第8章蛋白质分选与膜泡运输ppt课件.ppt

第8章 蛋白质分选与膜泡运输,本章主要内容,细胞内蛋白质分选细胞内膜泡运输,http:/www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2013/,James E. Rothman Randy W. Schekman Thomas C. Sdhof,Prize motivation: for their discoveries of machinery regulating vesicle traffic, a major transport system in our cells,2013 Nobel Prize in Physiology and Medicine,细胞内囊泡交通的运行与调节机制,细胞内囊泡交通的运行与调节机制,生物体内每一个细胞都是一个生产和运输分子的工厂。比如，胰岛素在这里被制造出来并释放进入血液当中，以及神经传递素从一个神经细胞传导至另一个细胞。这些分子在细胞内都是以“小包”的形式传递的，即细胞囊泡。这三位获奖科学家发现了这些“小包”是如何被在正确的时间输运至正确地点的分子机制。,获奖科学家简历,James E. Rothman，1950年出生于美国马萨诸塞州Haverhill，他于1976年在哈佛大学医学院获得博士学位，随后在麻省理工学院做博士后研究工作。1978年Rothman前往加州的斯坦福大学，并在那里开始进行针对细胞囊泡的研究工作。Rothman还曾经在普林斯顿大学以及纪念斯隆-凯特林癌症研究所和哥伦比亚大学工作过。2008年，他开始在耶鲁大学任职，目前是耶鲁大学细胞生物学系系主任和教授。,Randy W. Schekman，1948年生于美国明尼苏达州St Paul，曾先后在加州大学洛杉矶分校以及斯坦福大学求学，并于1974年获得博士学位，指导老师为Arthur Kornberg，后者是1959年度诺贝尔奖获得者。1976年，Schekman前往加州大学伯克利分校任职，目前他仍然是该校分子与细胞生物学系教授。同时Schekman也是霍华德休斯医学研究所研究员。,Thomas C. Sdhof，1955年生于德国哥廷根。他在哥廷根大学求学并于1982年获得硕士学位，同年获得该校神经化学博士学位。1983年他前往美国达拉斯的德州大学西南医学研究中心开展博士后研究，其导师是Michael Brown和Joseph Goldstein，他们是1985年度诺贝尔生理学与医学奖得主。Sdhof在1991年成为霍华德休斯医学研究所研究员，并在2008年开始担任斯坦福大学分子与细胞生理学教授。,生物体内细胞的正常运转有赖于让合适的分子在合适的时间抵达合适的位置。一部分分子，如胰岛素，需要被转运出细胞之外，而其他分子则需要被在细胞内部进行运输。细胞内部产生的分子被包裹于囊泡之中（图中蓝色表示），但是这些囊泡具体是如何达成这种精准的运输的？这一点一直没有被理解。,研究背景,Randy W. Schekman发现基因控制下的蛋白质在这种囊泡运输机制中起到重要作用。正如这里的图上所展示的那样，通过对比正常酵母菌细胞（左）和转运机制缺陷的细胞（右），他成功识别出操控这一转运过程的基因。,具体发现,James E. Rothman发现一种蛋白质化合物（图中橘色表示）可以让囊泡实现与目标细胞膜的融合。囊泡上的蛋白质物质会与目标细胞膜上的特定蛋白质之间发生结合，从而让囊泡可以在正确的位置上释放其所运载的特殊“分子货物”。,Thomas C. Sdhof研究了大脑中神经细胞之间是如何互相传递信号的，以及钙离子在这一过程中所起的作用。他识别出一种分子机制（图中用紫色表示），其可以对进入的钙离子发生反应并触发囊泡融合，从而解释了囊泡输运机制中时间的精确性是如何达成的，以及其所携带的信号分子物质是如何能做到受控释放。,今年的3位诺奖获奖科学家发现了细胞生理学过程中的一项关键过程。他们的工作揭示了细胞内部和外部的输运体系是如何达成时间与位置上的精确性的。在细胞中，不管是酵母菌还是人类，不管高等生物还是低等生物，它们体内的囊泡输运以及细胞膜融合机制都遵循相同的基本原理。这一体系对于一系列的生理过程而言都至关重要，从大脑信号的传递，到荷尔蒙的释放，再到免疫细胞活素。但当发生疾病时，细胞内的囊泡输运机制会出现问题，这当中包括一些神经系统和免疫系统疾病。离开这一堪称完美的控制机制，细胞将陷于混乱。,囊泡输运机制与疾病过程,第一节 细胞内蛋白质的分选,真核细胞中绝大多数蛋白质都是由核基因编码，在游离核糖体上起始合成,一、信号假说与蛋白质分选信号,1999 年诺贝尔生理学或医学奖,发现蛋白质由内部信号决定其在细胞内的转移和定位,1975年Blobel和sabatini等提出了信号假说（signal hypothesis），即分泌性蛋白N端作为序列信号肽（signal sequence或signal peptide），指导分泌性蛋白到内质网膜上合成，在蛋白合成结束前信号肽被切除。信号识别颗粒(SRP)和内质网膜上的信号识别颗粒的受体（停泊蛋白,DP）等因子协助完成这一过程。,1. 信号假说,信号肽（signal peptide）信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP）信号识别颗粒的受体（又称停泊蛋白，docking protein，DP）,（1）信号肽（signal peptide）,位于蛋白质的N 端，一般由1626 个残基组成包括疏水核心区、信号肽的C 端和N 端等3 部分原核细胞某些分泌性蛋白的N 端也具有信号序列,信号肽的一级结构序列,信号肽（signal peptide）：引导新合成的肽链转移到内质网上合成的信号序列称为信号肽，位于新合成肽链的N端，一般16-26个氨基酸残基，含有6-15个连续排列的带正电荷的非极性氨基酸，包括疏水核心区、信号肽的C端和N端三部分。由于信号肽又是引导肽链进入内质网腔的一段序列，又称开始转移序列（start transfer sequence）；信号肽没有严格的专一性，目前尚未发现共同的信号序列。,旦赖-色 缬 苏笨异丝丝亮亮笨亮笨- 丝丝丙络丝-,蛋白质N-端的信号肽,信号肽似乎没有严格的专一性,信号肽与信号斑,信号斑（signal patch）：存在于完成折叠的蛋白质中，构成信号斑的信号序列之间可以不相邻，折叠在一起构成蛋白质分选的信号。,一些典型的分选信号,（2）信号识别颗粒（SRP）,由6 种不同的蛋白质和一个由300 个核苷酸组成的 7S RNA 结合组成的一种核糖核蛋白复合体,分泌性蛋白N端序列为信号肽，指导分泌蛋白到内质网上合成，在蛋白合成结束之前信号肽被切除。信号识别颗粒和内质网膜上的信号识别颗粒的受体（停泊蛋白）等因子协助完成这一过程。,信号识别颗粒的受体,信号识别颗粒,蛋白质翻译过程与SRP、DP和微粒体的关系,体外非细胞系统（cell free system）进行蛋白质合成实验，证实分泌性蛋白向rER（微粒体）腔内的转运是同蛋白质翻译过程偶联进行的，这种分泌蛋白在信号肽引导下边翻译边跨膜转运的过程称为共翻译转运 （cotranslational translocation）,（3）分泌性蛋白的合成与其共翻译转运,分泌性蛋白的合成与其跨越内质网膜的共翻译转运图解 图示信号肽、SRP、DP 及移位子之间的相互作用,31,内质网腔,细胞质,SRP受体,信号识别颗粒,(SRP),核糖体结合蛋白,tRNA,A,P,核糖体,mRNA,信号肽,A,（4）膜整合蛋白的信号序列,开始转移序列（start transfer sequence）内在停止转移锚定序列（internal stop-transfer anchor sequence, STA）内在信号锚定序列（internal signal anchor sequence, SA）,p139,内质网膜整合蛋白的拓扑学类型,信号假说,蛋白质的合成都是起始于细胞质基质中的核糖体，但是向细胞外分泌的蛋白等在合成开始不久后便转在内质网上合成。C. Milstein 1972发现从骨髓瘤细胞提取的免疫球蛋白分子N端要比分泌到细胞外的N端多出一段。G. Blobel和D. Sabatini等根据进一步的实验，提出了信号假说（Signal hypothesis），认为蛋白质上的信号肽，指导蛋白质转至内质网上合成。蛋白质转入内质网合成至少涉及5种成分： 信号肽（signal peptide），是引导新合成肽链转移到内质网上的一段多肽，位于新合成肽链的N端，一般1630个氨基酸残基，由于信号肽又是引导肽链进入内质网腔的一段序列，又称开始转移序列（start transfer sequence）。 信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP），属于一种核糖核蛋白，位于细胞质基质中。SRP与信号序列结合，导致蛋白质合成暂停。 停泊蛋白（docking protein，DP），是膜的整合蛋白，存在于内质网上，可与SRP特异结合。 停止转移序列（stop transfer sequence），肽链上的一段特殊序列，与内质网膜的系合力很高，能阻止肽链续进入内质网腔，使其成为跨膜蛋白质。 转位因子（translocator），由3-4个Sec61蛋白复合体构成的一个类似于油炸圈的结构，每个Sec61蛋白由三条肽链组成。蛋白质转入内质网合成的过程：信号肽与SRP结合肽链延伸终止SRP与受体结合SRP脱离信号肽肽链在内质网上继续合成，同时信号肽引导新生肽链进入内质网腔信号肽切除肽链延伸至终止翻译体系解散。这种肽链边合成边向内质网腔转移的方式，称为co-translation。,导肽与后转移,导肽：线粒体、叶绿体、过氧化物酶体蛋白带有某种信号序列，引导其进入各自细胞器。后翻译转运：蛋白质在细胞质基质中合成以后再转移到这些细胞器中，称后翻译转运或后转移（post translocation）。基本的特征：蛋白质跨膜转移过程需要ATP使多肽去折叠，还需要一些蛋白质的帮助（如热休克蛋白Hsp70）使其能够正确地折叠成有功能的蛋白。,2. 蛋白质分选信号序列,二、蛋白质分选转运的基本途径与类型,途径（1）后翻译转运途径（2）共翻译转运途径类型（1）蛋白质的跨膜转运（2）膜泡运输（3）选择性的门控转运（4）细胞质基质中蛋白质的转运,（一）细胞内蛋白质分选的基本途径,1后翻译转运途径：蛋白质在核糖体上合成后释放到细胞质中，带分选信号的被分别运送到细胞核、线粒体和过氧化物酶体中，大多数蛋白没有分选信号，留在胞质中。2共翻译转运途径：蛋白质在核糖体上开始合成后不久，N-端的信号肽使核糖体附着于粗面内质网上继续合成，多肽链穿过内质网膜。,留存内质网,再次运送到其它部位如高尔基复合体,游离于内质网腔成为可溶性蛋白,插入内质网膜成为跨膜蛋白,真核细胞蛋白质分选的主要途径与类型,二、蛋白质分选转运的类型,1.蛋白质跨膜运输（transmembrane transport）：蛋白质通过跨膜通道进入目的地。2.膜泡运输（vesicular transport）：蛋白质被选择性地包装成运输小泡，定向转运到靶细胞器。如内质网向高尔基体的物质运输、高尔基体分泌形成溶酶体、细胞摄入某些营养物质或激素，都属于这种运输方式。 3.选择性门控运输（gated transport）：如核孔可以选择性的主动运输大分子物质和RNP复合体，并且允许小分子物质自由进出细胞核。4.细胞质基质中蛋白的转运与细胞骨架密切相关,第二节 细胞内膜泡运输,膜流（membrane flow）,高尔基体与细胞内膜泡运输,膜流(membrane flow)：细胞各种膜性结构之间相互联系和转移的现象称膜流。,运输小泡,高尔基体,大囊泡,细胞膜,内质网,42,一、膜泡运输概观,1. 蛋白质在rER 合成，通过共翻译转运途径跨膜运输2. 内质网出芽，形成转运膜泡并与高尔基体融合3. 从高尔基体顺面膜囊和高尔基体顺面网状结构到rER的逆向运输4. 高尔基体膜囊从顺面反面成熟递进（非膜泡过程）5. 从高尔基体后期膜囊早期膜囊的逆向运输6. 组成型分泌7. 调节型分泌8. 分选到溶酶体9. 胞吞途径,蛋白质的分泌与胞吞途径概观,内膜系统与膜流,膜流(membrane flow):是指细胞的膜成分在质膜与内膜之间，以及在内膜系统各种结构之间流动的现象。又称为小泡流(vesicle flow)。 膜流过程中，提供膜性小泡的膜结构成为供体房室(donor compartment)或供体膜，接受膜性小泡的膜结构成为受体房室(acceptor c.)或受体膜。膜的再循环(membrane recycling)实现细胞器膜成分的内在平衡机制(homeostatic mechanisms)。 结构性分泌途径(constitutive secretory pathway)与调节性分泌途径(regaluted s. p.) 。 前向运输(anterograde t.)与反向运输(retrograde t.)。,三种包被的膜泡,COP（coat protein ） 包被膜泡COP（coat protein）包被膜泡网格蛋白/ 接头蛋白（clathrin/ adaptor protein）包被膜泡,三种包被膜泡特征比较,二、COP 包被膜泡的装配与运输,COP包被蛋白组分小分子GTP 结合蛋白Sar1Sec23/Sec24 复合物Sec13/Sec31 复合物大的纤维蛋白Sec16,COPII包被小泡,负责从内质网高尔基体的物质运输；COPII包被蛋白由5种蛋白亚基组成；包被蛋白的装配是受控的； COPII包被小泡具有对转运物质的选择性并使之浓缩。选择性的确定，一是因为COP II蛋白能识别并结合跨膜内质网蛋白胞质面一端的信号序列（Asp-X-Glu），二是内质网腔面的受体能与ER腔中的可溶性蛋白（如分泌蛋白）结合。,细胞质中可溶性 Sar1- GDP 与ER 膜蛋白Sec12（鸟苷酸交换因子）相互作用， 催化GTP 置换GDP 形成Sar1-GTP，GTP 的结合引发 Sar1 构象改变暴露出疏水N 端并插入ER 膜，膜结合Sar1 对包被蛋白进一步装配起募集者作用,小分子GTP 结合蛋白Sar1,1. Sar1与膜结合GTP交换 2. COP包被装配 3. GTP水解 4. COP包被去装配,Sar1 蛋白在Cop包被膜泡装配与去装配中作用,转运方向：回收、转运内质网逃逸蛋白 返回内质网。转运从ERER-Golgi ICGolgiCOPI包被成分：8种蛋白亚基COPI包被装配：装配与去装配依赖于ARF细胞器中保留及回收蛋白质的两种机制： 转运泡将应被保留的驻留蛋白排斥在外，防止出芽转运 通过识别驻留蛋白C-端的回收信号的特异性受体，以COPI-包被小泡的形式捕获逃逸蛋白。,三、COP 包被膜泡的装配与运输,COP包被含有7 种不同的蛋白质亚基和一种调节膜泡转运的 GTP 结合蛋白ARF。ARF也是一种结合 GDP/GTP 转换的分子开关调控蛋白。包被蛋白复合物的装配与去装配依赖于ARF 所结合的核苷酸交换与水解过程,KDEL的受体主要定位在高尔基体TGN区、COP和COP包被膜泡的膜上，它们能识别并 结合KDEL分选信号。如果在内质网发生错误包装和转运，由于COP膜泡上也有KDEL受体，所以也能保证逃逸蛋白被内质网回收。,KDEL 的受体,在内质网与高尔基体之间，分别由COP和COP膜泡介导蛋白质顺向和逆向转运,不同类型的膜泡运输,KDEL 受体在从高尔基体回收内质网腔驻留蛋白中的作用,不同类型的膜泡运输,在供体膜内质网出芽及其转运蛋白的包装示意图,不同类型的膜泡运输,网格蛋白衣被小泡是最早发现的衣被小泡，介导高尔基体反面到内体、溶酶体、植物液泡的运输，以及质膜到内膜区隔的膜泡运输。,四、网格蛋白/接头蛋白包被膜泡的装配与运输,发动蛋白：,（1）网格蛋白：包被囊泡表面，提高囊泡表面张力,网格蛋白,由3个重链和3个轻链组成，形成一个具有3个曲臂的形状。许多笼形蛋白的曲臂部分交织在一起，形成具有多边形网孔的笼子,网格蛋白小泡,Clathrin coated vesicles,（2）衔接蛋白：可分别与网格蛋白和被转运的分子相结合，位于网格蛋白和囊泡之间，能催化网格蛋白的聚合、捕获转运分子。,（3）发动蛋白：囊泡颈部，水解GTP使囊泡释放,网格蛋白及其包被膜泡的形成,网格蛋白/ 接头蛋白包被膜泡介导的蛋白质分选途径从高尔基体TGN向胞内体或向溶酶体、 黑（色）素体、血小板囊泡和液泡的运输受体介导的胞吞途径中负责将物质从细胞表面运往胞内体转而到溶酶体的运输,五、转运膜泡与靶膜的锚定与融合, 供体膜的出芽、装配和断裂，形成不同的包被转运膜泡 在细胞内由马达蛋白驱动、以微管为轨道的膜泡运输 转运膜泡与特定靶膜的锚定和融合,过 程,胞质中Rab 蛋白在特异性鸟苷酸交换因子（GEF）催化下，Rab-GDP 转换为Rab-GTP，构象改变致使其通过类异戊二烯基团插入转运膜泡表面，与靶膜上Rab 效应器结合蛋白相互作用，从而使转运膜泡被锚定在靶膜上,Rab 蛋白参与膜泡的锚定,供体膜和靶膜之间膜泡的锚定与融合模式,膜泡运输是特异性过程，涉及多种蛋白识别、组装-去组装的复杂调控,膜泡融合是特异性的选择性融合，从而指导细胞内膜流的方向。选择性融合基于供体膜蛋白与受体膜蛋白的特异性相互作用。 在细胞的膜泡运输中，粗面内质网相当于重要的物质供应站，而高尔基体是重要集散中心。高尔基体在细胞的膜泡运输及其随之而形成的膜流中起枢纽作用，因此高尔基体聚集在微管组织中心(MTOC)附近并在高尔基体膜囊上结合有类似动力蛋白的蛋白质，从而使高尔基体维持其极性。识别过程的两类关键性的蛋白质是SNAREs（soluble NSF attachment protein receptor）和Rabs（targeting GTPase）。 SNAREs的作用是保证识别的特异性和介导运输小泡与目标膜的融合。NSF（N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein, NSF）催化 SNAREs的分离，它是一种类似分子伴娘的ATP酶，能够利用ATP作为能量通过插入几个适配蛋白（adaptor protein）将SNAREs复合体的螺旋缠绕分开。Rab也叫targeting GTPase，属于单体GTP酶，结构类似于Ras，已知30余种。不同膜上具有不同的Rab，每一种细胞器至少含有一种以上的Rab。Rabs的作用是促进和调节运输小泡的停泊和融合。,六、细胞结构体系的组装,生物大分子的组装方式自我装配（selfassembly） 协助装配（aided-assembly）直接装配 （direct-assembly）细胞结构及结构体系之间的组装,六、细胞结构体系的组装,装配的生物学意义减少和校正蛋白质合成中出现的错误可大大减少所需的遗传物质信息量通过装配与去装配更容易调节与控制多种生物学过程,本章小结,蛋白质分选信号信号假说细胞内蛋白质分选的途径与类型膜泡运输,Thank you!,