青蒿素分析方法的确定2021优秀课件.ppt

青蒿素分析方法的确定,青蒿素分析方法的确定,青蒿,青篙为菊科一年生草本植物黄花篙干燥地上部分，性寒，味苦、辛，归肝胆经，可清热解暑、除蒸、截疟，主要分布于重庆、四川、云南、广西等地。目前青篙素系列药物已取代奎宁成为治疗疟疾的最安全有效的药物。青蒿素是青蒿抗疟的有效成分，也是合成青蒿素系列药物的起始原料，它的需求量很大。,青蒿 青篙为菊科一年生草本植物黄花篙干燥地上部分，性寒,为什么要测定青蒿素的含量,不同产地的青蒿药材中青篙素的含量差异较大，而青蒿素是青篙截疟的主要有效成分，因此对药材中青篙素含量的准确测定十分必要。,提取青蒿素的溶剂：青蒿素C15H22O5 在丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷或苯中易溶, 在甲醇、乙醇、稀乙醇、乙醚及石油醚中溶解, 在水中几乎不溶解; 在冰醋酸中易溶。,为什么要测定青蒿素的含量 不同产地的青蒿药材中青篙素的含量差,青蒿素的有效成分,青蒿素是从黄花蒿中提取分离得到的含过氧基团的新型半萜内酯。其多种衍生物均是治疗疟疾的有效单体，国内外公认的首创新药。将青蒿素结构中的C-10为羰基还原成羟基得双氢青蒿素，进一步烷基氧化得蒿甲醚，而进行酯化可得到青蒿琥酯。,青蒿素 artemisinin,青蒿素的有效成分 青蒿素是从黄花蒿中提取分离得到的含过氧,双氢青蒿素为天然抗疟药青篙素经钠硼氢还原而产生的半缩醛化合物, 其12 位的羟基具有差向异构, 差向异构体a 与 在一定溶剂中有相互转化并达到平衡的过程。DHA 分子结构中无共扼结构和发色基团, 不宜用分光光度法或HPLC法测定含量。,双氢青蒿素dihydroartemisinin,双氢青蒿素,双氢青蒿素为天然抗疟药青篙素经钠硼氢还原而产生的半缩醛化合物,定性分析,定量分析,紫外分光光度法,IR、MS、NMR,HPLC(UV、ELSD、SPD.),UPLC,LC-MS/LC-MS-MS,高效毛细管电泳CE,TLC,定性分析定量分析紫外分光光度法IR、MS、NMRHPLCUP,1.1 青蒿素的IR定性分析,双氢青蒿素dihydroartemisinin,1.1 青蒿素的IR定性分析双氢青蒿素dihydroarte,3376 O-H;1227 C-O ;1025 C-O-C;2925 -CH3;总结：IR专属性强，一般做标准谱图对照法,3376 O-H;1227 C-O ;,1.2紫外分光光度法,原理：1.由于青蒿素药物分子结构中母核不具有共轭体系，其紫外吸收光谱的主要是末端吸收。但C-10位由于取代基不同具有一定的吸收特征。,2.青蒿素由于具有过氧桥和缩醛结构, 对酸碱不稳定, 对强碱极不稳定, 热至熔点以上即迅速分解。采用0.2%氢氧化钠50水浴加热30min 进行水解, 水解后的波长扫描结果显示青蒿素在紫外区有最大吸收峰Kmax=290.5nm, 由此确定最适波长为292nm。（青蒿素衍生化，酸化后亦可作HPLC-UV检测）,1.2紫外分光光度法原理：2.青蒿素由于具有过氧桥和缩醛结构,1.青蒿素标准品0.1g+95%稀释成0.001%的标准品溶液,1.青蒿素标准品0.1g+95%稀释成0.001%的标准品溶,2.0.001%标准溶液0.5 ml加入95% 乙醇4.5ml, 再加入0.2% NaOH 20ml定容至25ml, 50水浴加热30min, 取出快速冷却。,2.0.001%标准溶液0.5 ml加入95% 乙醇4.5m,3.分别取0.5、1.0、2.0ml 的.001%青蒿素标准溶液, 分别加入95%乙醇4.5、4.0、3.0ml, 再各加入0.2% NaOH 20ml定容至25ml, 配成浓度分别为210- 5%、410- 5%、810- 5%的标准溶液, 50水浴加热30min, 取出快速冷却, 在已经确立的最适波长下分别测吸光度。,3.分别取0.5、1.0、2.0ml 的.001%青蒿素标准,4.样液的制备取青蒿待测样品研细粉末0.5g, 加入95%乙醇10ml 浸泡, 50水浴加热60min 进行提取, 取出样品振摇、冷却、过滤, 取滤液1ml, 加入95%乙醇14ml, 再加入0.2% NaOH 10ml, 配制成青蒿素样品溶液,50水浴加热30min。在已经确立的最适波长下分别测吸光度,对浓度作图, 建立标准曲线。,4.样液的制备,青蒿素含量=( 青蒿素样品浓度标准浓度单位原始体积) / 青蒿研细粉末质量,朗伯比尔定律：A=-lgT=bc,b，一定，吸光度A和溶液浓度c成正比,青蒿素含量=( 青蒿素样品浓度标准浓度单位原始体积),UV法总结,UV法测定青蒿素是依据青蒿素在碱性条件下生成的青蒿素衍生物 Q292在292 nm波长处有较强的紫外吸收来定量的，其优点是操作简单，对仪器设备的要求不高，其缺点是不能排除青蒿素类似物等物质的干扰。因此，UV法测定青蒿中青蒿素的含量实际反映的是药材中青蒿素及其类似物的总量。陈靖等5报道，青蒿中青蒿素类似物青蒿酸、青蒿素B、3-羟基-1-去氧青蒿素的平均含量分别为0.47 、0.05、0.005，对青蒿中青蒿素含量的测定影响较大，使得测定结果偏高。,UV法总结UV法测定青蒿素是依据青蒿素在碱性条件下生成的青蒿,1.3 HPLC法,常见检测器:1. UV2. DAD（二极管阵列检测器）3. FD（荧光检测器）4. RID(示差折光率检测器)5. ECD(电化学检测器)6. ELSD（蒸发光散射器检测器）,原理：利用流动相与组分间的亲和力，通过组分、流动相和固定相三者间的相互作用来实现分离。,1.3 HPLC法常见检测器:原理：利用流动相与组分间的亲和,文献报道同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法有HPLC-UV-ECD法（高效液相色谱紫外电化学检测法）、HPLC-MS/MS法,采用ELSD法（蒸发光散射检测法）检测仅有很弱紫外吸收的青蒿素、UV法检测青蒿中含量较低的青蒿乙素和青蒿酸。,文献报道同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法有HPL,蒸发光散射检测器(ELSD) 为通用型的质量检测器, 对结构相似物质可给出几乎相同的响应因子,响应值大小取决于物质浓度及检测条件下物质颗粒的大小, 而不依赖于紫外吸收, 因此适合于青蒿素及双氢青蒿素的含量测定。,1.3.1 HPLC-ELSD法,蒸发光散射检测器(ELSD) 为通用型的质量检测器, 对结构,青蒿素分析方法的确定2021优秀课件,SPD(二极管阵列检测器)与ELSD 同时检测, 发现双氢青蒿素转化平衡后SPD图中。a异构体与异构体峰面积之比为4: 1 , 而ELSD 检测得。a异构体与异构体峰面积之比为8 : 1。因为E L SD 对结构相似物质能给出几乎一致的响应因子, 属于质量响应型检测器, 因此得到的峰面积比即为转化平衡后a异构体与异构体的实际物质量比。从而也可得知a与异构体对U V 的响应因子不同, 如用UV 检测则不能直接采用二者峰面积之和定量。,例：HPLC-ELSD 法测定复方双氢青篙素片中双氢青篙素的含量,SPD(二极管阵列检测器)与ELSD 同时检测, 发现双氢青,青蒿素分析方法的确定2021优秀课件,2.对照品溶液:取复方双氢青篙素片10 片, 剥去薄膜衣, 精密称定, 研细, 精密称取适量, 置25 m L量瓶中, 加乙睛适量,40 超声处理5 min。放冷至室温, 定容。摇匀, 滤过, 取续滤液2 mL 加水稀释至10 mL。,例：复方双氢青篙素片（含双氢青篙素32 m g , 磷酸呱哇0.32g , 甲氧苄啶90 m g )中青蒿素含量的测定,1.对照品溶液:精密称取D H A 对照品适量, 置50 m L 量瓶中, 加乙睛适量,40 超声处理5 min。放冷至室温, 定容, 即得1.28 m g/m L的对照品储备液。再精密量取此储备液适量, 用水稀释制成256 mg/m L的对照品溶液。,2.对照品溶液:取复方双氢青篙素片10 片, 剥去薄膜衣,ELSD检测器检测时少量溶解的甲氧苄啶峰及a异构体峰与异构体峰均能达到完全分离, 三者的分离度分别为2、8 和4, a异构体与异构体保留时间分别约为5 . 7 m in和7 m in , 理论板数按a异构体或异构体峰计均不低于6000。SPD扫描图谱显示最先流出的成分为甲氧苄啶, 与后面的a异构体及异构体完全分离, 不影响测定。,ELSD检测器检测时少量溶解的甲氧苄啶峰及a异构体峰与异构,1.3.2 HPLC-UV-ELSD,同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法,青蒿素只有很弱的末端紫外吸收,一般不用UV法进行精确定量分析,故选择用ELSD法检测。用ELSD法也可检测青蒿乙素和青蒿酸,但由于其灵敏度低,对这两个成分含量低的青蒿药材来说,该法同时测定3种成分较困难,故采用灵敏度较高的UV法对青蒿乙素和青蒿酸进行定量测定。UV检测器对所测成分性质无任何影响, 据此可使用HPLC-UV-ELSD同时测定青蒿中3种成分。,1.3.2 HPLC-UV-ELSD同时测定青蒿中青蒿素、青,色谱分析条件色谱柱: Nucleodur C18 ( 250mm 416 mm, 5m D) ; 流动相: 乙腈-0.1%乙酸(50 50) ; 流速: 110 mL/min ; 柱温: 25 青蒿乙素和青蒿酸用UV检测器检测, 波长为209nm; 青蒿素用ELSD检测器检测, 漂移管温度50 , 载气(N2 )压力30 p si ( 1 p si 619 kPa) , 增益值为50; 进样体积为10或30L。,色谱分析条件色谱柱: Nucleodur C18 ( 25,HPLC chromatograms of reference (A, B) and the extract from Herba Artemisiae Annuae (C, D).A, C: UV； B, D: ELSD; 1: Arteannuin B; 2: Artemisinin; 3: Artemisinic acid,HPLC chromatograms of referenc,1.2.2 RP-HPLC,1.常规的液相方法将青蒿素进行柱前衍生,将其与碱反应后, 产生一化合物( Q292), 该物质在292 nm处有最大吸收, 然而, 由于反应后有无机碱存在, 易损坏色谱柱, 不适宜直接进样测定。但化合物Q292在pH值5. 58 6. 04 条件下, 又可定量地转化为化合物Q260, 该物质在260nm 处有最大吸收, 可用于做HPLC 测定12。,2.又青蒿素在203 nm 处有弱吸收峰的性质，HPLC 法在203 nm 直接测定, 大多采用甲醇作溶剂稀释对照品, 使其在紫外区203 nm处有极弱的吸收, 其灵敏度及重复性均较差,(选用丙酮作溶剂, 在203nm 处有较强的吸收11)。,1.2.2 RP-HPLC1.常规的液相方法将青蒿素进行柱前,1.衍生化法13：色谱条件：色谱柱: LichrospherC18 ( 4. 6mm250mm, 5 Lm) ; 流动相: 甲醇-缓冲液(体积比50：50; 0. 01mo l/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液) ; 流速: 0. 8mL /m in; 柱温: 30 e ; 灵敏度: 2. 000 AUFS; 检测波长: 260 nm; 进样量: 20L。,1.衍生化法13：,2.末端吸收14色谱条件：色谱柱Kromasil ODSC18(416mm250mm, 5 m); 流动相为乙腈-水( 60：40); 流速为1.0mL/min; 检测波长为203nm; 柱温30。理论塔板数2000.,2.末端吸收14,1.2.4 LC-MS-MS,体内药物分析是测定体液(主要是血浆、血清或全血)中药物或其他代谢物浓度。由于血液样品试样提供量少，基质复杂，在此混合物中分析某种微量成分(通常为(g/mL或ng/mL水平)并加以鉴别，常常是对分析化学家的挑战。,药物的是用来预防、诊断及治疗疾病的一类特殊物质，与人们的健康和生命安危有极其密切的关系，杂质检查及其限度控制是保证药品质量的一个重要方面。使用LC-MSMS可以简便地对药物中杂质加以监控.,LC-MS虽然有足够的灵敏度，但遇到LC难以分离的组分，其应用受到限制。使用LC-MSMS可以克服背景干扰，通过MSMS的选择反应控制模式(SRM)或多反应检测模式(SRM)，提高信噪比，因此对复杂样品仍可达到很高的灵敏度。,1.2.4 LC-MS-MS体内药物分析是测定体液(主要是血,分析条件色谱条件色谱柱为RESTEK Pinnacle C18 柱(150 mm 2. 1 mm , 5m) ; 流动相为甲醇-水-10 mmol/L乙酸胺( 80: 10 :10 ) ; 流速200l/min ;柱温:室温。质谱条件电喷雾ESI 源; 喷雾电压IS 为4 000 V;雾化温度400 ; 雾化气NEB ( GAS1) 为12 Lmin - 1 ;加热辅助气AUX( GAS2) 为7 L/min ;帘气CUR 为6 Lmin - 1 ;碰撞气CAD 3Lmin - 1 ;检测方式为正离子多离子反应监测(MRM) ,用于定量分析的离子分别为m/z 302. 3 m/z 163. 3 (DHA) 和m/z 300. 2 m/z 209. 3(内标ART),高液相色谱-质谱联用法测定人血浆双氢青蒿素浓度24,分析条件高液相色谱-质谱联用法测定人血浆双氢青蒿素浓度24,在选定的检测条件下,DHA 和内标ART 生成的基峰离子为其加NH4+ 离子M +NH3 + ,将其基峰离子作为母离子进行产物离子扫描分析,得到二者的全扫描及子离子扫描图。,在选定的检测条件下,DHA 和内标ART 生成的基峰离子为,根据DHA 离子扫描图,在选定的检测条件下,离子对mPz 302. 3 m/z 267. 1响应明显高于m/z 302. 3 mPz 163. 3 ,但该离子对的测定易受到血浆内源性物质的轻度干扰,为定量准确,选择离子对m/z 302. 3 m/z 163. 3 用于定量分析,不受基质效应的影响。,根据DHA 离子扫描图,在选定的检测条件下,离子对mPz 3,LC-MS/MS 测定血浆双氢青蒿素(DHA) 的色谱图,A:空白血浆,LC-MS/MS 测定血浆双氢青蒿素(DHA) 的色谱图A,B :空白血浆加DHA(3. 03 ngml - 1) 和内标,1 :DHA双氢青蒿素; 2 :内标ART青蒿素,B :空白血浆加DHA(3. 03 ngml - 1) 和,C:受试者药后血浆样品加内标,C:受试者药后血浆样品加内标,1.3.5 UPLC,与传统的HPLC 相比，UPLC 的速度、灵敏度及分离度都比HPLC 要高。例：UPLC-UV测定青蒿素的含量26,色谱条件：色谱柱: Agilent Eclipse Plus C18( 2. 1 mm 50mm，1. 8 m) ; 流动相: 乙腈 水( 45 55) ; 流速:1. 0 mL /min; 柱温: 28; 检测波长: 200 nm; 进样体积: 1 L。,1.3.5 UPLC与传统的HPLC 相比，UPLC 的速度,青蒿素分析方法的确定2021优秀课件,1.4 毛细管电泳,毛细管电泳法(CE) 具有高效、快速、样品用量小、耗费少等优点,已被广泛用于药物分析。CE 电化学检测具有装置简便易行、价廉、检测灵敏度较高的优点，它的性能在分离许多生化物质上要优于一般的色谱法。,带电粒子,与aq中电荷结合带电,水解带电,E,定向运动,电渗流,1.4 毛细管电泳毛细管电泳法(CE) 具有高效、快速、样品,CE工作原理,3-毛细管 4-检测器,CE工作原理3-毛细管 4-检测器,分离条件：分离介质4. 0 mmol/ L 三乙胺-2. 0 mmol/ L H3BO3-15. 0 % C2H5O H ,分离电压22. 0 kV ,20. 0 cm 位差虹吸进样15. 0 s。在该实验条件下,可在5 min 内实现对双氢青蒿素的分离检测,双氢青蒿素的峰面积与含量在3. 0165g/ mL 范围线性关系良好,检出限为1. 0g/ mL 。,例：复方双氢青蒿素片中双氢青蒿素的测定28,复方制剂中的其他成分在该条件下并不出峰,故不干扰测定,可能是在优化条件下难以电离的缘故采用毛细管电泳非接触高频电导法对双氢青蒿素进行了快速分析。,分离条件：例：复方双氢青蒿素片中双氢青蒿素的测定28复,双氢青蒿素标准品,1. DQHS ; 2. C2H5OH,双氢青蒿素标准品1. DQHS ;,双氢青蒿素复方片剂样品,双氢青蒿素复方片剂样品,配制一系列不同浓度的双氢青蒿素标准溶液,在优化条件下考察线性范围和检出限。求得双氢青蒿素的峰面积Y与浓度X的线性回归方程。,配制一系列不同浓度的双氢青蒿素标准溶液,在优化条件下考察线性,文献引用,1廖巧，龙世平，杨春贤.青蒿素提取与检测工艺的研究进展;安徽农业科学,2012，40( 28) : 13736 13739.2李春莉, 王莎莉, 王亚平, 柯大智.紫外分光光度法测定青蒿素的含量;重庆医科大学学报2007 ,32 (4 ),41.3马玉樊, 卢婷利 , 陈 涛等.紫外分光光度法测定OPW 型青蒿素脂肪乳剂中青蒿素的含量；分析试验室2007，26增刊，184.4魏增云，陈金娥等.正交设计-紫外分光光度法测定青蒿中的青蒿素；光谱实验室，2011，28（3），1297.5陈靖，赵瑞，陈俊，等.HPLC-UV-ELSD 联用测定黄花蒿叶片中青蒿素及相关倍半萜的含量J.沈阳药科大学学报，2008，25（11）897.6李美琴, 范琦 , 张晓松药物分析杂志.H PL C 一E L SD 法测定复方双氢青篙素片中双氢青篙素的含量;2006, 2 6 (8 ),1163.7张东, 杨岚等.HPLC-ELSD测定青蒿素片中青蒿素的含量;中国药学杂志2008,43 (7 ),491.8张东, 杨岚等,HPLC2UV2ELSD法同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙素和青蒿酸的含量,药学学报,2007, 42 (9) ,978 - 981.,文献引用1廖巧，龙世平，杨春贤.青蒿素提取与检测工艺的研,85.要先打败任何事情得先学会打败自己。2.让生活的句号圈住的人，是无法前时半步的。40.坚强，不是面对悲伤不流一滴泪，而是擦干眼泪后微笑着面对以后的生活。9. 好运不会总是降临在你身上，你的努力是唯一能让你站住脚跟的依靠。83.松驰的琴弦，永远奏不出美妙的乐曲。92.曾有人这样定义坎坷：”它常常横在人生道路上，考验人们的意志。“坎坷会把弱者跌得一蹶不振，而对于强者，它却是借以登上理想巅峰的台阶。面对成长，勇敢地去接受它吧，不要“无为空自老，含叹负平生”。92.为了成材，松树从不向四季如春的温室外献殷勤。61.命运如同手中的掌纹，无论多曲折，终掌握在自己手中。6.你不能拼爹的时候，你就只能去拼命！74.出发，永远是最有意义的事，去做就是了。2.让生活的句号圈住的人，是无法前时半步的。41.过去的已经一去不复返了，再怎么悔恨也是无济于事。未来的还是可望而不可及，再怎么忧虑也是会空悲伤的。今天心今日事和现在人，却是实实在在的，也是感觉美好的。74.在茫茫沙漠，唯有前进时的脚步才是希望的象征。93.讨厌自己明明不甘平凡却又不好好努力。45.每个牛逼的人，都有一段苦逼的坚持。29.比我优秀的人都还在努力，我有什么资格说放弃。26.穿透石头的水滴，它的力量来源于日积月累。6.我们都在时光里跌跌撞撞的成长，然后一点点离开最初的模样。42.生活中难免遭遇打击。但是，真正能把你击倒的是你的态度。8. 用乐观的心态迎接困难，因为能打败你的，只有你自己。,85.要先打败任何事情得先学会打败自己。,