间接免疫荧光检测PBMCppt课件.ppt

间 接 免 疫 荧 光-检测人外周血单个核细胞,武汉大学基础医学院免疫学教研室熊 洁,原 理,间接免疫荧光法是用荧光素标记Ab2以检测Ag或Ab的一种实验技术。其原理是Ag首先与Ab1结合，然后Ab1再与荧光素标记的Ab2结合，形成一个Ag- Ab1-荧光素标记Ab2的三分子复合物，在荧光显微镜下呈现荧光。,外周血单个核细胞分离 - 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法 原理 外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。,材料 1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为1.0770.001g/L） 2、 2台盼蓝染液 3、 Hanks液或者RPMI-1640培养基 4、试管、吸管、水平离心机等,方法1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hanks液（含100u/ml肝素）的试管中，混匀。2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。（关键）3、室温2000rmin离心20min。管内可分为四层。,4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加入另一支已含有2-5mlHanks液的离心管中，混匀。5、室温下，1500rpm离心10min。,6、弃上清，重复洗涤一次。 用完全RPMI-1640 1ml定容，计数细胞，调整细胞浓度。 一般每ml血可分离出1-2106个单个核细胞。7、细胞活力检查 取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，作湿片高倍镜检，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。一般活性应在95以上。,材 料,1. Ag PBMC2. Ab1 兔抗人白细胞血清 (Ab1)3. Ab2 FITC-抗兔单克隆抗体 (Ab2)4. 洗涤液5. 荧光显微镜,方 法,1.制备抗原片: 吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片黑色圈圈背面中央, 静止5-10分钟，待PBMC干燥。 2. 15 ul Ab1 加入玻片上37孵育30 min。 PBS洗3次(3min/次)。,3. 玻片上加15 ml 荧光二抗 (Ab2) 湿盒内37孵育30 min。PBS洗3次(同上,避光操作)4. 用吸水纸印干玻片，滴油，荧光镜显微镜下观察。,结 果,在荧光显微镜下呈绿色荧光者为阳性。,