流式细胞仪及其临床应用课件.ppt

流式细胞仪及其临床应用,一、流式细胞仪的概念,二、流式细胞仪的原理与结构,三、流式细胞仪的性能指标与质量控制,四、流式细胞仪的临床应用,一、流式细胞仪的概念,2-4 color cytometer,10-20 color cytometer,sorter high-end res,1953，Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形,1967，发展了一种液流束、照明光轴、检测系统三者垂直的流式细胞仪,1969 ， Van Dilla Fulwyler 发明第一台荧光检测细胞计,1975 ， Kohler 和Milstein 提出单克隆抗体技术,流式细胞的发展史,流式细胞术的概念,流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞/生物学颗粒的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,流式细胞术的特点,检测速度快，分析样本量大：在极短时间内可分析大量细胞，可以每秒钟成千上万个细胞的速率进行测量，测量细胞总数可达至数百万个 可同时分析单个细胞的多种特征：使用不同荧光素标记的单克隆抗体或荧光染料对细胞进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确可检测的样本种类多样：各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等血清、血浆、培养上清、细胞裂解液,流式细胞仪的检测范围,细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位 ,基础医学和临床,新药研究,生物材料,疾病机理等,细胞表型分析按照细胞的蛋白表达（或转染）定量按照细胞的DNA量的变化来分类和定量按照细胞功能改变（如分泌细胞因子，受体表达等）来对细胞进行分类和定量按照细胞生物大分子的暴露来分类细胞和定量按照特定细胞的标记对该细胞进行上述指标的深度研究,细胞生物学研究细胞存活率检测细胞凋亡发生率检测细胞免疫功能改变检测细胞周期检测,纳米药物和材料研究和应用纳米材料基础研究，如半导体种类、组成比例、直径大小与光谱激发纳米材料的应用，如吸收和发射性能、半衰期、标记效率、色谱交叉和补偿、标记检测等纳米材料对细胞的毒性性能检测，如凋亡、激活能力等纳米材料导入细胞的途径和效率研究,流式细胞仪的用途,二、流式细胞仪的原理与结构,分析型流式细胞仪,一级标题（微软雅黑 加粗 20号字）二级标题（微软雅黑 18号字）三级标题（微软雅黑 16号字）四级标题（微软雅黑 12号字）,标题（微软雅黑 加粗 28号字）,分选型流式细胞仪,流式细胞仪原理,a.流动室及液流驱动系统；,c.激光光源及光束成形系统；d.光学系统与信号检测；,e.存贮、显示、分析系统；分选,流式细胞仪的基本组成,一、流动室与液流驱动系统,流动室,侧向及荧光信号,前向散射光信号,鞘液,激光,由于鞘液的作用，待测细胞被限制在液流的轴线上流体动力学聚焦,一、流动室与液流驱动系统,一、流动室与液流驱动系统,液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱,为了保证液流是稳液，一般限制液流速度10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。,二、光路系统与信号检测,PMT 1,PMT 2,PMT 5,PMT 4,Dichroic,Filters,Bandpass,Filters,Laser,Flow cell,PMT 3,Scatter,Sensor,Sample,1、激光光源与光束成形系统,大多采用氩离子气体激光器：激光（Laser）是一种相干光源，提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1 微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。,激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为2266m 即短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90角方向照射，细胞产生散射光和荧光。,1、激光光源与光束成形系统,1、激光光源与光束成形系统,光斑直径d可由下式确定：d=4f/D。为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径。,激光光源,垂直透镜（约束激光的宽度）,横向透镜（约束激光的高度）,形成小的椭圆形激光束,流动室,1、激光光源与光束成形系统,当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束 方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）;与激光束垂直的称为 侧向角散射光信号（SSC）。,2、FCM散射光测量原理,前向散射光信号,前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性,侧向散射光信号,前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性,外周全血细胞散射光双参数点图,使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,ATOM,荧光激发过程示意图,3、FCM荧光测量原理,FITC荧光素的激发和发射光谱,荧光素的使用： 选择正确的激光器；确定正确的滤光片； 确定所需荧光探测器（PMT） 使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,FITC,流式常用荧光染料,488nm激光激发的荧光,荧光的识别光学滤片组,带通滤片 BAND PASS (BP)二向色性滤片 DICHROIC FILTER,630/20 Band Pass Filter,620 -640 nm Light,550 Long Pass Dichroic Filter,550 nm Light,550 nm Light,Longpass(LP) Shortpass(SP) Bandpass(BP),荧光的识别光学滤片组,流式细胞仪光路示意图,Air-cooled Argon Ion Laser,Beam Shaping Lenses,High SensitivityQuartz Flow Cell,Forward ScatterDetector,Side ScatterDetector,525BP FL1 (FITC),575BP FL2 (PE),620BP FL3 (ECD),675BP FL4 (PC5),488DL,488BK,550DL,600DL,645DL,流式细胞仪的电路,进行信号检测和分析荧光信号由光电接收器（PMT）接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度电脉冲信号经A/D转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析,三、信号转换与显示分析,1、电脉冲信号的产生及光电管和检测系统,2、光电管和检测系统：放大器,基本原则 - 信号强弱差10倍or需分析弱荧光:使用对数放大器(如荧光),3、数据存储,FCS 2.0格式常以列表模式（LIST MODE)：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储,4、数据显示,直方图（Histogram）二维点图（Dot Plot）等高线图（Contour Plot）密度图（Density）三维图（3D Plot）等,单参数直方图分析,荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了？,荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了具有此种荧光强度的细胞在样本中所占比例的相对多少，而非绝对数目,等高图和密度图,双参数散点图分析,5、结果解读,百分比 目标细胞占选定细胞群或所有细胞的比例绝对浓度 目标细胞在样本中的浓度（cells/ul)荧光强度 单个目标细胞上表达某一个蛋白的多少变异系数 所有目标细胞表达某一个蛋白的离散程度,视频演示,四、荧光信号问题之1参数应用,四、荧光信号问题之2光谱重叠,FITC,PE,受激光照射后FITC和PE分子发射光谱相互重叠,荧光补偿（compensation）荧光补偿是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号出现的时机：多色分析；存在光谱重叠时不可避免时，但可以校正如何校正：单染试验,四、荧光信号问题之2光谱重叠（spectral overlap）,blank,mixture,8色单抗标记检测管,5/7/3/8/56/4/19/2/45,荧光补偿,FL1单染补偿管,荧光信号问题之光谱重叠,FL2单染补偿管,荧光补偿,四、荧光信号问题之光谱重叠,四、荧光信号问题之3抗原抗体结合非特异性因素,同型对照（Isotype Control） ：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 （即Fc段相同， F(ab)2段不同）与染色的单克隆抗体 相同种属来源相同免疫球蛋白及亚型相同荧光素标记相同剂量和浓度但由未免疫动物血清纯化而来用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色,四、荧光信号问题之3对照设置,五、细胞分选器,当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内。,五、细胞分选器,水滴的形成压电晶体带动流动室振动，液流形成水滴。喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。当喷嘴直径为50m时，信号频率为40kHz，则每秒钟产生4万个水滴。若每秒钟流出的细胞是1000个，则平均每40个水滴中只有一个水滴是有细胞的，其他皆为空白。水滴的充电为了分选细胞，需要细胞在经过测量区时判断出哪个细胞满足了分选的条件，并产生一个逻辑信号，此信号驱动充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲。,五、细胞分选器,水滴的偏转当水滴从流束上将要断开时给整个流束充电，则水滴从流束上断开后便带有同极性的多余表面电荷。下落的水滴通过一对平行板电极形成的静电场时，带正电荷的水滴向带负电的电极板偏转，这样就可用容器收集水滴。,三、流式细胞仪的性能指标与质量控制,一、流式细胞仪的性能指标,灵敏度是衡量仪器检测微弱信号的重要指标。一般以能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示，现在的FCM均可达到检测小于100个荧光分子的指标。前向角散射光检测灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的FCM可以测量到0.20.5左右。仪器分辨率分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数值表示：,(是分布的标准误差，是分布的平均值),一、流式细胞仪的性能指标,分析速度以每秒分析的细胞数来表示。当细胞流过的速度超过FCM仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会丢失，这段时间称为仪器的死时间。 死时间越短，仪器处理数据越快，一般可达到30006000个/秒左右。大型机已达到每秒几万个细胞。分选指标分选速度指每秒可提取所要细胞的个数。分选纯度指要分选的目的细胞占分选出细胞的百分比。分选收获率指被分出的细胞与原来溶液中该细胞的百分比。,二、流式细胞仪的质量控制,光路与流路的校正确保激光光路与样品流处于正交状态，使仪器检测时的变异减少到最小，从而控制仪器的CV值流路校正物中所使用的标准荧光微球，其物理性质、生物学化学特性均经过标定PMT校正光电倍增管随时间的增加，其放大功率会有所改变，对样品检测的灵敏度会产生影响。为保证样品检测时仪器处于最佳工作状态，采用质控品进行PMT校准，必要时进行电压补偿。,二、流式细胞仪的质量控制,绝对计数校正为保证仪器在计数时的准确性，仪器应采用绝对计数标准品建立绝对计数标准。该标准品是经标定的，如以计算1000个细胞为1ml，作为设定标准。在样本测定时，以此为标准进行绝对计数，从而获得绝对计数的标准值。流路校正物中所使用的标准荧光微球，其物理性质、生物学化学特性均经过标定。,四、流式细胞仪的临床应用,流式细胞术临床应用,免疫感染 HIV，TBNK绝对计数 细胞移植的免疫状态监测 干细胞计数 HLA-B27检查,血液 淋巴细胞亚群分析 白血病的免疫分型 网织红细胞计数 阵发性血红蛋白尿(PNH) 血小板功能及相关疾病,肿瘤 肿瘤的细胞周期和倍体分析 肿瘤相关基因表达的研究,CD抗原及其相关细胞群,细胞群 CD抗原 T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38B细胞 CD10 CD19 CD20- CD24 CD37 CD72- CD75髓系细胞 CD13 CD14 CD15- CD17 CD33 CD34 CD35NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95- CD97粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f内皮细胞 CD105 CD106 CD109细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126,FCM临床检测的免疫学基础,免疫细胞功能概述,免疫系统可抵御外部病原体的入侵、清除体内的肿瘤细胞在器官移植、过敏反应、自身免疫性疾病时过度活化则会损伤机体功能,细胞免疫功能的评价,CD3+：总T细胞数量免疫大军的数量CD4+：辅助调节性T细胞指挥部CD8+：杀伤性T细胞战士CD4/CD8：比例均衡Th1/Th2：活化/抑制，反馈机制参谋Treg：负反馈权力制约CD69：早期活化战斗准备HLA-DR：持续活化投入战斗NK：免疫监视警察单核巨噬细胞、DC情报员,免疫细胞分类淋巴细胞亚群,Innate Immune Response(no antigen specificity, no memory),Adaptive Immune Response(specificity to antigens after presentation, memory compartment),NK,T,B,T8,CD3-CD56+,CD3+CD8+,T4,Treg,TH1,FoxP3+CD25+CD127+/-,TH17,PC,IFNIL-2TNF,IL-4IL-6IL-10,IL17,CD38+CD138+,memB,CD27+IgM+ (-),CD3+CD4+,CD3+,CD19+,TH2,淋巴细胞的功能,淋巴细胞的功能,流式检测在感染性疾病中的意义,感染性疾病的鉴别诊断 病毒性感染：CD4+T细胞减少，CD4/CD8比值倒置 胞内菌、寄生虫感染：NK细胞、单核细胞增多 细菌性感染：无上述变化病情进展判断 细菌性感染：严重细菌性感染CD64炎症指数5，正常人 12，一般感染25 病毒性感染：病情往往与CD4+T细胞减少、CD4/CD8比 值倒置程度正相关，HIV尤为明显,淋巴细胞亚群检测,HIV感染患者CD4阳性T细胞的绝对计数,HIV入侵人体的目标细胞是CD4 T细胞，感染后期能严重破坏T细胞，引起CD4细胞的减少CD4细胞的计数是诊断、疗效观察和预后的最重要指标CD4细胞绝对数量如果低于300细胞/ul，需要服药治疗,流式检测在肿瘤性疾病中的意义,病情提示与评价 肿瘤早期：CD4+T细胞减少，NK细胞比例相对明显升高 肿瘤晚期：CD4+T、NK淋巴细胞均减少 病情进展：抑制性T细胞（CD8+CD28-T细胞）、调节性T 细胞（CD4+CD25+T细胞）比例与病情进展正相关 肿瘤及癌前病变：细胞周期及DNA异倍体检测，增殖期 细胞20%提示肿瘤生长迅速，出现非整数倍体细 胞提示预后不良,病情进展评价,疗效评价 手术和化疗后，CD4+T细胞、CD4/CD8下降，于数天后 开始恢复，恢复程度较好提示治疗有效，反之则提示治疗 对机体损伤大于治疗作用，宜调整治疗方案细胞治疗 目前已有将患者的免疫细胞（T、NK、DC细胞）分离培 养并回输肿瘤过继免疫治疗方法,治疗方案评价,调节性T细胞分析CD4+CD25+FOXP3+,肿瘤细胞能诱导调节性T细胞的产生,调节性T细胞抑制免疫功能在外周血、骨髓中肿瘤病人的调节性T细胞含量多于正常人群,DNA倍体检测,G0/G1,S,G2/M,G0：静止期G1：DNA合成前期S：DNA合成期G2：DNA合成后期M：有丝分裂期,增殖期细胞（G2/M+S期）20%提示肿瘤生长迅速，出现非整数倍体细胞提示预后不良,流式细胞仪的应用血液,白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病造血干细胞计数PNH诊断网织红细胞分析血小板分析,正常成人骨髓标本,正常粒细胞：约占40-60%，表达CD11b、CD13、CD33、CD15、CD16、CD10、CD64, 不表达CD34、HLA-DR、CD14、CD117,有核红细胞：50%,表达GPA,单核细胞：约占2-8%，表达CD11b、CD64、CD14、HLA-DR，不表达CD34、CD117,成熟淋巴细胞：约占20-40%T细胞：表达CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7,不表达CD10、CD34、TDT等 B细胞：表达CD19、CD20、CD22，不表达CD10、CD34、TDT等NK细胞：CD3-(CD16+CD56)+,正常幼稚B细胞：5.0%,表达CD10、CD19、CD22、弱表达CD20，少量CD10stCD34+TDT+,幼稚髓系细胞：5.0,免疫分型常用的抗体,AMLCD34、CD117、CD33、CD13、HLA-DR、CD11b、CD15、CD64、CD14、CD65s、MPO怀疑M6加做CD71、GPA怀疑M7加做CD61、CD41B-ALLCD34、CD10、CD19、CD20、CD22、c/mIg、TDT、cCD22/CD79aT-ALLCD34、CD10、CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、 HLA-DR 、CD1a、 TDT、cCD3NK细胞CD16、CD56、CD57浆细胞：CD38、CD138、c、c、CD19、CD56,示例：B-ALL初筛CD19+CD7-CD33-CD10+/-CD117-,干细胞计数,CD34在骨髓和外周血的未成熟造血细胞和所有具有造血潜能的集落形成细胞上表达。包括单能和多能祖细胞。 干细胞计数，对于有剂量要求的干细胞移植方案十分重要，此重要性也体现在动员，及白细胞分离过程中，如通过计数细胞水平判断动员是否成功，何时为最佳提取时间，以及提取的干细胞数量是否足够等。研究表明输入病人体内的CD34细胞相对计量决定于每公斤体重输入的CD34总数，此阈值为2-5106细胞/kg。,阵发性血红蛋白尿PNH,阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜的获得性缺陷，对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血,由于pig-a基因突变而导致GPI锚连蛋白缺失或部分缺失，使得一些原本通过GPI锚定在细胞膜上的蛋白（如CD55、CD59）无法发挥正常功能。患者体内红细胞呈不均一性利用流式细胞术和CD55和CD59单克隆抗体，对PNH患者红细胞、粒细胞和血小板进行分析，证实存在膜蛋白表达缺陷的血细胞，并计算缺陷细胞在全血中所占比例流式细胞术已经取代了传统的Ham实验，成为PNH诊断的“金标准”。,PNH检测,A 正常人B D 病人,本章小结,流式细胞术和流式细胞仪的基本概念。流式细胞仪的基本原理、流式细胞仪的分类和基本结构、主要性能指标、质量控制以及流式细胞仪的临床应用。,做 最 优 秀 的 第 三 方 检 测 机 构TO BE THE BEST INDEPENDENT LABORATORIES,（此处内容可根据需要更换）,谢谢!,