细胞应激 参考ppt课件.ppt
广州医学院病理生理学教研室董伟华,细胞应激,Cellular Stress,细胞应激,概述细胞应激反应常见细胞应激的类型及机制细胞应激与疾病的关系,概 述,细胞应激,细胞处于不利环境和遇到有害刺激时所产生的防御或适应性反应。高度保守在进化中形成；应激导致的选择性压力也有益于物种的进化,应激原,物理因素：压力化学物质、药物、毒物生物：病毒、细菌等细胞必须物质缺乏：低氧、蛋白质或各种物质缺乏内环境失衡：体内产生的活性氧、渗透压改变等,细胞应激反应(cellular stress),细胞应激包括一系列高度有序的事件,启动细胞内信号转导通路进而调节靶蛋白的活性，特别是促进转录因子如AP-1、NF-B、p53、低氧诱导因子表达（或提高其转录活性）多种特异性和非特异性的对细胞具有保护作用的应激蛋白质合成：保护细胞免受损伤或修复已有的损伤若细胞损伤严重而修复无望，则诱导细胞调亡以细胞的自杀行为保护整体的利益,一.应激激活的细胞内信号转导通路和转录因子,包括JNK/SAPK、p38、ERK途径。激活的级联反应类似：MAPKKKMAPKKMAPK效应：激活转录因子保护性蛋白质生成增强细胞对应激原的抵抗力、或介导细胞调亡的信号转导激活因素: JNK/SAPK：紫外线、DNA损伤剂、活性氧、高渗状态、促炎细胞因子； p38：高渗状态、 LPS、细胞因子等； ERK：多种应激原,(一)丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase, MAPK）,磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)： 产生:二酰甘油(DAG) PKC，拮抗细胞调亡； 三磷酸肌醇(IP3) Ca2+i增高（如：炎症细胞被激活的重要标志）磷脂酶A2 (PLA2 )：炎症反应中发挥重要作用 激活因素：TNF、凝血酶、缓激肽,(二)激活多种磷脂酶,PLA2 与炎症和器官组织损害,PLA2 催化磷脂水解，促使前列腺素、白三烯等炎症介质形成，在炎症过程中发挥重要作用与各种病症如急性胰腺炎、败血性休克、多种器官损伤有关，血中的PLA2活性可用于这些疾病的诊断和预后IL-1能以时间依赖和剂量依赖的方式诱导PLA2 的表达和分泌PLA2 基因表达机制：涉及一些转录因子激活状态的修饰，包括核转录因子(NF-B),鞘磷脂酶(SMase)： 作用：降解鞘磷脂生成神经酰胺（CM, 重要的第二信使）鞘磷脂-神经酰胺通路； 分类： 中性SMase：分布于细胞膜上，与ERK通路及促进细胞增殖、炎症反应的发生有关； 酸性SMase：分布于溶酶体，与SAPK通路和细胞调亡密切相关；,诱导因素：紫外线、电离辐射、DNA损伤剂激活酶类：DNA活化的蛋白激酶(DNA-activated protein kinase, DNA-PK)、毛细血管扩张共济失调突变（ATM）激酶作用：活化多种转录因子：P53、c-Jun、c-Fos、c-myc等；使热休克蛋白90(HSP90)磷酸化,(三) DNA损伤激活的蛋白激酶,(四) 其他的信号转导通路,PI3K-蛋白激酶(PKB)：促进细胞生存、抗凋亡作用其他,二.应激引发的生物效应,热休克反应：应激原热休克蛋白对细胞的非特异性保护作用1.应激原蛋白质变性变性蛋白与HSP70结合热休克因子(heat shock factor, HSF)活化调节热休克基因HSP70表达。 其他HSP表达也增多，但以HSP70最多2. HSP70的作用：参与新合成蛋白质的正确折叠和运输；识别变性蛋白质并与之结合，促使其重新形成天然构象或加速其降解,（一）产生非特异性防御反应,特异性防御反应：除产生HSP之外，依据应激原的不同产生不同的特异性蛋白，对细胞产生特异性的保护作用。如：缺氧性应激基因毒应激氧化应激,（二）产生特异性防御反应,（三）对细胞增殖的影响,促进细胞增殖：通过MAPK/ERK通路。 心肌负荷过重，机械牵拉刺激心肌肥厚； 慢性炎症：炎症介质细胞增殖抑制细胞增殖： 通过JNK/SAPK通路和P38细胞周期阻滞、增殖抑制； DNA损伤P53通路G1期或G2期阻滞，修复损伤的DNA,（四）诱导细胞调亡,抑制细胞增殖的通路均与调亡有关。如：SAPK通路P38通路神经酰胺信号转导通路P53通路,内质网应激,内质网(endoplasmic reticulum，ER),内膜表面积占细胞所有膜结构的50 %，体积占细胞总体积的10 %，参与重要的生理功能的维持内质网巨大的膜结构为细胞内活性物质的反应提供了一个广阔的平台，在许多信号调控中起到关键作用基本生理功能：负责蛋白质的合成转运、信号肽识别、糖基化修饰、钙离子的贮存和调节、信号转导及细胞内钙的再分布内质网是细胞凋亡调节中的重要环节,内质网的功能,内质网在蛋白质转运和折叠中起重要作用内质网腔是一个独特的环境内质网中Ca2+浓度是细胞内最高的内质网腔是一个氧化性环境：这对于二硫键的形成和分泌蛋白以及细胞表面蛋白的正确折叠至关重要内质网中富含使蛋白质折叠稳定的介质Ca2+依赖性分子伴侣如葡萄糖调节蛋白78(GRP78)以及钙网蛋白等,使其在蛋白质转运和折叠中发挥作用,ER stress,内质网是细胞中加工蛋白质及贮存Ca2+的主要细胞器，对应激原的刺激十分敏感内质网是完成蛋白质四级结构折叠形成的部位，在内质网内存在着多种相关的酶系统这些蛋白质中的大部分功能与Ca2+浓度的动态变化密切相关内质网应激对于增强细胞对损伤的抵抗及适应能力具有重要意义，对细胞存亡具有重要影响,内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）,各种应激原作用于细胞后，通过诱发内质网腔中错误折叠和未折叠蛋白质的堆积以及Ca2+平衡紊乱而激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR） 及细胞凋亡信号通路等内质网反应，称为。Conditions interfering with the function of ER are collectively called ER stress.,引起ER应激的因素,细胞内氧化还原调节紊乱葡萄糖耗竭：干扰蛋白质N末端的糖基化而导致内质网应激Ca2+调节紊乱：由于GRP78、GRP94以及钙网蛋白的Ca2+依赖性分子伴侣的性质，内质网内Ca2+调节紊乱将导致蛋白质不能折叠病毒感染：内质网应激导致细胞死亡是为了防止病毒扩散的一种古老而有效的机制蛋白酶体功能受损：内质网内本身存在一定数量的蛋白质错误折叠被转运至胞浆在蛋白酶体中降解。蛋白酶体功能受损蛋白质转运障碍ER应激(如：导致神经退行性变中常见的包涵体疾病）,ER应激的诱导途径,未折叠蛋白反应(unfold protein response，UPR): accumulation of unfolded protein aggregates内质网超负荷反应(ER overload response, EOR)：excessive protein traffic usually caused by viral infection固醇调节级联反应前两者由于蛋白质加工紊乱引起，后者是由于在ER表面合成的胆固醇损耗所致,未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）,蛋白质在内质网内的正确折叠需要许多分子伴侣蛋白协助，包括Bip/GRP78(immunoglobulin binding protein78)和GRP94(glucose regulated protein94)、折叠酶类等当内质网中未折叠或错误折叠的蛋白增多时，应激信号通过内质网膜传递到细胞核中，继而引起一系列特定的靶基因转录和蛋白质翻译水平下调，以利于内质网蛋白折叠形成，使细胞继续存活，这种反应就是未折叠蛋白反应(UPR),葡萄糖调节蛋白(glucose regulated proteins，GRPs）,一种内质网分子伴侣，是细胞为适应内质网应激状态所产生的一类应激蛋白，与热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）有高度的同源性 1977年，Shiu等发现，在无葡萄糖介质中培养鸡胚成纤维细胞的过程中，可诱导产生两种分子质量分别为78kD和94kD的蛋白质，分别将其命名为GRP78和GRP94。GRP94只存在于真核生物中，是内质网内数量最多的糖蛋白，可结合未折叠的多肽链，阻止蛋白质聚集，协助蛋白质折叠、伸展、组装和转运，抑制错误折叠蛋白质的分泌GRP94可促进肿瘤细胞增殖、转移及耐药，在肿瘤的治疗及预后方面具有重要的临床意义,Role of GRP (glucose regulated protein) :GRP78, GRP94,preventing protein aggregation (keeping the unfolded proteins in a folding-competent state)binding and keeping Ca2+ in the ER lumen,UPR信号传导途径,哺乳动物中有三条途径涉及UPR信号传导PERK-elF2磷酸化-ATF4路径IRE1-XBP1路径ATF6路径Science 2006, 313: 1564-1566） 相关信号转导蛋白：PERK：RNA激活蛋白激酶的内质网类似激酶elF2：真核翻译因子IRE1（inositol requiring enzyme1, 肌醇必需酶-1, 属丝苏氨酸激酶）XBP1（X-box binding protein1，X盒结合蛋白1）：转录因子，促进多种基因的表达ATF6(avtiviting transcription factor：激活作用转录因子),PERK-elF2磷酸化-ATF4路径IRE1-XBP1路径ATF6路径,1. PERK-elF2磷酸化-ATF4路径,IRE1和PERK是内质网膜上的跨膜蛋白激酶无应激情况，IRE1和PERK与GRP78/Bip形成稳定的复合物当蛋白错误折叠或未折叠蛋白增多时促使GRP78/Bip与其解离 PERK二聚真核翻译因子(eIF2)的磷酸化终止翻译或阻止新合成的蛋白持续进入内质网；上调应激相关信号(如ATF4),2. IRE1-XBP1路径,IRE1具有核酸内切酶功能Bip耗尽IRE1二聚磷酸化激活切割XBP1 premRNA生成XBP1结合ERSE (ER stress response element，应激反应元件) 刺激内质网伴侣蛋白的基因转录,ATF6路径,ATF6：含有bZip转录因子结构域的型跨膜蛋白，在非内质网应激状态下ATF6主要以酶原形式(P90ATF6)存在于内质网未折叠蛋白在内质网聚集增多ATF6从ER进入Golgi被S1P(site1 protease)和S2P酶切成p50bZip转录因子到细胞核激活XBPI转录增加结合ERSEUPR gene表达内质网伴侣蛋白合成,UPR效应,内质网伴侣蛋白基因转录的上调，内质网伴侣蛋白合成蛋白质翻译减少非折叠蛋白由内质网移入胞浆，并在蛋白酶体中降解,UPR的生物学意义,适应环境变化、重建ER的正常功能适应性机制：转录水平的调节：通过诱导相关基因表达而提高ER的蛋白质折叠能力增强ER中蛋白降解，清除错误折叠的蛋白质上述适应性机制失效后，通过激活NFB，ER开始进入警报信号途径,ER应激的两个环节,适应性改变：恢复稳态 诱导细胞凋亡,一. 适应性改变：恢复稳态,寡聚化的IRE1与TRAF2结合激活NF-B激活Ask1而激活c-Jun（AP-1）和p38 MAPK信号转导通路宿主防御相关的基因表达IRE1转录因子XBP-1产生诱导与恢复蛋白质折叠和降解非折叠蛋白有关的基因表达PERK自身激活eIF2磷酸化而失活抑制细胞mRNA的翻译。而另外一些mRNA被翻译，如ATF4（ ATF4诱导某些恢复ER稳态基因的表达）ATF6被酶解成50kD的活性片断(转录因子) 进入细胞核，结合至UPR靶基因启动子区的内质网应激反应元件（ER stress response element, ERSE）导致内质网应激蛋白表达增多,内质网应激蛋白,具有促进错误折叠及未折叠蛋白质的正确折叠、恢复内质网Ca2+转运、清除活性氧等功能有助于增强细胞对损伤的抵抗力，促进细胞存活类型：内质网分子伴侣（如GRP78、GRP94、ERp29、ERp72等）、蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase, PDI）、血红素加氧酶-1、内质网Ca2+-ATP酶等,二. ER应激诱导细胞凋亡,当蛋白的错误折叠反应程度过强或持续时间过长，ER应激将导致以细胞凋亡为特征的细胞死亡,（一）ER应激诱导细胞凋亡的相关因素,蛋白酶:caspase-12与ER相结合。Caspase-12是ER应激介导细胞凋亡的主要因素之一ER应激激活caspase-12机制：通过IRE1激活caspase-12：活化的IRE1水解 caspase-12前体而激活caspase-12通过Ca2+依赖性蛋白酶（calpain）激活caspase-12:在ER应激时，细胞内Ca2+水平升高引起胞质中Ca2+依赖性蛋白酶的活化并转位于ER膜，剪切定位于ER膜上的caspase-12前体，使之活化并释放入细胞质Caspase-7可能通过移位至ER激活caspase-12,CHOP：ER应激可以诱导其高表达CHOP基因启动子中包含所有UPR诱导蛋白（如ATF4、ATF6和XBP-1）的结合位点，并且这些转录因子与CHOP基因的诱导表达具有因果关系过表达CHOP通过抑制Bcl-2而诱导细胞凋亡,（一）ER应激诱导细胞凋亡的相关因素,ER 应激的效应,常见细胞应激的类型及机制,一、基因毒应激(genotoxic stress),（一）DNA损伤的原因和类型,紫外线照射：DNA形成嘧啶二聚体，不能与嘌呤配对DNA损伤电离辐射：产生活性氧和自由基DNA碱基损伤、双链和单链断裂化学诱变剂：烷化剂DNA烷基化修饰基因突变；碱基类似物替代正常碱基，干扰DNA合成病毒感染：RNA病毒、DNA病毒,DNA活化的蛋白激酶(DNA-PK)：位于细胞核内的丝/苏氨酸蛋白激酶 作用：主要识别DNA双链断裂 调节亚基识别DNA损伤并结合到双链DNA断裂的末端与催化亚基结合并激活其活性磷酸化转录因子P53、c-Jun和c-Fos效应ATM激酶：监控DNA损伤的激酶。在细胞周期检查点的作用位于P53蛋白的上游,（二）DNA损伤激活的信号转导通路和靶蛋白,聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)：DNA损伤感应及检测分子。功能与DNA-PK相似，但对DNA单、双链断裂均能识别。DNA损伤上述通路p53激活P53蛋白增多、活性增强P21/WAF1、GADD45(生长抑制和DNA损伤45基因产物)等靶蛋白转录增加前者负调控细胞周期、后者抑制细胞进入S期细胞周期G1期阻滞，进行损伤DNA的修复；或启动调亡,（二）DNA损伤激活的信号转导通路和靶蛋白,DNA损伤激活的其他信号转导通路：MAPK家族的蛋白激酶激活：ERK、SAPK/JNK、P38激活NF-B、AP-1、c-myc等NF-B：紫外线和电离辐射活化的主要转录因子。静止细胞中NF-B位于细胞质。基因毒制剂刺激细胞NF-B活化，进入细胞核与B增强子及启动子相互作用促进基因表达AP-1：c-fos、c-Jun的转录活性增高，二者产物的二聚体为AP-1,（二）DNA损伤激活的信号转导通路和靶蛋白,AP-1(activator protein 1, 激活子蛋白-1),由c-jun蛋白和c-fos蛋白家族成员之间相互作用而形成多种形式的同源二聚体或异源二聚体AP-1细胞内一种重要的转录因子, 被誉为细胞内信号传导的第三信使, 在细胞增殖，分化，凋亡，胚胎发育，炎症及其它病理过程中起着重要作用诱导因素：激素、生长因子、细胞因子、神经介质、热休克、电休克、紫外线、氧应激、以及过表达的癌基因等活化的AP-1启动基因转录的分子开关, 调控IL-1、TNF-、IL-6、IL-8、MIP-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1和Pascel等基因的表达,细胞周期阻滞、DNA修复 G1期阻滞：check point；P53 G2期阻滞：DNA损伤Cdc2激活受抑G2检查点阻滞细胞不能进入M期（G2期阻滞也必须有P53的参与） DNA修复：P53吸引和活化DNA损伤修复蛋白，促进DNA修复细胞调亡 P53诱导的调亡： P53非依赖的调亡：SAPK/JNK通路、TNF,（三）DNA损伤引发的细胞反应,二、缺氧性应激(hypoxia cellular stress),（一）缺氧的识别及信号转导通路,缺氧的识别：氧感受器。位于细胞表面，辅酶氧化酶(NADPH氧化酶)是最可能的氧感受器低氧的信号转导：Ca2+、NO、CO都在信号转导过程中发挥作用,HIF1的结构：由2个亚基、组成异二聚体HIF1的诱导：低氧时，HIF1合成增加、降解减少，而HIF1不受低氧诱导。生物效应及作用机制：HIF1的靶基因有：促红细胞生成素(EPO)基因：导致红细胞增多VEGF基因：促进血管形成,改善缺氧血管新生葡萄糖转运子-1和糖酵解酶基因：增强糖酵解血红素加氧酶(HO-1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因：NO产生增多，舒张血管，增加血流量和血管通透性，增加组织供氧,（二）缺氧诱导因子HIF1及其生物学效应,The key molecule in oxygen sensing is the transcription factor hypoxia induced factor-1 alpha (缺氧诱导因子，HIF-1a). Under normoxic conditions HIF-1a is constantly produced and constantly ubiquitinated This ubiquitination is mediated by a protein called Von Hippel-Lindau protein (pVHL).,VHL can only do this when a particular proline(脯氨酸) residue in HIF-1a is hydroxylated(羟基化) This hydroxylation is carried out by a particular prolyl hydroxylase(脯氨酸羟化酶) which is only active under normoxic conditions,When the oxygen concentration drops this enzyme is no longer efficientthe proline residue in HIF-1a doesnt get hydroxylatedpVHL can no longer mediate ubiquitination of HIF-1a HIF-1a accumulates in the cell and activates gene expression,三、氧化应激(oxidative stress, OS),氧化应激,氧化应激(oxidative stress，OS )是指机体活性氧产生过多或 /和机体抗氧化能力降低，前氧化系统和抗氧化系统平衡紊乱，从而导致潜在性损伤的病理过程。,细胞的前氧化系统和抗氧化系统,由活性氧(ROS)或自由基超负荷引起ROS：激活MAPK家族成员的ERK1、ERK2和JNK信号转导通路激活转录因子AP-1、NF-B诱导氧化应激基因SOD、CAT和GSH-Px等的表达表达产物清除自由基特异性地保护细胞其他化学物质引起的氧化应激,细胞应激与疾病的关系,细胞应激与呼吸系统疾病细胞应激与心血管系统疾病细胞应激与神经退化性疾病细胞应激与感染性疾病细胞应激与肿瘤.,氧化应激与疾病的关系,氧化应激与心血管疾病氧化应激与神经系统疾病氧化应激与肠道疾病,1.氧化应激与心血管疾病,氧化应激与血管内皮功能异常氧化应激与高血压氧化应激与动脉粥样硬化氧化应激与心力衰竭氧化应激和心肌缺血再灌注损伤,氧化应激与心力衰竭,ROS在心肌肥大的发生中起信号分子的作用ROS直接或间接激活下游信号通路，使其对细胞外因子产生应答，进而诱导心肌肥大信号通路：PKC、MAPKs、p38、JNK、ASK21和 ERK1/2、NF- 、某些酪氨酸激酶（如: src和 FAK）以及依赖钙调蛋白的磷酸酯酶等,ROS对心肌的损伤效应：直接损伤效应心肌细胞及其超微结构膜完整性破坏，酶活性下降，心肌舒缩功能障碍胶原酶原激活，降解胶原蛋白，破坏心脏胶原网络环加氧酶激活，释放 TXA 、LTs等，增强血小板聚集和冠脉收缩，恶化心肌缺血缺氧。,氧化应激与心力衰竭,ROS对心肌的损伤效应：ROS诱导心肌细胞凋亡，使心肌细胞数量减少晚期心衰心功能进行性下降的主要机制之一心衰时，大量儿茶酚胺分泌，其自氧化过程中产生大量氧自由基并诱导心肌细胞凋亡氧化应激是否诱导心肌细胞凋亡依赖于 ROS的浓度水平,氧化应激与心力衰竭,
