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    第三章生物信息的传递从DNA到RNAppt课件.ppt

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    第三章生物信息的传递从DNA到RNAppt课件.ppt

    第三章 生物信息的传递(上) - 从DNA到RNA,海洋与环境学院,赵晶,3.1 转录概述3.2 RNA的转录3.3 启动子与转录起始3.4 终止和抗终止3.5 原核与真核生物mRNA的特征比较3.6 内含子的剪接、编辑及化学修饰,Crick的中心法则(central dogma),DNA,1957年,transcription,RNA,translation,Protein,DNA,1970年,Reversetranscription,Protein,RNA,From DNA to Protein,DNA序列是遗传信息的贮存者,它通过自主复制得到永存,并通过转录生成信使RNA,翻译生成蛋白质的过程来控制生命现象。,基因表达包括转录(transcription)和翻译(translation)两个阶段。,转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同(除了TU之外)的RNA单链的过程,是基因表达的核心步骤。 翻译是指以新生的mRNA为模板,把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过程,是基因表达的最终目的。,2006 年度诺贝尔医学奖:发现了RNA干扰现象,Andrew Z. Fire斯坦福医学院病理学和遗传学教授,Craig C. Mello马萨诸塞州医学院分子医学教授,2006 年度诺贝尔化学奖:描述真核细胞的转录,Roger D. Kornberg斯坦福大学医学院医学教授,首位在分子基础上展示真核转录过程是如何运行的。他制作了详细的检晶仪图片,形容了真核细胞转录的整个运传情况。我们在他的图片中可以看到新的RNA反转录酶是如何演变的,和数个在转录过程中必需的其它分子的作用。,RNA主要以单链形式存在于生物体内,(发夹)hairpin,Bulge,Loop(环),RNA chains fold back on themselves to form local regions of double helix.,RNA 二级结构,The double helical structure of RNA resembles the A-form structure of DNA,RNA一般为单链长分子,不形成双螺旋结构.天然RNA只有局部区域为双螺旋结构。RNA中的双螺旋结构为A-DNA类型的结构。每一段双螺旋区至少需要有46对碱基才能保持稳定,同样以氢键和碱基堆积力为稳定因素。一般说,双螺旋区约占RNA分子的50%。RNA的这种结构称为茎环结构,是各种RNA的共同的二级结构特征。,Non-Watson-Crick G:U base pairs represent additional regular base pairing in RNA, which enriched the capacity for self-complementarity,G:U base pair,生物体内拥有三类主要RNA:1、编码特定蛋白质序列的mRNA;2、能特异性解读mRNA 中的遗传信息并将其转化成相应氨基 酸后加入多肽链中的tRNA;3、直接参与核糖体中蛋白质合成的rRNA。,Functions of RNAs,Functions in protein synthesis a. mRNA: as the intermediate between the gene and the protein-synthesizing machinery. b. tRNA: as an adaptor between the codons in the mRNA and amino acids. c. rRNA: play a structural role, as in the case of the RNA components of the ribosome. As genetic material Serving as a template for its own replication in certain virusesRNA as catalysts (ribozyme) Some RNAs (including one of the structural RNAs of the ribosome) are enzymes that catalyze essential reactions in the cell.RNA is a regulatory molecule Small non-coding RNA which through sequence complementarity binds to, and interferes with the translation of certain mRNAs.,转录-生物体以DNA为模板合成RNA的过程转录所需的酶叫RNA聚合酶(依赖DNA的RNA聚合酶),复制和转录的异同点 相同点: 1.都以DNA为模板 2.原料为核苷酸 3.合成方向均为53方向 4.都需要依赖DNA的聚合酶 5.遵守碱基互补配对规律 6.产物为多聚核苷酸链,复制 转录 模板 两股链均作为模板 模板链作为模板 原料 dNTP NTP 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 产物 子代DNA双链 mRNA;tRNA;rRNA 配对 A-T;G-C A-U;T-A;G-C 引物 需RNA引物 - 方式(特点) 半保留复制 不对称转录,不同点,Schematic illustration of transcription,The length of the bubble is 17 bp, and the length of RNA-DNA hybrid within it is 8-9 bp.,DNA-mRNA-the encoded peptide,(sense strand),(antisense strand),编码链(coding strand): 与mRNA序列相同的那条DNA链, 或称有意义链(sense strand).,模板链(template strand): 根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链, 或称反义链(antisense strand)。,negative strand,antisense strand,positive strand,sense strand,Watson strand,Crick strand,转录作用的特点,转录作用是DNA指导的RNA合成作用。 - 反应是以DNA为模板,在RNA聚合酶催化下,以四种三磷酸核苷(NTP)即ATP、GTP、CTP及UTP为原料,各种核苷酸之间的3、5磷酸二酯键相连进行的聚合反应。合成反应的方向为53。RNA合成的方式不对称转录 转录区只有一小段DNA的一条链作为模板链(template strand)进行转录,称为不对称转录:DNA分子上一股可转录,另一股不转录;模板链并非永远在同一单链上.,RNA不对称转录:,反应体系中还有Mg 2+、Mn 2+等参与,反应中不需要引物参与。碱基互补原则为A-U、G-C,在RNA中U替代T与A配对。转录必须成分:RNA polymerase, rNTPs, transcription factors, promoter & terminator,template,在多基因的双链DNA分子中,每个基因的模板不是全在同一条链上,也就是在双链DNA分子中的一条链,对于某基因是有义链,但对另一个基因则可能是反义链。,模板链是针对某一基因而言的。,3.2 RNA的转录3.2.1 转录的基本过程3.2.2 转录机器的主要成分,转录是从DNA分子的特定部位开始的,这个部位也是RNA聚合酶全酶结合的部位。转录时不需引物,由RNA聚合酶催化以NTP为底物,连续合成RNA链。模板DNA上都有终止转录的特殊信号终止子,每个基因或操纵子都有一个启动子和一个终止子。DNA链上从启动子直到终止子为止的序列称为一个转录单位。一个转录单位包括一个或几个基因。,RNA polymerases are enzymes that synthesize RNA using a DNA template (formally described as DNA-dependent RNA polymerases). Promoter is a region of DNA where RNA polymerase binds to initiate transcription.Startpoint (Startsite) refers to the position on DNA corresponding to the first base incorporated into RNA.Terminator is a sequence of DNA that causes RNA polymerase to terminate transcription.Transcription unit is the distance between sites of initiation and termination by RNA polymerase.,Key terms related to transcription,Upstream identifies sequences proceeding in the opposite direction from expression; for example, the bacterial promoter is upstream of the transcription unit, the initiation codon is upstream of the coding region.Downstream identifies sequences proceeding farther in the direction of expression; for example, the coding region is downstream of the initiation codon.Primary transcript is the original unmodified RNA product corresponding to a transcription unit.,在DNA上开始转录的第一个碱基规定为+1,与转录相反的方向称上游(up stream);转录方向为下游(down stream)。在上游方向与转录起点相邻的位置定为-1。,RNA的转录 (Transcription),How does RNA polymerase find promoters on DNA? ( how do proteins distinguish their specific binding sites in DNA from other sequences?),How do regulatory proteins interact with RNA polymerase to activate or to repress specific steps in the initiation, elongation, or termination of transcription?,1、模板识别 (Template Recognition) 2、转录起始 (Initiation) 3、转录的延伸 (Elongation) 4、转录的终止 (Termination),3.2.1 转录的基本过程,1)RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。2)转录起始前,启动子附近的DNA双链分开形成转录泡(transcription bubble),以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。,1. 模板识别,因子控制聚合酶与DNA的结合:只有全酶才能起始转录。因子能够保证RNA聚合酶稳定地结合到某个特异的、唯一的启动子上。核心酶不能区别启动子和其它DNA序列。,1)在起始位点合成RNA链:第一个核苷酸键的产生,该位点被 称为position +1 。2) 转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段。3) 通过启动子的时间代表一个启动子的强弱:时间越短,转 录起始的频率也越高。,2. 转录起始,转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。,一般情况下,转录起始复合物可以进入两条不同的反应途径:合成并释放2-9个核苷酸的短RNA转录物,即所谓的流产式起始;一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸,尽快释放亚基,RNA聚合酶离开启动子区,转录就进入正常的延伸阶段。转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、DNA和新生RNA所组成的转录延伸复合物。,封闭复合物(closed complex),开放复合物(open complex),Transcription initiation involves 3 defined steps,三元复合物(ternary complex ),封闭复合物(closed complex),启动子选择阶段RNA聚合酶全酶对启动子的识别,聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物,DNA仍处于双链状态。,39,开放复合物(open complex),与酶结合的一小段DNA序列的“熔解”导致了闭合复合体转变为开放复合体。这称为紧密结合(Tight binding)。对于强启动子闭合复合体向开放二元复合物的转变是不可逆转的,此反应很快,因子参与熔链过程。,三元复合物(ternary complex ),最开始的两个核苷酸间连接形成第一个磷酸二酯键,这样就产生了三聚体(Ternary complex),包括RNA、DNA和聚合酶。随后加入核苷酸但不发生酶的移动,直到9nt的RNA链为止。,RNA合成的起始,RNA聚合酶全酶+启动子DNA处于双链状态,聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一小段双链被解开,RNA聚合酶、DNA和新生RNA,3、 转录的延伸RNA聚合酶离开启动子,沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。,延伸过程中聚合酶沿DNA移动,不断合成RNA链,随着聚合酶的迁移使DNA解旋,逐渐暴露出新的单链模板。 核苷酸以共价键形式被添加到RNA链的3末端,在解旋区形成一个RNA-DNA杂交链。解旋区之后的DNA模板链又和编码链重新形成双螺旋。RNA形成游离的单链。 RNA链的合成方向也是53。,大肠杆菌RNA聚合酶的活性一般为每秒50-90个核苷酸。 随着RNA聚合酶的移动,DNA双螺旋持续解开,暴露出新的单链DNA模板, 新生RNA链的3末端不断延伸,在解链区形成RNA-DNA杂合物。,4. 转录的终止,合成的终止: 当RNA链延伸到转录终止位点时,RNA polymerase 和RNA链均从DNA模板上释放出来。Terminator(终止子): 通常含有自我互补区域(self-complementary regions) ,在RNA产物中可以形成stem-loop 或hairpin结构。,终止子的作用是在DNA模板的特异位点处终止RNA的合成。然而产生终止作用的是聚合酶转录出的RNA形成的发夹结构。表明终止依赖于RNA产物,而不是由转录中DNA序列来决定。,转录生成mRNA的速度大约是每分钟2500个核苷酸(14个密码子/秒),与翻译速度(15aa/秒)基本相等,但比DNA复制的速度要慢得多(800bp /秒) 。,常识数据,基因开始表达mRNA的间隔约为2.5分钟,而再过半分钟就能在细胞内测到相应的蛋白质。,3.2.2 转录机器的主要成分3.2.2.1 RNA聚合酶 (RNA polymerase)3.2.2.2 转录复合物,3.2.2 转录机器的主要成分,3.2.2.1 RNA聚合酶RNA聚合酶是转录过程中最关键的酶双链DNA为模板4种核苷三磷酸为活性前体Mg2+/Mn2+为辅助因子不需要引物以5 3 方向合成RNA链。缺乏3 5 外切酶活性。是一个含有多个亚单位(multi-subunit)的酶。,RNA pol 执行多功能识别DNA双链上的启动子;使DNA变性在启动子处解旋成单链;通过阅读启动子序列,RNA pol确定它自己的转录方向和模板链。催化适当的NTP以3、5磷酸二酯键相连接,如此连续进行聚合反应完成一条RNA转录本的合成。 最后当它达到终止子时,通过识别停止转录。RNA聚合酶还参与了转录水平的调控。,原核和真核生物的RNA聚合酶虽然都能催化RNA的合成,但在其分子组成、种类和生化特性上各有特色。,1. 原核生物RNA聚合酶RNA聚合酶的特性细胞均具有RNA聚合酶,E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子。它催化RNA主链中核苷酸间的3,5磷酸二酯键的形成,在37时RNA链的延伸速度可达40nt/s(翻译速率15密码子/s,复制速率800bp/S)。RNA的合成必须有DNA模板存在,并且要非常精确。转录作用并没有校正(proofreading)机制。,原核生物RNA聚合酶的组成原核生物的RNA聚合酶是由 等亚基和2个Zn2+构成的全酶(Holoenzyme)。呈椭圆球形结构,全酶可结合约60bp的DNA序列。,2 alpha () subunit,1 beta () subunit, 1 beta prime () subunit, 1 omega () subunit,1 sigma () subunit,Core enzyme,Holoenzyme聚合酶全酶,相对分子量:4.65105KD,参与转录延伸,只与转录的起始有关,36.5 KD,36.5 KD,151 KD,155 KD,11 KD,70 KD,原核生物RNA聚合酶各亚基的功能, subunit是核心酶中的两个相同的亚单位由rpoA 基因编码与核心酶的组装有关亚基的功能可能是识别其相应的启动子并参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用,E. coli RNA polymerase :, & subunit 和分别由 rpoB 和 rpoC 基因编码。 和共同组成了酶的催化中心。它们的序列与真核生物RNA聚合酶的最大亚基有同源性。亚基可能是酶和核苷酸底物结合的部位。 亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。 rpoB 和 rpoC 基因的突变会影响转录所有的阶段。利福平(rifampicin)和利福霉素(rifamycin)可与亚基结合,阻止RNA链的延伸(而不影响起始,它使聚合酶停留在启动子处),从而抑制转录的发生。亚基的基因rpoB的突变可使细菌对利福平有抗性。亚基是酶与DNA模板结合的主要成分。,The and subunit of RNA polymerase have a channel for the DNA template., factor负责模板链的选择和转录的起始。与因子的结合使RNA聚合酶从核心酶转变为聚合酶全酶。帮助核心酶辨认启动子;解开DNA的双螺旋。不仅增加聚合酶对启动子的亲和力(提高103倍),还可降低它对非专一位点的亲和力(降低104倍),使酶底复合物的半衰期小于1s。在细胞中对因子量的需求少于聚合酶中其它亚单位。全酶上亚基结合不牢固,当亚基脱离后,2称为核心酶。核心酶可催化核苷酸间磷酸二酯键的形成。,大肠杆菌中的因子能识别并与启动子区的特异性序列相结合,70 当与核心酶结合时会改变其结构,以释放其DNA-结合区域.70 与 35 和 10 序列均结合。,在某些细菌中含有识别不同启动子的因子,以适应不同生长发育阶段的要求,控制不同基因转录的起始,这在基因表达调控中有重要作用。,原核生物RNA聚合酶基因E. coli RNA pol各亚基的基因存在于3个操纵子中。细菌的RNA聚合酶远比某些噬菌体特有的RNA聚合酶结构大且复杂例如噬菌体T3和T7的RNA聚合酶分子很相似,都是一条多肽链,MW约11kD。它们在37时合成RNA速率可达200nts/s。E. coli宿主细胞RNA聚合酶能转录细胞内的任意一个转录单位。大多数转录单位需要更多的蛋白质因子存在下才能被RNA聚合酶所转录。所以宿主细胞具有大而复杂的RNA聚合酶在与许多其他因子相互作用中起主要作用,而不是其催化活性的要求。,T3 和 T7 噬菌体的RNA 聚合酶是由一条小的多肽链组成, 相对分子量小于1105;在37C下,其转录速度为 200 nt/秒;它们只能识别不同于E. coli 启动子的自身的启动子。,RNA polymerase differs from organism to organism,RNA链的延伸速度可达40nt/s,有3类RNA聚合酶;结构比大肠杆菌RNA聚合酶复杂;在细胞核中的位置不同;负责转录的基因不同,对-鹅膏蕈碱的敏感性也不同。真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所组成,相对分子质量超过5105。,2. 真核生物的RNA聚合酶,真核细胞中三类RNA聚合酶特性比较,*hnRNA: heterogeneous muclear RNA,核内不均一RNA, 是mRNA的前体,RNA合成抑制剂主要分两类:1. 模板结合抑制剂2. 聚合酶抑制剂在动、植物及昆虫的细胞中,RNA pol 的活性可被低浓度的-鹅膏蕈碱所抑制。但却不抑制pol 。Pol 对-鹅膏蕈的反应,不同的生物有所差异。在动物细胞中高浓度的-鹅膏蕈可抑制转录,在昆虫中不受抑制。,真核生物RNA聚合酶的主要特征聚合酶中有两个相对分子质量超过1105的大亚基;同种生物3类聚合酶有“共享”小亚基的倾向,即有几个小亚基是其中3类或2类聚合酶所共有的。,真核生物RNA聚合酶的亚基,注:亚基按照分子量由大到小的顺序排列。,真核生物RNA聚合酶一般有8-16个亚基所组成, 相对分子质量超过5105。,真核生物线粒体和叶绿体中存在不同的RNA聚合酶,线粒体中RNA聚合酶:只有一条多肽链,相对分子量小于7 X 104,是已知最小的RNA聚合酶之一;与T7噬菌体RNA聚合酶有同源性。叶绿体中RNA聚合酶:比较大;结构上与细菌中的聚合酶相似,由多个亚基组成,部分亚基由叶绿体基因编码。,线粒体和叶绿体RNA聚合酶活性不受-鹅膏蕈碱所抑制。,a,a,b,w,RPB3,RPB11,RPB2,RPB1,RPB6,The same color indicate the homologous of the two enzymes,prokaryotic,eukaryotic,b,“Crab claw” shape of RNAP,Active center cleft,模板DNA进入转录复合体的路径,(A)俯瞰图。双螺旋DNA用倾斜的圆筒表示,TF II转录因子的结合位点用虚圈表示;,(B)后视图。DNA从钳子型结构和墙体或平滑结构的中间穿越。,There are various channels allowing DNA, RNA and ribonucleotides (rNTPs) into and out of the enzymes active center cleft,RNA polymerase/transcription and DNA polymerase/replication,3.2.2 转录机器的主要成分3.2.2.1 RNA聚合酶 (RNA polymerase)3.2.2.2 转录复合物,封闭复合物,开放复合物,三元复合物,RNA合成起始,RNA聚合酶全酶+启动子DNA处于双链状态,聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一小段双链被解开,RNA聚合酶、DNA和新生RNA,转录复合物,除RNA聚合酶之外,真核生物转录起始过程中至少还需要7种辅助因子参与。,真核生物RNA聚合酶II所形成的转录起始复合物,TF:Transcription Factor;:RNA Pol。,真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区,需要一些被称为转录调控因子的辅助蛋白质按特定顺序结合于启动子上,RNA聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物(PIC)以保证有效地起始转录。,前起始复合物(preinitiation transcription complex, PIC),Assembly of the pre-initiation complex in presence of mediator, nucleosome modifiers and remodelers, and transcriptional activators,Mediator consists of many subunits, some conserved from yeast to human.,Only subunit Srb4 is essential for transcription of essentially all Pol II genes in vivo.,PNAS 2007 vol. 104 no. 32 1295512961,Trends in Microbiology, Vol 16(3), 2008, Pages 126-134,3.3 启动子与转录起始,转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基,通常为嘌呤。把起点5末端的序列称为上游(upstream),把其3末端的序列称为下游(downstream)。,转录单元(transcription unit),在原核中90%为嘌呤,A或G;位置固定 ; 通常在起始核苷酸的两侧为C 和 T (i.e. CGT or CAT),转录起始位点 (Transcription start site),启动子区的基本结构,启动子是一段位于结构基因5端上游区的保守的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。,启动子与转录起始,大肠杆菌RNA聚合酶与启动子的相互作用主要包括: 启动子区的识别; 酶与启动子的结合; 因子的结合与解离。,转录的起始是基因表达的关键阶段,而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力,从而影响了基因表达的水平。,3.3.1 原核生物基因的启动子,启动子(Promoter)启动子是由一些短的保守序列组成的。转录时RNA聚合酶在DNA分子上与启动子识别和结合。启动子是DNA上可与RNA聚合酶特异结合并起始转录的部位(序列),位于转录起点附近。启动子可位于上游,也可在下游(个别)。,1975年,Pribnow和Schaller将RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后,用DNaseI降解DNA,得到4144个核苷酸对的DNA片段。,-10区(Pribnow区)的发现,序列分析发现,在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的保守序列,是聚合酶结合位点,称为Pribnow区(Pribnow box),其中央大约位于起点上游10bp处,所以又称为10区。,2. -10序列 (Pribnow框盒),1)结构其保守序列为TATAAT,位于-10bp左右,其中3端的“T”十分保守。A.T较丰富,易于解链。它和转录起始位点I一般相距5bp。 2)功能: RNA pol紧密结合; 形成开放启动复合体; 使RNA pol定向转录。,Pribnow-Schaller箱子,如果把Pribnow区从TATAAT变成AATAAT就会降低启动子的效率,发生下降突变(down mutation);如果增加Pribnow区的共同序列,将乳糖操纵子的启动子中的TATGTT变成TATATT,就会提高启动子的效率,称为上升突变(up mutation)。,科学家又从噬菌体的左、右启动子PL及PR和SV40启动子的35 bp附近找到了另一段共同序列:TTGACA。,3. -35区的发现,提纯被保护的片段后却发现,RNA聚合酶并不能重新 结合或并不能选择正确的起始位点,表明在保护区外可能还存在与RNA聚合酶对启动子的识别有关的序列。,4. -35序列 (Sextama盒),1)结构其保守序列为TTGACA,与-10序列相隔16-19bp。2)功能: (1)为RNA pol的识别位点。 (2)RNA Pol的核心酶只能起到和模板结合和催化的功能,并不能识别-35序列,只有亚基才能识别-35序列,为转录选择模板链。,35区 10区T85T83G81A61C69A52T89A89T50A65A100,-10区:5-T80A95T45A60A50T96,称Pribnow box,RNA聚合酶就结合在此部位上。-35区:5-T82T84G78A65C54A45;与转录起始的辨认有关,是亚基识别并结合的位置。-35序列在很大程度上决定了启动子的强度。,比较原核生物的100多个启动子的序列后发现:在RNA转录起始点上游大约-10bp和-35bp处有两个共同的顺序,称为-10和-35序列。,小结:,启动子的35区和10区包含了与聚合酶接触的大多数位点。这些位点经修饰后可阻止与聚合酶结合,并且这些位点在结合聚合酶后对修饰的敏感性增加或降低。,5. 10区和35区的最佳距离,在原核生物中, 10区和35区的最佳距离大约是1619 bp。过大或过小都会降低转录活性。 这可能是因为RNA Pol本身的大小和空间结构有关。,6. 不同启动子启动效率不同,分为强启动子(1-2sec启动1次转录)和弱启动子(10min启动1次)。,7. 其他,尽管启动子具有保守序列,但不同类型在序列上存在差异,不同因子识别不同类型的启动子。有很多调节蛋白(激活剂和阻遏物,如CAP)参与识别过程。启动子保守序列以外的序列,特别是上游序列对启动子的启动有影响。,gene,TTGACAAACTGT,TATAATPuATATTAPy,transcribed initiation site,-50 -40 -30 -20 -10 1 10,5,Recognition site,Binding sitePribnow box,promoter 40-80bp,1,2,3,(1)结构典型,都含有识别(R),结合(B)和起始(I)三个位点;(2)序列保守,如-35序列,-10序列结构都十分保守;(3)位置和距离都比较恒定;(4)直接和多聚酶相结合;(5)常和操纵子相邻;(6)都在其控制基因的5端,例外;(7)决定转录的启动和方向。,原核生物启动子的共同的特点,3.3.2 真核生物启动子的结构特点,1.真核生物RNA聚合酶II所识别的启动子区,1)Hogness等发现类似Pribnow区的Hogness区,在转录起始点上游2530 bp处,保守序列为TATAAA,也称TATA区。,富含A、T,TATA框决定了转录起点的选择。,2)在起始位点上游7078 bp处还有另一段共同序列CCAAT,称为CAAT区(CAAT box)。CAAT框与转录起始频率有关。,1. 核心元件TATA box: 2530 bp区启始子(initiator,Inr) :转录起始位点附近2. 上游启动子元件( upstream promoter element, UPE):将TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件或称上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)。CAAT box :7080区CCAAT序列GC box: 80110含有GCCACACCC 或GGGCGGG序列。,小结:,1)TATA区-使转录精确地起始:如果除去TATA区或进行碱基突变,转录产物下降的相对值不如CAAT区或GC区突变后明显,但发现所获得的RNA产物起始点不固定。,2. 真核生物启动子对转录的影响,2) CAAT区和GC区主要控制转录起始频率:基本不参与起始位点的确定。,研究SV40晚期基因启动子发现,上游激活区的存在与否,对该启动子的生物活性有着根本性的影响。若将该基因5 上游2147核苷酸序列切除,基因完全不表达。,增强子(enhancer)1981年由Benerji, Rusconi小组和Chambom等发现的,又称远上游序列(far upstream sequence)。已在SV40的转录单元上发现其转录起始位点上游约200bp处有两段72bp长的重复序列,它们不是启动子的一部分,但能增强或促进转录的起始,因此,称这种能强化转录起始的序列为增强子或强化子(enhancer)。真核转录起始点附近有增强子,它能增强启动子的活性,可存在于启动子上游或下游。,3. 远端调控区,增强子(Enhancer ),增强子很可能通过影响染色质DNA蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结构,从而使得RNA聚合酶更容易与模板DNA相结合,起始基因转录。,An enhancer can activate a promoter from upstream or downstream locations, and its sequence can be inverted relative to the promoter.,增强子特点, 具有远距离效应:常在上游-200bp处,但可增强远处启动子的转录,即使相距十几Kb也能发挥其作用; 无方向性:无论在靶基因的上游,下游或内部都可发挥增强转录的作用; 顺式调节:只调节位于同一染色体上的靶基因,而对其它染色体上的基因无作用; 无物种和基因的特异性:可以接到异源基因上发挥作用; 具有组织的特异性:SV40的增强子在3T3细胞中比多瘤病毒的增强子要弱,但在HeLa细胞中SV40的增强子比多瘤病毒的要强5倍。增强子的效应需特定的蛋白质因子参与。 有相位性:其作用和DNA的构象有关。 有的增强子可以对外部信号产生反应:如热体克基因在高温下才表达。编码重金属蛋白的金属硫蛋白基因在镉和锌存在下才表达。某些增强子可以被固醇类激素所激活。,真核生物的启动子特点,(1)有多种元件:TATA框,GC框,CATT框,OCT等;(2)结构不恒定。有的有多种框盒,如组蛋白H2B;有的只有TATA框和GC框,如SV40早期转录蛋白;(3)它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同;(4)有的有远距离的调控元件存在,如增强子;(5)这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用;(6)不直接和RNA pol结合。转录时先和其它转录激活因子相结合,再和聚合酶结合。,3.4 终止和抗终止3.4.1 原核生物的两类终止子 1)不依赖于因子的终止(intrinsic terminator,内在) 2)依赖于因子的终止3.4.2 真核生物转录终止3.4.3 抗终止,Rho非依赖型终止子的序列,由两个序列原件组成:有一富含G:C的二重对称区,由这段DNA转录产生的RNA容易形成发夹(茎环)结构其下游有6-8个U;,茎环结构,可阻止RNA pol的前进。由于它和模板形成的连续U-A配对较易打开,从而便于释放出RNA。,1)不依赖于(Rho)因子的终止,可能RNA产物形成的所有发夹都会减慢(或暂停)转录。聚合酶的暂停为终止发生提供了一个机会。如果暂停位点与终止子不一致,则酶继续进行转录。,正确位置(7-9nt)的一段U残基是RNA pol遇到发夹而暂停时从模板解离下来所必需的。转录产生的RNA-DNA杂交链中的rU:dA碱基配对结构很弱,极易被破坏。当聚合酶暂停时,RNA-DNA杂交链从终止区的弱键rU:dA处解开。,提纯的RNA聚合酶并不能识别特异性的转录终止信号,而加入大肠杆菌因子后该聚合酶就能在DNA模板上准确地终止转录。依赖型终止作用所需的序列长50-90nt(dependent termination, 称为rut位点),位于终止位点上游。它们的共同特征是RNA富含C而少G。依赖型终止子的终止效率随rut区域长度增加而提高。,2)依赖于因子的终止,依赖的终止子中G:C对含量较少,终止子没有多聚dA序列,转录的RNA在终止子处可形成不稳定发夹结构,引起聚合酶转录暂停。,因子,因子是一个相对分子质量为2.0105的六聚体蛋白。亚基具有一个RNA结合域和ATP水解域。其功能是作为RNA

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