第六章 酶与细胞固定化ppt课件.ppt

第一节 酶的固定化 第二节 微生物、植物和动物细胞固定化 第三节 原生质体固定化,第一节 酶的固定化,一、固定化酶的优缺点二、酶的固定化方法三、固定化酶性质四、固定化酶的应用,酶的固定化：借助各种物理或化学方法，将酶固定于水不溶性载体上的过程。,固定化酶(immobilized enzyme) ：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。 （固定化酶又叫水不溶性酶）,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶（固定化酶）,固定化技术,固定化酶的优点,一、固定化酶的优缺点,固定化酶缺点,缺 点,比较适应水溶性底物和小分子底物。,固定化成本高。,酶固定化时酶的活力有所损失。,二、酶的固定化方法,1.吸附法,2.包埋法,3.共价偶联法,4.交联法,固定化方法,吸附法,结合法,交联法,包埋法,网格型,微囊型,离子键结合法,物理吸附法,共价键结合法,1、吸附法,（1）定义：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。,物理吸附法（physical adsortion）作用力：氢键、疏水键常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、大孔合成树脂等。,优点：酶的活性中心不易被破坏，酶活力损失小。缺点：结合力弱，易解吸附。,（3）制备方法：,a. 静态法 (statia procedure) ： 没有搅拌、振摇情况下，将载体直接加入酶溶液，通过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。 该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。b.电沉积法 (electrodeposition procedure) ： 在酶溶液中放置两个电极，在电极邻近加入载体，接通电源，酶移向电极并沉积到载体表面，以制备固定化酶。 该法可提高吸附时局部浓度，增加吸附量，但要注意酶在电场中的稳定性。,c. 混和振摇装载法 (mixing or shaking bath loading) ： 是实验室常用方法，载体与酶液混和后，要在搅拌下或摇床连续振摇下完成固定化。 该法固定化较为均匀，要注意搅拌或振摇速率，既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。d. 反应器装载法(reactor loading process)： 这是工业上常用方法，它将固定化和其后的应用连在一起，即先将载体装于反应器中，再加上酶液，然后通过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。,(1) 定义：将酶分子包埋在各种多孔载体中，制成一定形状的固定化酶的技术，主要用于水溶性小分子底物转化反应。,2、包埋法：(entrapment),(2)包埋法的类型：酶被包埋成网格型称为凝胶包埋法；酶被包埋成微胶囊型称为微胶囊包埋法。 包埋过程不发生反应,凝胶包埋法（网格型）：将酶包埋在凝胶内部的微孔中。微胶囊包埋法（微囊型）：将酶包埋在高分子半透膜中。,a. 凝胶包埋：,使用的多孔载体及其特点,海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至海藻酸钠溶液E (or cell) CaCl2 溶液中 IE(or IC) 角叉菜胶包埋法： 滴至角叉菜胶E (or cell) KCl 溶液中 IE (or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法： 过硫酸钾Acr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) 二甲氨基丙腈,b. 微囊型包埋(microencapsulation)：又称半透膜包埋法：,将酶包埋于由各种高分子聚合物（直径几十微米几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球内，制成固定化酶。 常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜 制备方式：界面沉降法、界面聚合法、表面活性剂乳化液包埋法。 分述如下：,界面沉降法： 利用高聚物在水相和有机相的界面上溶解度降低而凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。 例： 以火棉胶（硝酸纤维素）包埋酶时，先将酶的水溶液在含有硝酸纤维素的乙醚溶液中乳化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝酸纤维素在酶液液滴周围凝聚，最后用Tween20破乳化后，就可得到含酶的火棉胶囊。,界面聚合法： 将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。 例：以尼龙膜包埋酶时，将酶液及亲水性单体（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，将疏水性单体（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等与水混溶的有机溶剂。然后，将这两种互不相溶的液体混和在一起。加入乳化剂乳化，使酶液分散成小液滴。此时，亲水性的已二胺与疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加Tween20，使乳化破坏，用离心分离即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。,表面活性剂乳化液膜法： 在酶的水溶液中添加表面活性剂，使之乳化形成液膜达到包埋的目的。该法不含化学反应，简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。,脂质体包埋： 将酶包埋于脂质体(Liposome)中的方法。脂质体是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。 脂质体包埋的特点： 具有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物携带到体内特定部位，然后将被包裹物质释放。因此，其在药物应用方面受到重视。,与凝胶包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1）固定化酶颗粒小。2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。 缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。,包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。,1）离子结合法（ion binding）作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素,3.结合法,载体通过共价键或离子键与酶结合的固定化方法。,1）离子结合法（ion binding）作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素,优缺点：催化效率损失小；结合力弱，改变pH和离子强度可使酶脱落。,借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。,2）共价结合法,A. 载体：亲水载体优于疏水载体 如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙,亲水性好，有一定机械强度,2）偶联方法：,芳香氨基羟基羟甲基氨基,载体上的功能基团,酶分子上的非必需侧链基团,游离氨基胍基酚羟基巯基咪唑基羟基,重氮法叠氮法卤化氢法烷化法缩合法,常用的偶联反应, 重氮法： 这是带芳香氨基载体的主要反应，即载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基或氨基直接进行偶联。（见示意图）,载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应值得固定化酶。ROCH2C6H4N+=N+E ROCH2C6H4N NE,亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成： NaNO2+HCl HNO2+NaCl, 叠氮法： 含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。以羧甲基纤维素为例，先将羧甲基纤维素甲酯化，再与肼反应生成羧甲基纤维素的酰肼衍生物，然后再与亚硝酸反应得到叠氮化合物，这种产物能在低温、pH 7.58.5的情况下和酶的氨基直接偶联。叠氮衍生物也能和羟基、酚羟基或巯基反应。,ROCH2COOH+CH3OH ROCH2COOCH2 +H2O CMC CMC甲酯,R-O-CH2-COO-CH2 +NH2-NH2 R-O-CH2-CO-NH-NH2+CH3OH CMC甲酯 肼 CMC酰肼衍生物,ROCH2CONHNH2+HNO2 ROCH2CON3+2H2O,ROCH2CON3 +H2NE ROCH2CONHEROCH2CON3 +HOE ROCH2COOEROCH2CON3 +SHE ROCH2COSE, 溴化氰法(常用)： 带羟基的载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖等常用的反应。在碱性条件下载体羟基和溴化氰反应生成极活泼的亚氨碳酸基，它在弱碱中可直接和酶的氨基进行共价偶联反应。, 烷基化法： 含羟基的载体也可在碱性条件下和均三氯三嗪(triazinyl)等反应，在引入活泼的卤素后能直接与酶的氨基、酚羟基或巯基等偶联。, 缩合法： 利用羰二亚胺的活化作用，使氨基与羧基直接偶联缩合成肽键的反应，适用于带羧基或氨基的载体。,优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。,4.交联法（crosslinking） 借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子与惰性蛋白或酶分子与载体间发生交联，形成共价键连接来制备固定化酶的方法。双功能试剂：常用的是戊二醛,戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。,此法与共价偶联法利用的均是共价键。,在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联形成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳，为克服这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上，或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定化酶“网”膜或“网”颗粒。这种方法又称为双重固定化法。,交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态（修饰）。 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态（固定化）。,缺点：(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。,优点： 制备简单、结合牢固、可以长时间使用。,酶和细胞固定化示意图,各种固定化方法的优缺点比较,各种固定化方法的优缺点比较,三、固定化酶的性质 酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶分子处在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会影响酶原有的性质。,1. 活力：,大多数酶固定化后，酶活性下降。原因：（1）构象改变；（2）空间位阻 （3）活性中心与载体结合,评价固定化酶的指标：,相对活力低于75%，没有实际应用价值。,2. 稳定性：,(2)固定化后半衰期增长，保存稳定性好。,影响原因： 固定化增加了酶活性构象的牢固程度，并且固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。抑制酶自身降解，酶与载体固定化后失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了其自身的降解过程。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭，但是如果固定化触及到酶的活性部位或调节部位，也可能导致酶稳定性下降。,3.最适反应pH：,酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移，影响固定化酶最适pH的因素：,(1) 载体性质对最适pH影响： 带负电荷载体 ：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体 ：最适pH 向酸性偏移。 不带电荷载体 : 最适pH一般不改变。,(2) 产物性质对最适pH影响； 酶催化反应产物为酸性：最适pH向碱性偏移。酶催化反应产物为碱性：最适pH 向酸性偏移。酶催化反应产物为中性：最适pH不改变。,影响原因：固相酶颗粒在水溶液中，是被一层几乎不流动的液体包围着，这层不流动液体叫做扩散层。载体的带电性质之所以会影响固定化酶的最适pH值，是由于在使用带负电荷的载体时，载体会吸引反应液中的氢离子(H+)到其附近，致使固定化酶所处反应区域的pH值比周围反应液的pH值低一些，这样就必须把反应液的pH值提高一些，才能使酶充分发挥其催化功能。故此，固定化酶的最适pH显得比游离酶的最适pH值高一些。反之，带正电荷的载体对氢氧根负离子有吸引作用，由它制备的固定化酶的最适pH值要比游离酶的最适pH值低一些。,影响原因：固定化载体成为扩散阻碍，使反应产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域内的pH值降低，必需提高周围反应液的pH值，才能达到酶所要求的pH值。为此，固定化酶的最适pH值比游离酶要高一些。反之，反应产物为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区域的pH值升高，故此使固定化酶的最适pH值比游离酶的最适pH值要低一些。,4. 最适反应温度：,最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。,同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同。,5. 动力学常数：Km与Vm,固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表观Km值降低。 固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的表观Km值显著增加。,Vm固定化前后相同或接近 （也有例外）。,6. 底物特异性,固定化酶底物特异性与游离酶相比，有一定变化，一般为：作用于小分子底物的酶类经固定化后，专一性基本不变。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定化后专一性会发生变化。,影响原因： 固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不同。,四、固定化酶的应用,1. 在食品工业中的应用,2. 在医药领域的应用,3. 生物传感器,4. 环境保护,（1）乳制品中 乳糖不耐症：有些人体内缺乏乳糖，在饮用牛奶后会发生腹泻、腹胀（酸奶不会）。这是因为不能消化牛奶中的乳糖，-半乳糖苷酶：又称乳糖酶，可用于水解乳中存在的乳糖，用于制造低乳糖奶。采用固定化乳糖酶可连接生产低乳糖奶，已于1977年实现工业化。,（2）在啤酒中 糖化需要-淀粉酶，而麦芽中的-淀粉酶不足，需添加外源性的淀粉酶来补充，因此可将发酵液连续通过固定化淀粉酶反应器。例如，在制造啤酒时，可以试用固定化微生物淀粉酶替代麦芽水解淀粉酶。 另外，采用固定化蛋白质分解酶类来水解蛋白质或多肽也正在研究之中。啤酒经长时间存放后，含有的多酚类和多肽结合在一起，产生所谓冷浊。现在主要是应用木瓜酶来防止这种现象的发生，但长期往啤酒中添加这类蛋白质分解酶，会对蛋白质分解产生不良影响。为克服这一缺点，目前，正在利用固定化木瓜酶和固定化多酚氧化酶研究解决啤酒的防浊问题。,（3）固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的应用固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一种，它可以用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果糖糖浆。自1972年这项技术产生以来，科学家已经固定了几种芽孢杆菌和链霉菌中提取的葡萄糖异构化酶，并大量应用于工业生产中，今后几十年中它将是应用最广，市场份额最大的固定化酶 。,（4）在油脂改性中的应用 脂肪酶可以催化酯交换、酯转移和水解等反应，所以在油脂工业中有广泛应用，1，3-特异性脂肪酶可酶促酯交换反应，将棕榈油改性为可可酯。代可可酯是生产巧克力的原料，价格甚高，而棕榈价廉，因此这一工艺受到较大重视，已开展了较多工作。,（5）用固定化酶酶促生产阿斯巴甜 阿斯巴甜是双肽甜味剂，在工业上用化学法合成。现在，已开始用酶法合成，用固定化酶进行藕合反应，得到阿斯巴甜 。,（6）固定化酶在茶叶加工中的应用。 目前，固定化酶法已经开始应用于茶饮料中，例如，固定化的单宁酶和果胶酶。 单宁酶是一种水解酶，可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚酸键。将单宁酶应用于茶叶饮料可以改善茶饮料的品质。据报道用固定化的单宁酶处理红茶，可提高茶汤中可溶性铁和钙的含量。若在绿茶加工中使用单宁酶，可以部分消除夏秋茶苦涩味道，可提高茶饮料品质。 果胶酶是作用于果胶质的D-半乳糖醛酸残基之间的糖苷键，使高分子的聚半乳糖醛酸降解为小分子物质。茶叶中的水溶性果胶与茶叶的品质密切相关。,（7）在果汁中的应用 柑橘类产品加工中出现苦味是柑橘加工中的重要问题。造成苦味的物质有两类：一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物（A环和B环）；另一类为果实中的黄酮苷。脱苦的方法主要有吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物质，而固定化酶法主要是利用不同酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物质。工业上采用固定化柚皮苷酶减少柑橘类果汁中的柚皮苷含量。,2、医药领域的应用,（1）作为治疗药物 固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作为治疗药物时，较之溶液酶，表现出极大的优势。,作为治疗药物，溶液酶具有一些“致命”弱点： 酶作为异体物质，反复应用会导致免疫反应 酶绝大多数是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白酶水解破坏。 由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度。 溶液酶的这些缺点，通过选择适宜的载体与方法将它们固定化以后就能逐一地加以解决。,（2）作为“人工脏器” 固定化酶可做成“人工脏器”参与体外循环，其应用主要有两方面： a.用于除去有害的毒性物质及有潜在毒害作用的代谢产物 如清除尿毒症病人体内积累的尿素；进行这类应用时除了要考虑半寿期、免疫过敏等问题外，还要在“人工脏器”中偶联多种组成成分以彻底除去毒性产物。如处理尿素时，除了脲酶外，还要解决尿素分解生成氨的问题，这就需要另外加入谷氨酰胺合成酶或加入去氨的树脂等。,b. 除去(一种或多种)氨基酸，使需要这些物质的病变组织“饿死” 治疗时只需将患者的血液引出体外，通过由固定化酶等构成的“人工脏器”加以处理，然后再流回体内。,3、生物传感器生物传感器是利用生物物质作为识别元件将被测物浓度与可测量电信号关联起来的装置，生物传感器中研究最多的是酶传感器，其核心技术也是酶的固定化。 Chen等将高聚物聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸等做成薄膜，用薄膜将葡萄糖氧化酶固定在金电极上，通过检测电信号可以测定血液中的葡萄糖含量。宋正华等将具有分子识别功能的-葡萄糖苷酶和发光胺，分别固定在壳质胺和大孔阴离子交换树脂的填充柱中,组成流动注射系统，可以方便地确定苦杏仁甙的含量。,4、环境保护固定化酶一个很大的用途是处理废水中一些有毒有害物质，防止污染。其中漆酶的固定化应用较为广泛，酚类化合物是废水中一类常见的高含量污染物，漆酶可以催化氧化酚类化合物，而且不用加入过氧化物酶。在废水处理中,由于组分复杂而且经常变化，利用单一的固定化酶，很难收到好的处理效果。因此，要用多酶固定化体系组合处理，才能使有机物完全矿化和保持无害稳定排放。,第二节 细胞固定化,一、基本概念 二、细胞固定化方法三、固定化细胞的特点四、固定化微生物细胞的应用五、固定化植物细胞六、固定化动物细胞,细胞固定化技术：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法。,固定化细胞 ：被限定自由移动的细胞，即采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。,一、基本概念,固定化细胞与固定化酶相比，其优点：不需要破碎细胞和分离提纯酶，减少了酶活力损失，可大大降低生产成本；保持了胞内酶系原始状态与天然环境，因而酶更稳定；保持了胞内原有的多酶系统，能催化一系列的反应，大大提高了催化效率，特别是对那些多酶反应、需要辅酶的氧化还原反应以及合成反应等，固定化细胞更具有明显的优势；固定化细胞的制备与使用通常都比固定化酶更简便。,二、微生物细胞固定化方法 主要有吸附法、包埋法、交联法和无载体法。,1、吸附法(1) 定义：将细胞直接与水不溶性载体相结合的方法。(2) 常用吸附剂：硅藻土，多孔陶瓷、多孔玻璃，多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。,(3) 优点：操作简单，对细胞生长、繁殖和新陈代谢没有明显的影响。 缺点：吸附力弱，吸附容量小，没有工业化生产。,2、包埋法（最常用）： (1) 定义：将细胞包埋于多孔载体内部而制成固定化细胞的方法，称为包埋法，包埋法能保持多酶系统，是目前制备固定细胞最常用的方法。 包埋法又分为凝胶包埋法和半透膜（胶囊）包埋法。,(2) 凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内，而使细胞固定化的方法。 凝胶包埋法常用载体有：琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶等。 a. 琼脂凝胶包埋法 b. 海藻酸钙凝胶包埋法 c. 角叉莱胶包埋法 d. 明胶包埋法 e. 聚丙烯酰胺凝胶包埋法,(3) 半透膜胶囊包埋法：将细胞分散于有机溶剂中成乳化液，此时，细胞被一层液态膜包围，形成具有半透膜胶囊的固相细胞。,琼脂凝胶包埋法,琼脂,水,溶化,冷却至4855,加菌悬液,趁热分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球状固定化细胞胶粒。,摊成薄层，冷却，切成所需形状。,琼脂凝胶机械强度较差，氧气、底物和产物的扩散较困难，其使用受到限制。,海藻酸钙凝胶包埋法,海藻酸钠水溶液,灭菌,菌悬液,滴入氯化钙溶液中，形成球状固定化细胞胶粒。,海藻酸钙凝胶包埋法操作简便，条件温和，对细胞无毒性，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。,磷酸盐会使凝胶结构破坏，使用时应控制好培养基中磷酸盐浓度，并在培养基中保持一定浓度的钙离子，以维持凝胶结构的稳定性。,角叉菜胶包埋法,角叉菜胶水溶液,冷却至3550,加菌悬液,趁热滴定至KCl溶液中，形成球状固定化细胞胶粒。,滴到冷的植物油中，成型后再置于KCl溶液中。,角叉莱胶具有一定的机械强度。若使用浓度较低，强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处理，进行双重固定化。,灭菌,明胶包埋法,明胶水溶液,冷却至35以上,加菌悬液,冷却后制成所需形状。,机械强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处理，进行双重固定化。,灭菌,聚丙烯酰胺凝胶包埋法,丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,混合,加过硫酸钙和四甲基乙二胺,静置成型,固定化细胞机械强度高，可通过改变丙烯酰胺的浓度以调节凝胶的孔径，适用于多种细胞和酶的固定化。,菌悬液,注意：丙烯酰胺单体对细胞有一定的毒害作用，在聚合过程中，应尽量缩短聚合时间，以减少细胞与丙烯酰胺单体的接触时间。,3、无载体法 (1) 基本概念： 在没有载体的情况下，借助物理或化学方法，将细胞直接固定化的方法。这种固定化，既可发生在细胞结构上，也可通过细胞聚集来完成。包括去自溶酶法和絮凝法。,(2) 去自溶酶法： 细胞所具有的酶系，从广义上讲已是一种固相酶 ，因此用简单的加热、冻冻，-射线幅射等物理手段处理细胞，使细胞的自溶酶系失活，防止目的酶被水解，由此得到的细胞实体，为固相细胞。,(3) 絮凝法： 向待固定的细胞液中加入絮凝剂，使细胞凝聚在一起，过滤，收集絮凝细胞，装柱，即为可使用的固相细胞。 常用絮凝剂：活性硅胶、聚赖AA、聚丙烯酰胺等。,目前已报道的有絮凝性的微生物有：霉菌（赫曲霉、酱油曲霉、米曲霉）放线菌（灰色链霉菌、酒红链霉菌、石灰壤诺氏卡菌、椿象虫诺卡氏菌）细菌（嗜虫短杆菌、产碱细菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、红平红球菌、金黄色葡萄球菌及运动发酵单胞菌）酵母菌（啤酒酵母及葡萄汁酵母、粟酒裂殖酵母、异常汉逊酵母等）,三、固定化微生物细胞的特点：,（1）保持了其完整结构和自然状态，稳定性好。,（2）细胞密度增大，能够提高产物产率。,（3）发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长时间。,（4）保持了细胞内原有的酶系、辅酶系和代谢调控体系，可以按照原理的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。,（5）提高工程菌的质粒稳定性，有利于菌种的传代保存。,四、固定化微生物细胞的应用,1、利用固定化微生物细胞生产各种产物： 固定化微生物细胞能进行正常的生长，繁殖和新陈代谢，所以利用固定化细胞可以如同游离细胞那样发酵生产各种代谢物。由于微生物固定化后，受载体的影响，故固定化微生物只用于生产各种能够分泌到细胞外的产物。 其中主要有下面几类物质：,(1) 酒精酒类：固定化酵母等微生物可用于生产酒精、啤酒、蜂蜜酒、葡萄酒、米酒等。有的已完成中试，实现了工业化生产。 (2) 氨基酸：固定化氨基酸生产菌可用于生产谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、瓜氨酸、色氨酸、异亮氨酸等氨基酸。(3) 有机酸： 固定化黑曲霉等微生物可生产苹果酸、柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、醋酸等有机酸。,(4) 酶和辅酶：固定化微生物可用于生产淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、溶菌酶、磷酸二酯酶、天门冬酰氨酶等胞外酶以及辅酶A，NAD，NADP、ATP等辅酶 (5) 抗生素：固定化微生物在生产青霉素，四环素，头孢霉素、杆菌肽、氨苄青霉素等抗生素方面的研究，成果显著。 (6）固定化微生物细胞还可以用于甾体转化及有机溶剂、维生素、化工产品等的生产。,2、固定化微生物细胞制造微生物传感器： 微生物传感器是由固定化微生物细胞与各种能量转换器(电极，燃料电池，场效应管等)密切结合而成的传感装置。 微生物传感器分为呼吸活性测定型和电极活性测定性两种。,呼吸活性测定型： 利用固定在高分子膜上的微生物细胞的呼吸作用，测定氧气的消耗和二氧化碳的生成，从而确定被测定物质的量。这种呼吸活性测定型传感器由固定化微生物膜和氧电极或二氧化碳电极结合而成。,电极活性测定型： 利用固定的微生物细胞的新陈代谢作用，测定电极活性物质的量的变化从而确定样品中欲测物质的含量，这种传感器由固定化微生物膜与生物燃料电池、离子选择电极和气体电极等组成。,微生物传感器已成功地用于测定可发酵性糖，葡萄糖、甲酸、乙酸，甲醇、乙醇、头孢霉素、谷氨酸、氨、硝酸盐，生化需氧量(BOD)、细胞数量等。,四、固定化植物细胞,1、固定化植物细胞方法： 主要为吸附法与包埋法。,(1) 吸附法： 吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内，或者将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。,(2)包埋法： 包埋法是将植物细胞包埋在琼脂，角叉菜胶、海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明胶等多孔凝胶之中。 包埋方法与微生物细胞包埋时基本相同此法已在植物细胞固定化，以及发酵生产次级代谢物方面广泛采用。,2、固定化植物细胞特点,(1)提高植物细胞的存活率和稳定性 载体的保护可减轻剪切力和其他外界因素对植物细胞的影响,(2) 固定化植物细胞发酵可以简便地在不同的培养阶段更换不同的培养液，以利于生产各种所需的次级代谢物。,(5) 固定化植物细胞可反复使用或连续使用较长一段时间，大大缩短生产周期，提高产率。,(4) 固定化植物细胞易于与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产品质量。,(3) 细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团。,2、固定化植物细胞特点,固定化植物细胞主要用途是制造人工种子 。 还可以用于生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢物，一般仅适用于可以分泌到细胞外的产物的生产。对于细胞内产物，则要想办法增加细胞透过性，使胞内产物分泌到胞外。,五、固定化动物细胞,1、动物细胞固定化方法： 主要为吸附法与包埋法,(1) 吸附法： 大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面故吸附法特别适合于动物细胞的固定化。,操作简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早研究和使用的方法。 常用的吸附载体有转瓶、微载体和中空纤维等。,a. 转瓶吸附： 转瓶是由玻璃或塑料制成，表面经过一定方法处理而带上电荷。如用高锰酸钾等氧化剂、强酸、强碱或紫外光照射等进行表面处理，就可使动物细胞容易附着在其表面生长。,培养时，转瓶以一定速度转动。转瓶培养的设备简单，操作容易，但比表面积(SV，表面积与体积之比值)较小，细胞生长繁殖受到限制。若在转瓶内加进列管或多层平板组成列管式转瓶或多层平板式转瓶即可使其比表面积增加，提高生产能力。,b. 微载体吸附： 微载体是指颗粒细小的固定化载体直径一般为100200um，相对密度接近l.0。是由带有表面电荷的葡聚糖、明胶，纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。,微载体已用于多种动物细胞的固定化；用于生产-干扰素，人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素以及各种疫苗等。,c.中空纤维吸附： 中空纤维由聚丙烯，硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纤维管壁是半透膜。,使用时，将动物细胞置于纤维管外壁和外壳容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁培养液在中空纤维管内流动，各种营养成分、溶解氧和代谢产物透过中空纤维膜进行传递。,现在已有多种中空纤维培养器用于动物细胞固定化。中空纤维固定化适用于动物附着细胞，也适用于悬浮细胞培养。 中空纤维培养器的缺点是：中空纤维成本较高，有时会发生纤维管堵塞现象，大规模生产的难度较大。,(2) 包埋法： 一般适用于悬浮细胞。根据载体和方法的不同，有凝胶包埋法和半透膜包埋法两种。,a. 凝胶包埋法：利用各种多孔凝胶为载体将动物细胞固定化，细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖和新陈代谢，由于有载体的保护，动物细胞有较好的稳定性可显著提高其存活率。 用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白等。,琼脂凝胶包埋法,12.5%琼脂糖,溶化,冷却至3738,加动物细胞,降温至1O左右，得到直径为0.10.3mm的微球状固定化细胞。,海藻酸钙凝胶包埋法,海藻酸钠水溶液,灭菌,动物细胞,滴入氯化钙溶液中，形成球状固定化细胞。,血纤维蛋白包埋法,血纤维蛋白原,动物细胞,凝血酶,血纤维蛋白,b.半透膜包埋法： 利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，形成微囊型固定化动物细胞。,制备过程：采用海藻酸钙聚赖氨酸(ALG-PLL)包埋技术 动物细胞先用海藻 酸钙凝胶包埋制成直径l2mm的胶粒，再用聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜，然后将它泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解。便获得由聚赖氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化动物细胞。,2、固定化动物细胞特点 (1) 提高细胞存活率： 动物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可以减轻或免受剪切力的影响，同时动物细胞可附着在载体表面生长，从而可显著提高动物细胞的存活率。,(2) 提高产率： 动物细胞固定化后，可先在生长培养基中繁殖，使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度。然后可简便地改换成发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长期转变到生产期。以利于提高产率。,(3) 可反复使用： 固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间，利于连续化自动化生产。,(4) 易于与产物分开： 固定化细胞易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量。,固定化细胞的缺点：,（1）这种技术仅能用于生产胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。,（2）细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物。,（3）由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制，尤其在好气性发酵中，溶解氧的传递和输送称为关键性的限制因素。,固定化细胞的缺点：,（4）由于微生物本身的复杂性，形成的细胞一般在稳定性和酶活力水平上都比较低。,（5）使用初期往往会有一些细胞组分渗出，影响产品质量。,（6）如果底物为高分子物质或不溶性物质，使用时就十分麻烦。,第三节 原生质体固定化,一、概述二、原生质体制备三、原生质体固定化四、固定化原生质体的应用,一、概述,1、基本概念：将微生物细胞和植物细胞去细胞壁后，可得原生质体，将此原生质体用多孔凝胶包埋，即为固定化原生质体。,2、固定化原生质体的优点：(1) 促进胞内物质分泌到胞外。(2) 有利于氧的传递，营养物质的吸收。,二、原生质体制备,1. 制备原则：(1) 既要破坏细胞,又不能影响到细胞膜的完整性。(2) 不能使细胞内部结构受到破坏。,2. 制备方法：,(1) 将对数生长期的细胞收集起来，悬浮于含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中。,(2) 加入适宜的细胞壁水解酶，在一定条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。,(3) 分离除去细胞壁碎片、未作用细胞、及胞壁水解酶，从而得原生质体。,3、破壁使用的酶： 主要根据细胞壁的主要成分不同而进行选择。,细菌胞壁：主要成份为肽多糖，使用酶为溶菌酶。,酵母胞壁：主要成份为-葡聚糖，使用酶为-1.3-葡聚糖酶。,霉菌胞壁：主要成份为几丁质及其它，使用酶为几丁质酶及其它有关酶。,植物胞壁：主要成份为纤维素、半纤维素、果胶，使用酶为纤维素酶和果胶酶等。,4、注意事项：(1) 加入适当的渗透压稳定剂，防止原生质体破裂。(2) 应选择对数生长期的细胞制备原生质体，以获得较高的原生质体形成率。(3) 加入胞壁溶解酶的种类、浓度、酶作用温度、pH值及作用时间需经过预试以确定最佳作用条件。,三、原生质体固定化 主要采用凝胶包埋法，常用凝胶有：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉莱胶、光交联树脂等。,1、琼脂多孔醋酸纤维素固定化法：,琼脂糖,生理盐水,浓度34%,原生质体,滴到一定形状的多孔醋酸纤维素上。,灭菌,冷却至50,冰箱中冷却,2、海藻酸钙胶固定化法： 用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓度的(36)海藻酸钠溶液，与等体积的一定浓度的原生质体悬浮液混合均匀将此混悬液用滴管或注射器滴到一定浓度的氯化钙溶液中，浸泡12h，制成直径为14mm的球状固定化原生质体。,3、角叉莱胶固定化法： 用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓度(38)的角叉莱胶，加热溶解，灭菌后，冷却至50左右，与等体积的原生质体悬浮液混合均匀，将混悬液滴到定浓度的预冷的氯化钾溶液中，制成球状固定化原生质体。,4、光交联树脂固定化法： 用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制3060浓度的光交联树脂预聚体，加热溶解后，在50左右，加入1光敏剂，与等体积的原生质体悬浮液混合均匀，摊成薄层，经紫外光照射，聚合后切成一定形状的小块，制成片状固定化原生体。,