色谱分析法概述分析化学ppt课件.ppt
色谱分析法概述,广西医科大学药物分析教研室,2022/11/24,2,色谱法chromatogrphy,是一种重要的分离、分析技术,混合试样分离单组分 检测定性、定量分析,2022/11/24,3,色谱法的创始人俄国植物学家茨维特(M.Tswett),1903年月日在华沙自然科学学会生物学会上，他宣读了论文：On a new category of adsrption phenomena and their application to bichemical analysis.年后，命名此法为chramatography ，多年后才得到应用,色谱法的由来,在茨维特的实中：装有CaCO3的玻璃管 色谱柱 CaCO3 固定相 纯石油醚 流动相,色谱法的由来,在该实验中，碳酸钙上混合色素被分成不同色带的现象，像一束光线通过棱镜时被分成不同色带的光谱现象一样，因此茨维特把这种现象称为色谱，相应的分离方法称为色谱法（色层法，层析法）,2022/11/24,6,2022/11/24,7,Tiselius, A.W.K. Martin, A.J.P. Synge, R.L.M. 1948年 Nobel 化学奖 1952年 Nobel 化学奖 吸附色谱与电泳 分配色谱,2022/11/24,8,色谱法是一种分离技术; 试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相; 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。,1、色谱法的定义,色谱法定义：利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如溶解性、吸附力、分子形状及大小、极性、分配系数等）而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。,2022/11/24,9,2、色谱法的特点,(1)分离效率高 复杂混合物，同系物、异构体、手性异构体。(2) 灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。(3) 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。(4) 应用范围广 (5)不足之处：被分离组分的定性较为困难。需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS,2022/11/24,10,1931年 库恩 奥地利化学家 胡萝卜素植物色素分离20世纪30年代 离子交换色谱建立1940年 吸附色谱与电泳相结合1941年 分配色谱创立1952年 气相色谱法建立1968年 高效液相色谱法建立1975年之后 离子色谱、超临界流体色谱、高效毛细管电泳、场流动分级分离,2022/11/24,11,Tiselius, A.W.K. Martin, A.J.P. Synge, R.L.M. 1948年 Nobel 化学奖 1952年 Nobel 化学奖 吸附色谱与电泳 分配色谱,2022/11/24,12,色谱法的特点,优点：“三高”、“一快”、“一广”,缺点：,2022/11/24,13,第一节色谱过程的基本原理,一、色谱过程二、色谱流出曲线和有关概念三、分配色谱与色谱分离,1.互不相溶的两相（流动相、固定相）； 2.被分离组分在两相之间作相对运动,一、色谱过程,2022/11/24,15,色谱分离过程实验,色谱柱,色谱,混合物,固定相,流动相,色谱法实质是分离,分离依据： 各组分在两相之间作用力不同(吸附能力分配系数离子交换能力大小排阻能力其他亲合作用)各组分差速异行分离,一、色谱过程,填充柱分配色谱分离过程,一、色谱过程,以吸附色谱为例 吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离,2022/11/24,18,A与B两组分在色谱柱内： 吸附解吸再吸附再解吸向下移动。 由于A、B二组分存在着理化性质的差异，因而吸附剂对它们的吸附能力不同，在柱中随流动相迁移的速度也就不同。经一段时间后，两组分就可以彼此分离。 如果吸附剂对A吸附能力弱 则A易被流动相洗脱 结果A先流出色谱柱。,2022/11/24,19,差速迁移固定相对被分离各组分有不同的吸附（or溶解）能力，而各组分在流动相中又有不同的溶解度，导致它们在柱内的移动速度不同由（开始）本来只有微小差异的各组分，通过成千上万次的吸附（溶解）解吸（分配），各微小差异累加起来，最终达到各组分的完全分离,一、色谱过程,2022/11/24,20,第一节色谱过程的基本原理,一、色谱过程二、色谱流出曲线和有关概念三、分配色谱与色谱分离,2022/11/24,21,二、色谱流出曲线和有关概念,色谱流出曲线和色谱峰色谱流出曲线基线色谱峰对称因子,2022/11/24,22,一流出曲线和色谱峰,色谱图 被分析试样从进样开始，经 色谱柱分离，到各组分全部流过检测器 在此期间所记录下来的响应信号随时间而变化的曲线（分布的图像），称为色谱流出曲线或色谱图。,基线 在色谱操作条件下仅有流动相通过检测器时，反映检测器噪声随时间变化的曲线。 稳定的基线是一条直线。,色谱峰 在一定色谱条件下，组分通过检测器时，响应信号随时间而变化的曲线称为色谱峰。 色谱过程按近理想条件和分配系数恒定时的流出曲线为对称的高斯分布曲线，对应的高斯分布函数为：,色谱流出曲线和色谱峰,2022/11/24,26,不正常色谱峰有两种：判断一个色谱峰是正常还是不正常，用fs衡量：(拖尾峰与前延峰) fs 0.05h2A=(A+B)/2A fs =0.95 1.05为对称峰 0.95 为前延峰 ； 1.05 为拖尾峰.,2022/11/24,27,色谱保留值 表明色谱峰在色谱图中的位置（可用时间t、体积V、距离d表示）。它是由色谱分离过程中的热力学因素所决定的。,2022/11/24,28,保留值的定义1.保留时间 从进样开始到色谱峰最大值出现时所需的时间,2022/11/24,29,保留值的定义2.死时间 不被固定相保留的组分(K=0)，从进样开始到色谱峰最大值出现时所需的时间 。 实际上为流动相流经色谱柱所需要的时间：,柱长（cm),流动相平均 线速度(cm/s),2022/11/24,30,保留值的定义3.调整保留时间 组分的保留时间与死时间之差,2022/11/24,31,保留值的定义 4.保留体积 从进样开始到色谱峰最大值出现时所需通过的流动相的体积 5.死体积 6.调整保留体积,在LC中为实测值（mL/min),在GC中为校正到柱稳住压下的平均流速,2022/11/24,32,7.相对保留值 某一组分与基准物质的调整保留值之比：,1.峰高 从色谱峰顶点到基线的距离,峰的形状,色谱峰区域宽度两个拐点E和F之间的距离为 EF= ，分别位于态 处。,标准差（）：正态分布曲线上两拐点间距离之半,区域宽度2.半峰宽 峰高一半处的宽度GH,2022/11/24,36,3.峰宽（）通过色谱峰两側的拐点作切线，在基线上的截距称为峰高 或1.699W1/2,4.峰面积 A 色谱峰与基线延长线所包围的面积，精确计算时,2022/11/24,37,分离度（R）: (tR2 - tR1) 当R1.5时，两个组 (W1 + W2) 分可完全分离。,W1,W2,tR1,tR2,R =,（五）分离度（）,2022/11/24,38,计算公式为：R值越大，相邻两组分分离得越好理论证明：两峰分离程度 0.75 50%0.80 89%1.00 98%1.50 99.7%,2022/11/24,39,2022/11/24,40,a. 色谱峰个数 判断试样中所含组分的最少数 b. 色谱保留值 定性 c. 色谱峰面积或峰高 定量 A = K C d. 保留值与峰的宽度 评价柱分离效能依据 e. 两峰间距 评价两组分能否分离,（4）色谱图的信息,2022/11/24,41,三、分配色谱和色谱分离,2022/11/24,42,（一）分配系数和容量因子,分配系数（）:是指在一定的温度和压力下，达到分配平衡时,组分在固定相（S）和流动相（m）中的的浓度（C）之比。,2022/11/24,43,K的影响因素,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。,2022/11/24,44,2.保留因子,在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：,容量因子不仅与温度和压力有关，而且还与固定相和流动相的体积有关,保留因子也称： 容量因子(capacity factor)；容量比(capacity factor)；,2022/11/24,45,1. 分配系数与保留因子都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。 2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。3.保留因子可以由实验测得。,2022/11/24,46,分配系数和容量因子与保留时间的关系设流动相的线速度为，组分的速度为，二者之比称为保留比：在定距展开中， tR， t因此：,2022/11/24,47,死时间t近似于组分在流动相中的时间t而溶质分子只有出现在流动相中时才能随流动相前移，故保留比与溶质分子在流动相中的分数有关：所以：,2022/11/24,48,由式（16-15）和式（16-16）得：或上二式叫色谱过程方程，表示保留时间与分配系数（）及容量因子（）的关系,2022/11/24,49,由式（16-17）还可以得：容量因子（）可通过实验测得容量因子表示组分与固定相的作用，大则保留时间长,2022/11/24,50,（三）色谱分离的前提设组分与的混合物通过色谱柱，若两者能被分离，则它们的迁移速度必须不同，即保留时间不等根据式（16-18）有：两式相减得：可见，若使必须使，即分配系数不等是分离的前提,2022/11/24,51,第二节基本类型色谱方法及其分离机制,2022/11/24,52,色谱法分类,按两相状态分,2022/11/24,53,色谱法分类,按分离过程机制分 吸附色谱法利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差异分配色谱法组分在两相中分配系数不同 离子交换色谱法利用离子交换原理 排阻色谱法利用多孔性物质对不同大小分子的排阻作用 等等,2022/11/24,54,色谱法分类,按操作形式分,吸附柱色谱 分配柱色谱柱色谱离子交换柱色谱 凝胶柱色谱2. 按操作形式分 纸色谱 平面色谱 薄层色谱,2022/11/24,55,色谱法分类,附：根据所使用的技术不同分 高效液相色谱(HPLC) 化学键合相色谱 衍生气相(液相)色谱 裂解色谱 顶空气相色谱 色谱制备 色谱分析,2022/11/24,56,二、基本类型色谱法的分离机制,基本概念：固定相（s）；流动相（m）,（一）吸附色谱法（二）分配色谱法（三）离子交换色谱法（四）空间排阻色谱法,2022/11/24,57,（一）、分配色谱法,要求： 固定相机械吸附在惰性载体上的液体 流动相必须与固定相不为互溶 载体惰性，性质稳定， 不与固定相和流动相发生化学反应正相色谱流动相的极性弱于固定相的极性反相色谱流动相的极性强于固定相的极性,2022/11/24,58,Stationary phase Mobile phase,分离机制 利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离,2022/11/24,59,分配系数（）（s）即： （m） 值越大，组分在柱中的移动速度越慢，停留时 间越长，后流出色谱柱。故各组分之间相差越大，就越易被分离。,2022/11/24,60,洗脱顺序洗脱顺序是由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定一般而言：正相色谱的洗脱顺序为弱极性的组分先被洗脱（先出峰），强极性的组分后被洗脱（后出峰）反相色谱的洗脱顺序与之相反,2022/11/24,61,二、吸附色谱法分离原理此法利用被分离组分对固体表面活性吸附中心吸附能力的差别而实现分离,2022/11/24,62,图示,分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离,吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开 back,2022/11/24,63,吸附作用与吸附平衡）吸附作用：固体吸附剂是一些多孔性物质，表面上有许多吸附点位或吸附中心，吸附作用主要发生在这些中心上）吸附平衡：为样品中的溶质分子表示流动相分子二者与吸附剂的表面活性中心发生竞争性吸附，当达到平衡时：,2022/11/24,64,Xm +n Yaa +n Ym a Ymn Ka= mYan 式中： Ka为吸附平衡常数，n 表示一个分子所要解吸的分子数目（n=1 ，） Ka大：易吸附，难洗脱，保留时间长，出柱慢 Ka小：难吸附，易洗脱，保留时间短，出柱快,2022/11/24,65,固定相和流动相吸附色谱的固定相多为吸附剂，是多孔性微粒状物质，具有较大的比表面积，在其表面有许多吸附中心如硅胶，表面的硅醇基为吸附中心流动相多为溶剂（或二元以上的混合溶剂）流动相洗脱能力由其极性决定强极性流动相其洗脱能力强，使组分的值小，保留时间短（先出峰）溶剂的洗脱能力用Snyder提出的溶剂强度表示，见表16-1,2022/11/24,66,洗脱顺序在液固吸附色谱中，在色谱柱一定（与一定）时，大的组分在吸附剂上保留强，后被洗脱，而小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型等）有关详见书p363中、,2022/11/24,67,三、离子交换色谱法分离原理此法利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离阴离子交换树脂固定相离子交换树脂阳离子交换树脂例如： 交换H+ Na+ a+ + H+ 洗脱,2022/11/24,68,分离机制： 依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同而实现分离 back,2022/11/24,69,四、空间排阻色谱法在上面介绍的三种液相色谱法中，它们的分离 原理都是由于不同组分与固定相的作用力大小不同，造成了组分的差速迁移，但在此法中分离原理截然不同，在这种分离方式中，组分分子和固定相之间不产生任何作用力。只是根据分子体积大小来分离混合组分的见下图：,2022/11/24,70,2022/11/24,71,进样后 洗脱时 小分子进入内部孔穴 后 流 出 中分子部分进入 中间 流出 大分子不能进入 先 流 出 固定相各类凝胶（如：葡萄糖凝胶） 主要应用：在医药，生化领域分离大分子物质，如：蛋白质，氨基酸，肽类以及多糖等。,2022/11/24,72,空间排斥理论的二条假设： 孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态：m X s 平衡时：Kp = X S / Xm Kp为渗透系数（Permeation coefficient）,2022/11/24,73,Kp的大小只由溶质分子的线团尺寸及凝胶孔隙的大小决定在凝胶孔经一定时：）当分子大到不能进入凝胶的所有孔隙时，那么， X S ，则Kp ）当分子小到能进入所有孔隙时， X S Xm， Kp ）当分子尺寸在上述两种分子之间时，有：Kp故： Kp 分子量,2022/11/24,74,第三节色谱法基本理论,一、塔板理论此理论由Martin and Synge于1941 年提出该理论把整个色谱柱看作为一个分馏塔四点基本假设：）在柱内一小段高度内，组分可以很快在两相中达到分配平衡称为理论塔板高度2 ）载气通过色谱柱不是连续前进，而是间歇式的，每次进气为一个塔板体积3 ）样品和新鲜载气都加在第号塔板上，且样品的纵向扩散可以忽视4 ）分配系数在各塔板上是常数,2022/11/24,75,2022/11/24,76,（一）质量分配与转移塔板模型的分配过程举例（单一组分）符号说明：n=5（表示仅有5块塔板） r（塔板号）=0 、1、 2 （n-1）代表脉冲式进入柱内载气的板体积数k=1即Ws/Wm=1或p/q=1 m=1 表示单位质量的组分（mg 或 1g ）,2022/11/24,77,2022/11/24,78,2022/11/24,79,从上例n=5的色谱流出曲线中，我们可以看出它的峰形很宽且拖尾，这是因为仅仅以5块塔板数为例进行分析的结果而实际上，一根色谱柱的塔板数多达103106，即分配次数是103106 次因此，即使混合物中组分的分配系数差异很小，也可获得很好的分离效果,2022/11/24,80,二项式分布 可以用二项式定理来计算各塔板中组分的 度即；每进一次载气后，各塔板内溶质含量的 分布情况（pq ）式中：p、 q为时第号塔板上固定相和载气中溶质的含量例如：当k时，我们计算进气三次后各塔板内的溶质含量（p+q）p3+3p2q+3pq2+q3 （0.5+0.5）3= 0.125+0.375+0.375+0.125 相应塔板号0号 1号 2 号 3号,2022/11/24,81,通式：（二）流出曲线方程上述二项分布，绘制的流出曲线为不对称的二项分布曲线如果一根色谱柱塔板数在103以上，流出曲线趋向于正态分布曲线因此可用正态分布方程式来讨论流出曲线上组分浓度（）与时间（t）的关系,2022/11/24,82,为被分离组分的浓度，即组分的总量从公式可以看出：当t=tR时，式中e的指数为，此时浓度最大，用max表示max即流出曲线的峰高（h），将h及W1/2=2.355代入得 A=1.065 W1/2 h,2022/11/24,83,此式为流出曲线方程式的常用形式显而易见：无论t tR 或 t tR ，恒有C Cmax 随时间t 向峰两側对称下降，下降速率取决于， 越小，峰越锐,2022/11/24,84,（三）理论塔板高度和理论塔板数如果知道了n和柱长，那么：n tR及（）须用同一单位（时间min 与 s 或 距离cm）例子见书,2022/11/24,85,在同一根色谱柱上，如果样品是一混合组物，则各组分有各自的 n 与H 实际工作中，按上式计算出的 n 尽管很大，H很小，然色谱柱的分离效能并不好为什么呢？因为tR包括了t而t 是没有参加分配的时间，为了更难切合实际：,2022/11/24,86,n（neff）大 对分离有利，柱效高（因为在柱内分Heff 小配次数多）但仅根据n的大小不能预言物质对能否被分离只有k2k1才是分离的先决条件附：塔板理论之评说,2022/11/24,87,（5）关于塔板数计算的几个问题a. n 是人为概念，不同方法测得的塔板数相差很大，但它有用为比较相似色谱柱或制备柱时的技术好坏建立了标准 b. n不仅决定于组分及两相的性质，还与一系列操作条件有关因此 比较柱效能时，必须指定组份、固定相及含量、柱温、流动相及速度、进样量等。c. 不同组份在同一柱上，k值大的，n值较大 。d. 不对称色谱峰，计算会产生较大误差，可达到1020%，峰愈近正态分布，误差愈小。e. 检测器响应与浓度应有线性响应，否则n值不真实。f. 计算n时，保留值与峰宽应有相同单位。,2022/11/24,88,6） 对塔板理论评价成功： a. 解释色谱流出曲线形状（呈正态分布） b. 浓度极大点位置 c. 评价柱效应能高低的塔板数计算存在问题：a. 不能说明板高的影响因素 b. 色谱宽变宽原因 c. 不能解释不同流速的 n 值不同 假定与实际不相符引起,2022/11/24,89,二、速率理论（动力学理论） 荷兰科学家Van Deemter 于1956年提出，他承认并吸收了H的概念，从动力学基础上较好地解释了影响的各种因素色谱过程不仅是一个分配平衡的过程，还与分子的扩散运动等有关范氏方程：式中：为涡流扩散项u为纵向扩散项u为传质阻力项u为载气线速度cm.s-1.,2022/11/24,90,涡流扩散项（或多径扩散项）dp填充不规则因子，填充越不规则，越大 dp填充物颗粒的平均直径多经扩散对峰展宽的影响图因此，使用适当细粒度和颗粒均匀的担体，并尽可能填充均匀，可以降低，提高柱效,2022/11/24,91,2纵向扩散项u（分子扩散项）当样品组分以“塞子”形式注入色谱柱后，由于“塞子”前后存在着浓度梯度，运动着的分子一定向低浓度的纵向扩散，从而引起峰扩散决不会静止不动，一定要扩散1.00 然而，马丁的塔板理论假设中并没有考虑这一动力学因素，,2022/11/24,92,B= g 式中： 为弯曲因子，填充柱 1，毛细管柱Yg为组分在气相中的扩散系数 g 受以下因素影响：）分子量大的组分：g 小）g与载气的分子量的平方根成反比载气g，g ）柱g ）柱g ,2022/11/24,93,3. Cu项（传质阻力项）为传质阻力系数传质试样组分的分子在气、液两相中溶解，扩散，分配的过程简而言之： （质量传递） 组分从气相进入液相要受到一定的阻力 组分（已进入到液相）返回到气相也有一定阻力,2022/11/24,94,CCg+CL 因Cg很小 故： C CL 式中：k为容量因子df为固定相的液膜厚度为组分在液相中的扩散系数很显然： df 小，大可以使得CL 变小,
