与分子杂交,1. 变性稳定核酸双螺旋结构的次级键断裂，空间结构破坏，变成单链无规线团结构的过程。核酸的一级结构(碱基顺序)保持不变。变性表征：部分生物活性丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素 pH（11.3或5.0） 变性剂（脲、甲酰胺、甲醛） 低离子强度 加热,DNA的变性过程是突然性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大增量一半时的温度称为熔解温度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的GC 的含量有关。GC 的含量高，Tm值就高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中GC的含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,2. 热变性和Tm,3. 核酸的复性,变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。具减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不能复性。而变性的DNA只有在缓慢冷却时才可复性，复性过程又称为“退火”。 退火温度Tm25影响复性的因素片段浓度片段大小片段复杂性（重复序列数目）溶液的离子强度,4.分子杂交,DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交分子。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。Southern 杂交（Southern bolting）：DNANorthern 杂交（Northern bolting）：RNAWestern 杂交 （Western bolting）：蛋白质,分子杂交操作过程示意图,四、核酸的序列测定,双脱氧链终止法（Sanger酶法）如右图：2. Gilbert化学降解法（略）,本 章 小 结,核酸是遗传物质载体的证明和研究历史核酸的化学结构：戊糖、碱基（A、T、G、C、U），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）DNA的结构：一级结构 (核苷酸排列顺序及其表示、核苷酸之间的连接方式、基因及基因组、核酸序列的测定)、二级结构 ( Watson-Crick双螺旋模型、ZDNA)、维持二级结构的化学键。RNA种类、结构与功能，RNA碱基组成上的特点。核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交,谢谢,