原生质体培养和融合课件.ppt

4.原生质体培养与融合,原生质体培养的意义原生质体操作方法原生质体融合的意义融合方法体细胞杂种鉴定方法,原生质体（Protoplast）,1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质。含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。,细 胞,微 丝,叶绿体,线粒体,质 膜,液 泡,细胞核,内质网,微 管,细胞壁,高尔基体,植物细胞模式图,细胞壁由三种主要成分构成纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%,一、原生质体培养发展简史及其意义,1、发展简史,1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体；1960年： 1960年英国诺丁汉大学Cocking 教授率先利用真菌纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体；1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场；1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法。,1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首次获得再生植株。1993年有49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。其趋势主要是农作物和经济植物，从一年生扩展到多年生，从草本到木本、从高等植物到低等植物，食用菌、藻类、大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、柑桔、猕猴桃、桃、苹果、马铃薯、胡萝卜、黄瓜、杨树、云杉等；1986年：Spangenberg单个原生质体培养成功；,2、原生质体培养的意义,（1）为细胞融合奠定基础。 有性杂交不能进行细胞质交流,（2）是遗传工程的理想受体。能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。,原生质体也具有全能性,原生质体是分子水平和细胞水平上研究遗传信息动态的结合点,（3）理论研究,细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。,因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的生长和分化等生命活动。但是：原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育。,二、原生质体分离及培养,（一） 分离方法1. 机械法：利刃机械切割2. 酶解法：果胶酶和纤维素酶处理,2.Enzymatic isolation,2.1 材料获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂，因此，常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。,2.2 酶的种类和浓度,纤维素酶（Cellulase） Onozuka R-10果胶酶（Pectolyase）Y-23半纤维素酶（Hemicellulase）对幼叶来说，酶浓度较低：0.5-1纤维素酶，果胶酶(0.2-0.5); 酶量少对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1或2。酶量大,酶液PH值：5.4 - 5.8 PH高，酶活性低 PH低，原生质体损坏多,2.3 酶液渗透压,裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对原生质体起保护作用。常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持渗透浓度。而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用。,2.4 材料预处理 (暗处理，预培养和低温处理) 在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，预质壁分离约一小时后再用酶液处理。 原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。,2-6 其它,酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类,保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力,2-5 酶解处理的条件光：一般黑暗下静止进行；温度：25，兼顾原生质体及酶活性；时间：几小时到几十小时，太长不利于原生质体的活性，一般24小时。如烟草叶片酶处理2小时后叶肉细胞解离完毕。,2-7 原生质体分离过程：一步法（以烟草叶片为例）,第一步：预处理即对烟草植株限制供水第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外表皮切成4cm的小块第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6第四步：将小块烟叶放入混合酶液25 处理810小时第五步：过滤、离心、洗涤（ 0.7 mol甘露醇液含0.1 m mol CaCl2 ）。如此23次、得原生质体,图示原生质体分离过程（以叶片为例）,（二） 原生质体纯化,酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。原生质体纯化方法有： 离心沉淀法 漂浮法 接口法,1、 离心沉淀法,原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。步骤：第一步：原生质体溶液用400目网筛过滤。第二步：离心（5001000r/min离心56min）。第三步：吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新悬浮，再离心沉淀。如此23次。第四步：用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。,洗涤液成分：0.45mol/L甘露醇， 10mmol/LCaCl2 H2O, 0.7mmolK H2PO4,洗涤液pH： 5.6,2 、 接口法,原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间。,3、 漂浮法,原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。洗涤液：3%蔗糖 + 0.4mol/L甘露醇+ 1480mg/LCaCl2 2 H2O 。或11%23%的蔗糖溶液。,原生质体分离纯化流程图,（三） 原生质体活力测定,1.孢质环流法2.FDA测原生质体活力的原理 （荧光素双醋酸酯）FDA 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。 一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原 生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光。,（四）原生质体培养,固体包埋培养液体浅层培养固液培养,1、固体包埋培养,原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖（37C左右）混合，培养于培养皿中。,1-1、饲养层培养,方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.6%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。,方法二：X-射线杀死原生质体，与0.6%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.6%琼脂混合，培养于饲养层上。,1-2、共培养法,将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合,前者为后者提供生长因素或成分未知但能促进生长的扩散型化学物质,2、液体浅层培养,3、固、液培养,培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。,固体培养基中的成分可以向液体培养中释放，培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收。,（五）原生质体再生（Regeneration）,再生细胞壁,荧光增白剂（卡氏白，Calcafluor White),细胞由圆形变为椭圆形,第二次分裂,第一次分裂,第二次分裂,第三次分裂,多细胞团,肉眼可见细胞团,愈伤组织,愈伤组织,三、原生质体融合原生质体融合：体细胞杂交，是以原生质体培养技术为基础，借用动物细胞融合方法发展和完善的一门新型生物技术。不同原生质体之间互相融合，发生胞质基因重组和/或核基因重组。,技术体系的3个环节：选择融合体；原生质体融合；杂种植株的再生和鉴定,1、原生质体融合意义,克服杂交不亲合克服生殖器官败育克服多胚现象,2、成 就,1972年 Carlson 建立第一株烟草体细胞杂种。1975年柑桔原生质体培养成功；现有苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；,番茄+马铃薯,3、融合方法,自发融合 (Spontaneous fusion)诱发融合(induced fusion)物理和化学方法,NaNO3高pH-高Ca离子PEG电场融合,3.1 NaNO3法,1909年：Kuster证实引起亚原生质体融合1970年：Power报道可重复控制原生质体融合1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。,NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高。,3.2 高pH-高Ca离子法,1973年：Keller和Melchers用pH10.5的50 mMCaCl2溶液在37时，诱发烟草叶肉原生质体融合。,优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用。,3.3 PEG法,PEG：Polyethylene Glycol（聚乙二醇）,1974年：Kao KN和Michayluk采用此法大大提高融合频率。1976年：Kao发现用高pH和高Ca结合融合频率更高。用高钙强碱溶液代替培养基清洗PEG。,PEG法特点：,融合频率高可重复性强,植物+植物植物+动物动物+酵母,诱发融合无特异性,毒性较低,PEG法原理,PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。,桥梁,示意图,3.4 电融合法,Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合,电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极，一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变电场的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一条链，再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。,电融合仪,电融合法原理,交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。,施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。,原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近；2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。,原生质体融合后的培养同原生质体培养,A.非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一亲本的少量核物质(12条染色体)和全部细胞质融合；B.细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因组结合在一起。,4、体细胞杂种细胞筛选,1互补选择法（两次不同培养条件的培养） 第一次培养：只适合于甲亲本而不适合乙亲本，一段时间后，生存下来的是：1)未经融合的甲亲本；2)甲甲融合的产物；3)有甲亲本基因存在的甲乙融合产物。 第二次培养：只适合乙亲本原生质体生长，甲原生质体死亡。 两次培养之后，能存活下来的只有具甲乙亲本基因并得到互补的杂种细胞。,异硫氰酸荧光素（FITC）绿色异硫氰酸罗丹明（RITC）红色,2. 荧光染料法两个亲本原生质体在融合前用能发不同颜色荧光的荧光染料进行染色。细胞分类器辨别和收集发两种荧光的异核体。,5、体细胞杂种的鉴定,形态学细胞学遗传标记,5-1、形态学,比较再生植株与融合亲本在形态上的异同株高、株型、叶片大小、形状、气孔的大小与多少，花的形状、大小及颜色。,5-2、细胞学,染色体形态和数目的比较,18条染色体,36条染色体,5-3、遗传标记,SSR （微卫星DNA分析 ）RFLP（限制性酶切多态分析）同工酶分析RAPD （随机扩增多态分析）AFLP,分析所鉴定植株是否具有融合亲本的遗传物质,再生植株同时具有亲本的带；再生植株在一种情况下具有一个亲本的带，在另一种情况下具有另一个亲本的带。,RAPD带型,RAPD带型,6、体细胞杂种的应用,培养抗病的新品种野生种的抗逆性转移到栽培种（马铃薯，烟草）果树上，砧木，接穗合成新材料远缘杂交，科间/属间，个体的育性问题。转移细胞质基因控制的性状。,作砧木应用,果树砧木是处于嫁接口以下的地下部分，砧木本身的果实性状对于地上部分的果实无什么影响，砧木要求抗性好，与地上部分亲和。,生产无籽柚,柚为我国特色水果，栽培面积已达百万亩，其中50%为沙田柚沙田柚品质佳，但不足在于种子多，最多可达120粒能能否生产无籽或少籽柚？,沙田柚，我国的柚子良种，种子多,沙田柚授以柑橘异源四倍体体细胞杂种花粉后结果状。,横切面,纵切面,对照果实,处理果实,对照种子,处理种子,筛选商用品种,NOVA + SUCCARI SOMATIC HYBRID FRUIT,pink marsh grapefruit + murcott tangorsomatic hybrid fruit,Succari + Minneola somatic hybrid fruits,