神经生物学实验课件.ppt
神经束路追踪技术辣根过氧化物酶法,神经束路追踪技术是利用神经元轴浆运输（axoplasmic transport）现象的示（追）踪法，主要用于研究神经元间广泛的神经纤维联系。轴浆运输包括从胞体向轴突及其终末的顺行运输和从轴突及其终末向胞体的逆行运输。,神经束路追踪法主要有辣根过氧化物酶示踪技术、荧光素示踪技术、同位素示踪技术及顺行示踪技术等。目前较常应用辣根过氧化物酶法进行神经束路追踪，本章对其作重点介绍。,1971年Kristenson和Olsson首先报道HRP可被神经末梢摄取，经逆行轴浆运输至神经元胞体后，可用组织化学方法显示胞体的位置，从而创建了辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）追踪神经元法。,HRP法是基于神经元轴浆运输的生理现象，即将HRP注射至中枢神经系统或周围神经的一定部位，HRP可被神经末梢以胞饮的方式摄入，逆行运送至胞体，经过一定时间后取相应的部位固定、切片，然后用组织化学方法显示HRP的标记。,该方法的问世，得到神经科学界的高度评价。它结束了自Marchi（1886年）开始长达近一个世纪的唯一用银染法追踪选择性溃变纤维的年代，在神经束路及其功能的研究中具有划时代的意义。,HRP的特性：,HRP是是从辣根中提取出来的一组同功酶的混合物，为糖蛋白，含有其组织化学活动所必需的正铁血红素族，在H2O2作用下催化某些化合物（成色原）而氧化产生可见的反应物。分子量为40，000道尓顿，分子半径约为3.0nm。,HRP的细胞外给药法：,加压注射法 微量注射器或微玻管注射，常用。离子透入注射法 离子透入技术是以负载电荷的化学分子或示踪剂注入组织的方法。,HRP的结合与扩散:,终末摄取 电镜显示，注入HRP后，依次出现于胞饮小泡、膜性囊和小管以及多泡体和致密体内。较长时间后， HRP从这些成分中消失，说明这些细胞器与示踪剂的结合、存储及溶酶体降解有关。 由神经终末摄取的HRP直接与它的突触活动有关。,轴索摄取 轴索暂时受损（如注射区）或经挤压与切断而受到严重损伤时，即可摄取HRP并填充于损伤处的远端和近端。逆行性轴索输送 通过细胞器经轴索逆行运输到神经元胞体，与微管的完整性有关。,胞体摄取与顺行性轴索输送 神经元胞体直接摄取HRP的现象几乎发生于注射区或其附近，或在高浓度HRP处的神经元。,HRP输送到细胞体的命运 HRP标记的微管、小囊和小泡被运送到胞体并积聚于核周质高尔基复合体附近，即互相融合成较大的结构（如溶酶体），最后全细胞及树突都为HRP溶酶体所充满。 早在HRP被输送到胞体的前三天，由于溶酶体降解作用而使HRP含量显著减少，在4-8天大部分溶酶体内已无HRP。,HRP示踪的常用方法（TMB法）,基本原理： 神经组织的冰冻切片或振动切片在含H2O2的TMB（四甲基联苯胺)溶液中孵育，组织内之HRP与H2O2结合成（HRP-H2O2）络合物，此络合物可氧化供氢的TMB，使之形成深兰色沉淀物，沉积在HRP周围。,TMB法特点： 灵敏度高，产物在光镜下易观察，于明视野下颗粒呈蓝至深蓝色，暗视野呈金色；不宜电镜检查。改良TMB法可避免其缺点（反应产物过度的结晶形成、反应的不稳定性、易褪色消失等）。,实验步骤：,麻醉动物 导入HRP 动物存活 灌注固定 取材 切片 组织化学反应 显微镜观察,1.麻醉大鼠：2%戊巴比妥（40mg/kg)腹腔注射。麻醉不宜过深，以免苏醒过慢，影响HRP被神经元摄取及在其内的运输。2.注入HRP：动物麻醉后，分离坐骨神经，用微量注射器将1%CB-HRP(霍乱原B亚单位结合辣根过氧化物酶）2.5ul,缓慢注入坐骨神经。注射后原位留针10min，缝合切口，将大鼠置于原环境中继续存活。3.存活期：指HRP注入后，动物需存活一段时间，以利于HRP的摄取、运输及积累。存活期的长短依赖于运送速度、运送距离及胞体内HRP在溶酶体的降解速度，一般为24-72小时。,4.灌注固定：动物麻醉同前，开胸，经左心室-主动脉插管，灌注温的（37）生理盐水冲洗血液至液体清亮，约100 ml。 再灌注冷的固定液（1%多聚甲醛和1.25%戊二醛的0.1mol/l磷酸盐缓冲液，PH7.4， 4C)，约500ml ,30分钟。灌注后用含10%蔗糖的0.1mol/l PBS100ml冲洗。,.取材：取脊髓，切成小块，放入含25%蔗糖的0.1mol/l PBS（ PH7.4）于4 冰箱过夜。.切片：待脊髓在蔗糖液中沉底后，标本以磷酸缓冲液略洗，冷冻切片机冠状切脊髓，厚15-20um，贴于多聚赖氨酸载玻片上，回至室温凉或烘干 。.后固定：切片入丙酮溶液固定10min，蒸馏水冲洗23次，每次23min。,.预浸：入20预孵育液，在避光条件下，恒温孵育20 min 。 预孵育液：500mg钨酸钠溶解在23.5ml 蒸馏水中，过滤，后加入0.2mol/l的PBS25ml及1NHCL0.75ml，搅拌混匀，呈色反应前加 TMB液(TMB3.5mg用0.25ml丙酮溶解后，加0.5ml无水乙醇）。,.呈色反应：呈色开始时，于反应液中加入 0.3%H2O2 0.35ml，以后每 10min 加0.35ml 在避光条件下反应，历时1小时。10.清洗：反应结束用0.05mol/lPB洗4-6次，每次2-3min。,11.复染：切片经苏木素短时复染。12.封片：切片经蒸馏水漂洗30s，再用70%、80%、95%酒精逐级脱水各1min，二甲苯透明两次，共4-10min，树胶封片。13.镜检：光镜下观察染色结果。,注意事项： 1. HRP运输到预定部位的时间取决于传送速度及距离。传送速度因动物的种类及纤维系统而有不同，故每组实验必须具体试验以求最佳动物存活期，一般23天比较合适。而时间过长，HRP可被胞体内的溶酶体逐渐破坏水解。,2.注射HRP必须缓慢，原位留针，缓慢退针。3.固定液必须新鲜，特别是戊二醛必须在临灌注时加入，一次用完。4.孵育时需保持恒温20且避光条件。预孵育液临用时配。,实验结果：CB-HRP 的反应产物在明视野下呈青兰色,标记的细胞和轴突的形态悦目细腻。逆行标记的细胞胞体和突起中的反应产物呈均质性或排列极为密集的小颗粒,神经元胞体结构清晰。,TH酪氨酸羟化酶,辣根过氧化物酶示踪法,HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat,HRP labelling neurons in dLGN（背外侧膝状核）,Double-labelling of HRP and Glutamate in rat lateral geniculate nucleus （外侧膝状核）,HRP法的优缺点,优点： 1.HRP法能在混合的神经元总体内定位它所起源的特异性细胞。 2.用新近的HRP技术，灵敏度高，耗时短。,3.如用DAB作成色剂，可供电镜镜检。4.无论是单用或与其他方法相结合，HRP法都可用于追踪侧支投射。还可成功地结合多种组织化学法以显示与递质有关的酶类。,缺点： 1.难确定有效注射部位 2.几种常规使用的成色剂都有致癌性,THANK YOU!,
