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组 织 制 片 技 术,组织制片技术的概述 组织制片技术的方法 组织制片技术的基本程序 苏木精伊红染色,组织制片技术的发展史 从16世纪60年代Hook发明显微镜，开始观察和描述软木塞中的细胞至今，组织制片技术随着生命科学的发展而不断进步。,组织制片技术的发展史 在19世纪中期，随着生物、物理和化学等学科的飞速发展，以及显微镜和切片机的逐步完善，组织学也建立起一整套完整科学的组织制片技术。,组织制片技术的发展史 特别是20世纪50年代以来，由于组织化学、免疫组织化学等新技术和新仪器的出现，使组织制片技术的应用领域进入了一个崭新的时期。,利用组织制片技术的方法所制出的标本，显示了组织细胞的结构和形态、组织细胞之间的相互连接及组织细胞中的某些化学成分的种类和含量。 组织制片是研究医学和生物学的一个最基本的手段。,组织制片的意义和目的,组织制片技术的方法,非组织切片法 组织切片法,非组织切片法 组织不经过切片制成观察标本的方法。非组织切片法的种类 涂片、压片、铺片、磨片、消化分离标本、活体标本、整装标本、血管注射标本。,涂片 将所采的血液、骨髓或者脱落细胞涂抹于载玻片上经瑞氏、姬姆萨染色、常规HE染色。,压片 先将组织处理成小块物质，然后用化学药品进行软化和染色，再用盖玻片压封于载玻片上。例如运动终板和寄生虫标本等。,铺片：将需要观察的薄片组织用手工的方法直接铺于载玻片上，然后经过固定、染色等程序制成。例如蛙的肠系膜铺片，大白鼠的皮下组织铺片等。,磨片：对于骨，牙齿等组织，不经脱钙和切片，直接在磨石上用手工磨成大约50微米左右的薄片，然后再进行染色封固在载玻片上。,消化分离标本：先将组织分离成小块，然后利用相应的化学物质将细胞间质消化溶解，再用机械分离的方法，如水的震荡冲击力，使小块组织分离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片上进行封固。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动神经细胞等。,活体标本 将所采的观察标本加生理盐水后直接滴于载玻片上在显微镜下观察：微生物运动,整装标本 将胚胎或小动物经前期固定后整体封藏于盛满固定剂的透明容器中 。将发育至某一阶段的鸡胚整体取出，经固定、染色、脱水、透明后封固于载玻片上的标本。,血管注射标本 将有色物质注射进血管，用酸或硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整体封藏的血管标本。 将有色物质注射进血管后，经一系列制片技术处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标本。,组织切片法 利用化学试剂将组织经过一系列的固定、脱水、透明后，再利用石蜡、火棉胶或者明胶等支持物渗透进组织内部，使组织保持一定的硬度，并包埋成块，然后依靠切片机将包埋好的组织块切成以微米计的薄片，再根据需要进行各种染色得到的供显微镜下观察的标本的方法。,组织切片法的种类,冰冻切片 石蜡切片、火棉胶切片、明胶切片,冰冻切片 将所取材的新鲜组织，经快速冷冻后再切片，以保持组织内所含的脂类或某些酶类的活性。 为观察急待结果的组织，如临床手术所取组织,石蜡组织切片标本制作的基本程序: 1. 取材 2. 固定和固定后处理 3. 脱水 4. 透明 5. 浸蜡与包埋 6. 切片 7. 染色 8. 封固,取 材一、动物的处死 手法迅速、快捷。 常用方法： 1. 麻醉法：吸入麻醉（乙醚）和注射麻醉（乌拉坦或者戊巴比妥）。 2. 空气栓塞法：耳静脉，2030ml空气 3. 击头法：重物猛击，迅速致死。 4. 颈椎脱臼法：小白鼠 5. 破坏脑和脊髓：金属探针，蛙 6. 股动脉放血：麻醉后放血使大动物迅速死亡。,二、取材的步骤 选择动物选择取材部位选择切面方向,应根据实验工作的目的和经济能力选择实验动物 肝脏猪肝 卵巢猫 胃狗 运动终板爬虫类动物 肥大细胞大、小白鼠的皮下组织 间皮和内皮蛙的肠系膜,根据器官组织的结构特点选择取材部位 胰腺胰尾部 脊髓的运动神经元颈膨大和腰膨大处 肺 肺门 胃胃底部,根据器官组织的结构特点选择取材时切面的方向 肾脏肾门处作纵切 头皮顺毛根的方向纵切 大小肠的环行皱襞纵切 气管和食管横切,三、取材时应注意的问题 ：,组织新鲜：取材动作快捷，迅速投入固定液 注意环境温度的影响：冰上取材或者冷固定 材料应小而薄： 不超过1.51.5 0.5cm3 固定液会造成组织收缩，注意保持组织原有形态 取材手术器械锋利规范操作，防止组织损害 注意取材环境和器械干净，防止组织污染,固定和固定后处理,一、固定的目的 ： 固定剂使细胞的成分凝固，防止组织细胞自溶和腐败，保持细胞生活时的状态。 固定剂的酶染作用使细胞各成分易于被染料着色。 使组织适度硬化，利于制作薄片。,二、固定的方法： 1. 直接固定：最常用。 2. 蒸汽固定：12锇酸或者甲醛挥发的蒸汽，多用于涂片固定。 3.灌注固定：（必须进行后固定） 局部灌注固定：肺、肾脏、眼球、肝脏 全身灌注固定：神经系统,三、固定的注意事项：固定剂的用量 一般为组织块体积的15倍左右 固定剂的配制 现配现用预固定 固定的时间 一般过夜或者24小时可达到固定要求。,四、常用固定剂单纯固定剂 甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、 重铬酸钾、丙酮、 铬酸、四氧化锇 固定组织时，只单用某一种试剂尚难对各种组织成分有较理想的固定作用。因此，常加入其它试剂，根据对组织的作用与反应，配成混合固定剂，以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。混合固定剂 4%多聚甲醛液、乙醇甲醛液、 Bouin氏液、 苦味酸硫酸液 、Carnoy氏液 、Helly氏液,甲醛(Formeldedhyde)固定浓度： 4%甲醛溶液固定时间： 12小时24小时固定后处理： 流水冲洗12小时24小时配制方法： 甲醛10ml + 生理盐水/蒸溜水90ml特性： 甲醛放置时间过长易产生白色沉淀“三聚甲醛”，氧化后变为甲酸，使溶液变为酸性，严重时可影响到细胞着色。,乙醇(Ethyl alcohol) 固定浓度： 80%-90%乙醇液 固定时间： 一般4小时12小时 固定后处理： 直接入脱水剂 配制方法： 无水乙醇 + 蒸馏水 特性： 乙醇具有固定、脱水等多种功能。组织在高浓度乙醇中放置时间过长时，易发脆。50%以上浓度的乙醇可溶解组织内脂肪、类脂体、色素等，注意制片的目的。,4%多聚甲醛液 配制方法： 多聚甲醛 4g 0.1M PBS溶液 100ml 固定时间： 24小时 固定温度 4固定后处理： 流水冲洗24小时适用组织： 常用固定剂，适用广泛,乙醇甲醛液（AF液） 配制方法： 95%乙醇90ml 40%甲醛10ml 固定时间：组织块固定412小时， 铺片固定 510分钟。 固定后处理：直接入脱水剂。 适用组织：肥大细胞，糖原的固定 。,Bouin氏液配制方法：饱和苦味酸溶液75ml 40%甲醛25ml 冰乙酸5ml固定时间：1224h固定后处理：70%乙醇脱去苦味酸产生的黄色适用组织：常备固定液，特别适用于固定皮肤和胚胎组织。,五、固定后处理,除去组织中渗入的固定液和一些由固定液产生的沉淀、结晶和色素的步骤称为固定后处理。主要有以下六种方法：流水冲洗 ：重铬酸钾、甲醛固定的组织，要经过流水冲洗24h。酒精脱黄 : 含有苦味酸的固定液固定的组织，必须经过70乙醇洗涤脱去黄色。,碘酒脱汞 ：氯化汞固定的组织有汞结晶，碘酒浸泡除去。脱甲醛色素 ：甲醛长期固定的组织易产生黑色结晶， 70乙醇浓氨水溶液除去。 组织漂白 ：锇酸固定的组织为黑色。漂白液漂白才上色。 脱钙：含钙组织骨、牙齿和内耳。,脱 水,一、脱水 用某种能与透明剂互溶的化学试剂将组织内的水分逐渐置换出来的过程。 要点：缓慢、彻底、勿过度。二、常用脱水剂 乙醇、丙酮、正丁醇,乙醇固定剂 + 脱水剂上行酒精脱水70%（30%）100%，以10递增。丙酮脱水强，但对组织的收缩脆化作用也强；主要用于组织的固定兼脱水或切片的快速脱水，以保护某些特殊染色的标本不被褪色。,透 明,一、透明 对组织的最后脱水处理。 在经过前一阶段的“脱水”后，还要借某种有机溶媒将酒精完全置换，使组织与所用的包埋介质相溶而浸渗。二、常用透明剂 二甲苯、苯甲酸甲脂、三氯甲烷 、冬青油,二甲苯 为无色透明的液体，易挥发，长期接触对呼吸道粘膜有较强的刺激作用20分钟1个小时，大块组织可适当延长时间。作用迅速，浸泡时间过长易发生过度收缩和脆化苯甲酸甲脂为无色透明的液体，易挥发透明作用较二甲苯缓慢，透明时间12-24小时。对组织块的收缩和脆化的影响较小。苯甲酸甲脂与火棉胶互溶，用于火棉胶切片的透明,用石蜡做为支撑剂将组织包埋成块使其硬化的过程 包括浸蜡和包埋两步一、浸蜡 组织透明后，用石蜡置换组织内部的透明剂的过程称为浸蜡。 组织块浸蜡一般先经过低熔点蜡，再经过高熔点蜡。,包 埋,高溶点蜡也称硬蜡溶点在60-62硬蜡箱的温度控制在62-64之间组织浸蜡时间一般不超过1小时,低溶点蜡也称软蜡溶点在48-50 软蜡箱的温度控制在5254之间 组织浸蜡时间一般可达24小时,二、包埋 组织浸蜡完成后，接着进行组织块包埋。用于包埋的是硬蜡。包埋在包埋器中完成。 修整蜡块时，组织块应距蜡块边缘23毫米，以利于连续切片。,切 片,石蜡切片 组织切片中应用最为广泛的一种切片就是用石蜡作为包埋剂制作的切片。易于制作大量菲薄的组织标本，而且包埋块可长期保存。,一、仪器及器材,二、切片过程： 调节恒温水箱水温至47左右； 固定蜡块于固定器； 快修装置修整包埋面； 调节切片厚度至46微米； 连续切片； 摊片于水箱内； 将蜡片贴于涂好粘片剂的载玻片上； 置于温箱内烤片。,三、切片的注意事项 切片前要将切片机各部位的螺丝旋紧，否则会引起切片机各部件震动，造成切片厚薄不匀。 包埋块的切面和切片刀的倾斜度之间的夹角应按切片机刀台上的刻度作适当调整。 恒温水箱的温度应比包埋蜡的溶点低5-6。,染 色,一、染料 指分子中含有发色团和助色团的有机化合物，有鲜艳的色彩，对于组织有极强的亲和力。 根据来源可分为两类： 天然染料（卡红、苏木精） 人工合成染料（苦味酸、桔黄G） 根据其化学性质分为： 碱性染料(basic dye) 酸性染料(acid dye) 中性(neutrophilia)染料等,二、染色的原理,染色就是染料和组织细胞的分子相互结合，使组织和细胞着色。 化学反应 在组织细胞内含有酸性物质和碱性物质。染色时酸性物质与碱性染料结合；碱性物质与酸性染料结合。细胞核中主要由酸性物质组成（如核酸等），所以与苏木精等碱性染料有很强的亲和力。细胞质主要由碱性物质组成，所以与伊红等酸性染料有很强的亲和力。 能被碱性染料着色的物质：嗜碱性(basophilia)； 能被酸性染料着色的物质：嗜酸性(acidophilia)。,物理反应 细胞中有许多微小的毛细小孔，染料的色素离子通过这些小孔渗入细胞内，染料与细胞没有牢固的结合，但分散的色素离子和组织细胞分子之间通过分子间相互作用使细胞着色。,三、染色的注意事项：1.溶媒：水和乙醇。2.浓度：低浓度，长时间。3. 温度：高，染色效果明显。4. 适当使用媒染剂、促染剂和分化剂。媒染剂：能增强染料对组织的着色能力，其本身与染料或组织不发生结合的试剂。如配制各种苏木精染色液时添加的钾明矾、铵明矾等。促染剂：能增强染料对组织的着色能力，本身并不参与染色反应。如伊红染色液中添加的冰乙酸等。分化剂：能除去组织上和切片上过染的染色液，使染色部位与周围组织对比鲜明，着色深浅适当；例如低浓度的盐酸、醋酸、高锰酸钾、重铬酸钾等。,封 固,一、封固 最后一道程序是滴加封固剂，用盖玻片覆盖，以利于镜下观察。 阻断组织片与外界的接触，防止组织片脱片、受潮、干裂、机械磨损等，延长切片的使用时间。 这一步骤称为封固。 封固分为干封和湿封两种。,干封：切片染色经脱水和透明后，用中性树胶之类无水封固剂封固。数年不褪色。湿封：切片染色后直接用含甘油、明胶及少量的水和防腐剂组成的封固剂封固。湿封的标本保存时间不长，主要用于某些组织化学或特殊染色的标本。,二、封固时的注意事项： 封固时避免产生气泡。 封固剂应浓度适中。 选择大小合适的盖玻片，以盖好组织后四周约有2毫米左右的间隙为适当。 封固剂应避光保存 。,组织脱水、透明步骤脱水：70%乙醇 3080%乙醇3095%乙醇20 95%乙醇20 100%乙醇20 100%乙醇20透明：苯甲酸甲酯 过夜,苏木精(hematoxylin)-伊红(eosin)（H-E染色）,一、脱蜡与入水1二甲苯510分钟 2次；2无水乙醇5分钟 2次；395%乙醇 5分钟；480%乙醇 5分钟；570%乙醇 5分钟；6自来水洗 5分钟；7蒸馏水洗 5分钟。,二、染色、分色与返蓝,1苏木精 5分钟；2自来水洗1分钟；31%盐酸酒精分色数秒；4自来水洗数分钟（此时可镜下检查，细胞核着蓝色，其它组织基本无色）；5饱和碳酸锂返蓝 1分钟；6自来水洗 2分钟； 伊红 1分钟。,1 80%乙醇 2分钟； 2 95%乙醇 2分钟 2次；3无水乙醇 2分钟 2 次；4. 二甲苯 5分钟 2 次；5中性树胶封固。,三、脱水、透明与封固,结果 细胞核蓝色，细胞质红色,伊红-醛复红染色（弹性纤维、胶原纤维）1) 组织铺片用95%乙醇固定5-10分钟;2) 醛复红溶液染色45分钟(镜检）;3) 95%酒精稍洗;4) 伊红30秒;5) 无水酒精稍洗;6) 滤纸吸干;7) 二甲苯2分钟.8) 二甲苯2分钟.9)中性树胶封片.,结果胶原纤维呈红色；弹性纤维呈紫蓝色,