第七章 生物质谱技术ppt课件.ppt
第七章生物质谱技术,2, 生物质谱概念与分类, 质谱的基本原理, 数据库检索与蛋白质鉴定,3,一、质谱原理 1、发展历史, 1886：Goldstein发明早期质谱仪的离子源 1912：质谱仪问世，对小分子化合物进行分析1942: 第一台单聚焦质谱仪商品化 50年代发展了气-质联用，进入混合物分析阶段,4,等离子体解吸（plasma desorption, PD）、快原子轰击（fast atom bombardment, FAB）：几千Da80 年代末发明了两相软电离质谱技术ESI-MS 和 MALDI-TOF-MS.出现生物质谱，使质谱仪的应用又发生了一次飞跃，开始分析生物大分子 给生命科学研究带来的影响是革命性的！,5,6,2、质谱基本原理 按离子质量数 m 与电荷数 z 的比值（称质荷比m/z）大小顺序排列，应用电磁学原理，分离和测定离子化了的分子或原子质量，它是一种物理方法，即物质粒子的质量谱。质谱原理： 简单！ 能量守恒原理质谱仪器： 不简单！ 能量守恒原理的具体实施者,7,质谱仪的基本组成1.离子源2. 静电加速系统3.分离系统4.检测器和读出系统特点高真空度：机械泵（10-2），涡轮分子泵、油扩散泵 （10-7-8）高电压：至2-3万伏接气相色谱、液相色谱：分析混合物,加速电场,8,样品导入系统：固体坩埚、样品靶、毛细管、探针等离子源：电子轰击、场电离、场解析、化学电离、激 光电离、电喷雾等加速系统：高静电场分离系统：电磁铁、四极杆、飞行管、离子阱以及混 合分离器检测系统：电子倍增器、光电倍增管、微通道板（M CP）等数据处理系统：模数转换系统、示波器、计算机,9,样品导入：直接进样固体靶HPLC导入GC导入,离子原：EI、CI、FAB（快原子轰击）、FD（等离子体解吸）、FI、MALDI、ESI,质量分离器：电磁铁（M）四极杆（Q）飞行管（TOF）离子阱（TRAP）,检测器：电子倍增器光电倍增管微通道板,任意组装,质谱仪,10,二次离子质谱： 由一定能量的一次离子（离子枪）打在样品靶上溅射产生出二次离子的质谱。如：FAB、MALDI等。 适合于分析不易挥发、热不稳定的有机大分子。,11,分析物质类型小分子物质：磁质谱、四极质谱、离子阱提供碎片信息：磁质谱（电子轰击源）、三级四极 质谱、飞行时间质谱（PSD）、电 喷雾串联质谱（Q-TOF）等大分子物质：生物质谱：基质辅助激光解吸附飞行 时间质谱（MALDI-TOF-MS）、液 相色谱-电喷雾-串联质谱（CapLC- ESI-Q-TOF-MS）、液相色谱-离子 阱质谱（MDLC-Ion Trap）,12,质谱仪基本指标,分辨率：M/M，5000，给出元素组成灵敏度：S/N，50:1，fmol准确度：error，10-3 Da, 50ppm,13,14,15,生物质谱的两种软电离技术,基质辅助激光解吸电离(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI) 电喷雾电离(Electro-Spray Ionization, ESI),16,生物质谱技术的应用一、分子量测定 （蛋白酶切） + 一级质谱二、蛋白质的氨基酸序列测定 蛋白酶切 + 二级（串联）质谱,17,Karas and Hillenkamp,1998年提出： Anal Chem., 1998,60(20): 2299-2301.基本原理：将分析物分散在基质(Matrix)分子中并形成共结晶, 当用激光(337nm的氮激光)照射晶体时, 基质分子吸收激光能量与样品解吸附，基质样品之间发生电荷转移使样品分子电离。,二、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry， MALDI-TOF-MS,1、MALDI离子源,18,基质的作用： 吸收了激光的大部分能量并气化，同时将样品分子带入气相, 样品分子只吸收少量激光能量，避免了分子化学键的断裂。基质在样品离子形成过程中充当了质子化或去质子化试剂，使样品分子带上正电荷或负电荷。,19,常用基质（一些小分子有机酸及其衍生物，能很好吸收激光能量）,20,显微镜下不同基质在靶体上形成的晶体,21,MALDI源激光是脉冲式，每一脉冲激光产生的一批离子得到一张质谱图，一般的质谱图是多次脉冲激光扫描质谱峰结果的累加。 MALDI源离子为单电荷离子，谱锋与样品组分质量数有一一对应关系，适合于多肽与蛋白质混合物分析，灵敏度高（fmol,10-15 - amol, 10-18 ）。,22,高灵敏度，分析浓度至低 fmol 或高 amol TOF分析器可分析大分子量的物质软电离方式，主要产生单电荷离子，谱图易解析 容忍盐浓度：phosphate buffers 20 mM Tris buffer 50 mM Detergents 0.1 % SDS 0.01 %反射式TOF具有高分辨率,MALDI的优点,23,2、线性飞行时间质量检测器 (liner-TOF),由 E=Uz=1/2mv2 和 t=L/V 推出 t=const m/v （飞行时间与质荷比的平方根成正比） E：离子在加速电场获得的动能; U：加速电场电压z：离子所带电荷; m：离子质量v：离子飞行速度; L：飞行管道长度t：离子飞行时间; const：常数 质量分析范围：500Da-100KDa,24,3、反射飞行时间质量检测器(reflectron RE-TOF),飞行管道内加了反射电场，(ion mirror or reflectron )，改进仪器的分辨率和质量测量准确度能量聚焦作用:具有相同质荷比但能量有细微差异的离子在反射电场作用下飞行时间达到一致，同时离子改变了飞行方向，延长了飞行距离 源后衰变(post-source decay, PSD)分析质量分析范围：800Da-10KDa,Detector,25,26,27,PSD: post-source decay 源后衰变分析 一种串联质谱，获得离子的结构信息。 MALDI源产生的母离子在飞行过程中发生裂解，丢失部分中性碎片，剩余的子离子成为亚稳离子（质量减少，飞行速度不变），飞行时间与离子质量成正比，与反射电场的电压成反比。,28,4、样品制备 基质：CCA：-氰基-4-羟基肉桂酸，用0.1%TCA, 30-50%ACN 配成饱和溶液，稀释1-3倍，每天新鲜配制。 样品：溶于0.1%TCA 。 基质与样品1：1体积混合，取0.5-1ul加到样品靶上挥发干后送如仪器。,29,MALDI-TOF-MS仪器结构图,30,基本原理：利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子的形式进入质量分析器。,三、液相色谱电喷雾串联质谱 (LC-ESI-MS/MS ),1、电喷雾电离源 Fenn J.B. et al, Science, 1989, 246(4926):64-71,31,电喷雾电离源原理,32,2、四极杆质量分析器 串联质谱：由离子源、多级质量分析器、碰撞室组成。 第一级起质量过滤作用，挑选出母离子（precursor or parent ion）进入碰撞室，经碰撞诱导离解（collision induced desorption, CID），产生碎片离子/子离子（product or daughter ion）, 由第二级分析子离子的质荷比。通过母离子和子离子的质量分析，可获得母离子的结构信息。,33,多级质量分析器有： 三级四级杆质量分析器 离子阱质量分析器 四级杆TOF质量分析器,34,四级杆质量分析器,35,电喷雾-四极杆质谱 (ESI- Quadrupole MS),36,Q-TOF分离器特点,+,灵敏度,流通量分辨率,样品需要量：0.5-1ul 20-200fmol/ul,37,ESI-MS谱图（ESI-Q-TOF MS谱图）,电喷雾电离产生多电荷峰，质谱图显示离子带不同电荷数的一系列质荷比峰M+nHn+，根据这些峰值换算出离子电荷和分子质量。检测范围大于质量扫描范围,M+12H12+=714.7714.712128564.4,M+13H13+=659.8659.813138564.4,38,串联质谱 (MS/MS),由离子源、多级质量分析器、碰撞室组成。 第一级质量分析器起质量过滤器的作用，从总离子谱中挑选出需进一步进行结构分析的母离子(precursor or parent ion)进入碰撞室，母离子在碰撞室内经高流速惰性气体碰撞诱导离解(collision induced desorption，CID)产生碎片离子/子离子(product or daughter ion)，第二级质量分析器分析子离子的质荷比。 研究母离子的裂解规律，获得母离子的结构信息。,39,四极杆-飞行时间质量分析器(Quadrupole-Time of Flight analyzer, Q-TOF),四极杆分析器用于离子选择，其后有一个六极杆射频场用于离子的碰撞诱导解离产生子离子，母离子和子离子的检测均由最后的飞行时间检测器完成,40,与LC连接，分析混合物 极高的灵敏度 软电离方式基本不产生碎片离子 孔电压调节可以控制碎片离子的产生 使样品带多电荷，可以分析大分子量的物质,ESI的特点,42,生物质谱与其他质谱的比较,43,价钱便宜MS/MSn多级碎片谱图与一般质谱不同，需要特殊分析,离子阱质谱,44,The Ion Trap Mass Spectrometer,45,The Ion Trap Principle,由三个双曲面电极（一个环型，2个斗笠型）围成一个离子捕集室，可进行串联分析。,46,四、肽质量指纹谱 Peptide Mass Fingerprinting，PMF,指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于每种蛋白质的氨基酸序列(一级结构)都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数亦具特征性，所以称为指纹谱，可用于蛋白质的鉴定。1993开始应用。,47,48,蛋白酶,切 点,H条件,Trypsin,Lys (K)、Arg(R),羧基端,pH 7.5-9.0,Glu-C,Asp(D )、Glu (E),羧基端,pH 4.0,Glu (E),羧基端,pH 7.8,Asp-N,Asp(D ),氨基端,pH 7.0-8.0,Arg-C,Arg(R),羧基端,pH7.2-8.0,Lys-C,Lys (K),羧基端,pH 8.5-8.8,各种蛋白酶的切点及pH条件,49,MALDI-TOF-MS谱图,质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数有一一对应关系离子化效率高，是现今灵敏度最高的质谱仪(fmolamol)质量分析范围：800Da-100KDa,50,Fe3+螯合IMAC亲和柱提取磷酸肽,AMLDI-TOF-MS结合金属离子亲和柱分析磷酸肽,51,52,五、串联质谱数据鉴定蛋白质技术 1、原理 20种氨基酸：203，204，205 5-6个氨基酸序列片段已有很高的特异性，可鉴定蛋白质。 碰撞解离后，肽链在酰氨键处断裂形成子离子： a, b, c 型：保留N端，电荷留在C端 x, y, z 型：保留C端，电荷留在N 端,53,串联质谱鉴定蛋白质,多肽串联质谱碎裂方式示意图,54,55,多肽串联质谱图,56,Data-dependent LC-ESI-Q-TOF MSMS,57,25,gi|4502101annexin I; annexin I (lipocortin I); gi|999934Annexin V (Lipocortin V, Endonexin Ii)gi|24119203tropomyosin 3gi|136085Tropomyosin alpha 3 chain gi|13274400Tropomyosin 4-anaplastic lymphoma kinase fusion gi|133254Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1gi|14251209chloride intracellular channel 1; p64CLCPgi|5031857lactate dehydrogenase Agi|4502105annexin IVgi|20455281Syntenin 1 gi|5031599actin related protein 2/3 complex subunit 2gi|4140011Chain B, Mmp-3TIMP-1 Complexgi|16306978annexin A2gi|7245523Human Serum Transferrin,LC-ESI-Q-TOF MSMS鉴定蛋白质混合物,58,2、实例分析 核糖核酸酶B： 糖苷内切酶除糖，Glu-C酶切，在PMF中有一段m/z 4792.23 的肽段，与任何理论肽段质量数均不符，串联质谱分析测得部分序列为：TSAASSSNYCNQM, 理论值与实测值相差203，恰好是一个N-乙酰氨基己糖的质量数，表明该片段连接有一个N-乙酰氨基己糖。,59,核糖核酸酶B的Glu-C酶切肽段m/z 4792.23的串联质谱图,肽段理论序列：RQHMDSSTSAASSSNYCNQMMKSRNLTKDRCKPVNTFVHE肽段理论质量：m/z：4589.1 肽段实测质量：m/z: 4792.23 差值：203.13 (N-乙酰氨基己糖),60,3、肽序列标签鉴定技术 Peptide Sequence Tag, PST 读出的部分氨基酸序列结合前后离子质量和肽段母离子质量，在数据库中查找的方法。4、PSD 检索鉴定5、18O标记从头测序技术 de novo sequencing 标记y型离子。,61,六、蛋白质检索鉴定工具 和相关数据库,62,检索蛋白质序列数据库鉴定蛋白质,通过蛋白质属性参数与蛋白质序列数据库之间相关分析的方法鉴定蛋白质鉴定的基础在于能够得到一些限制参数，利用这些参数可以从数据库中所有的序列中特异地识别与这些参数相关的序列这些参数包括：蛋白质的氨基酸组成、氨基酸序列、蛋白质和肽段的质量以及肽碎片的质量,63,肽质量指纹谱数据（Peptide Mass Fingerprinting，PMF）串联质谱数据源后衰变离子数据（Post Source Decay ，PSD-MALDI）电喷雾串联质谱数据（ESI-MS/MS，碎片离子质量列表，肽段部分序列）从质谱途径鉴定蛋白质需要从实验数据到氨基酸序列相关分析的辅助,用于鉴定蛋白质的生物质谱数据,64,鉴定数据库中已有序列的蛋白质的软件算法(algorithms)基于以下一些理念-以PMF为例,肽段是由切点专一的试剂水解蛋白质产生的，通常用已知切点专一的蛋白酶。这些肽段的质量由MALDI-MS或ESI-MS精确测定。计算蛋白质序列数据库中的每一序列被实验中所用水解试剂水解后产生的理论肽段的质量。实验测得的肽质量值与数据库中的肽质量计算值进行相关性比较，将相关性最好的结果排序计算得分或排序值。,65,肽段串联质谱碎片离子质量数据(peak list)检索,计算数据库中每一个序列在给定的酶切条件下产生的肽段质量数。找出每一个与实验测得质量数一致的肽段，产生其理论碎片离子列表。实验测得的碎片离子质量数与理论碎片离子质量数计算值进行相关性比较。将匹配最好的结果排序，或仅列出有显著相关的结果(匹配的离子数目)。,66,蛋白质序列数据库,OWL is a non-redundant composite of four publicly-available primary sources: SWISS-PROT, PIR (1-3), GenBank (translation) and NRL-3D. NCBInr is a composite, non-redundant protein database compiled by NCBI for use with their search tools BLAST and Entrez. The entries have been compiled from GenBank CDS translations, PIR, SWISS-PROT, PRF, and PDB. dbEST is the division of GenBank that contains single-pass cDNA sequences, or Expressed Sequence Tags, from a number of organisms. This is a nucleic acid database which is translated by Mascot in all six reading frames.,67,SWISS-PROT and TrEMBL,SWISS-PROT a high level of annotations (such as the description of the function of a protein, its domains structure, post-translational modifications, variants, etc), a minimal level of redundancy and high level of integration with other databasesTrEMBL supplement of SWISS-PROT , contains all the translations of EMBL nucleotide sequence entries not yet integrated in SWISS-PROT.,68,69,PeptIdent Searching Form,70,PMF Searching,71,PeptIdent Searching Result,72,73,肽序列标签检索鉴定,74,75,Sequence Tag : (1188.65) EVT (1517.82),76,77,MASCOT PMF,78,MASCOT MSMS,79,Mascot网站查寻结果,80,81,82,Mascot网站查寻结果,83,源后衰变(PSD)检索,84,Mascot网站查寻结果,85,高通量MLDI质谱仪自动化操作面板,86,MLDI自动处理结果示意,87,规模化蛋白质组研究技术平台的构建,88,蛋白质组研究“生物经济时代”的必然产物, 坚实的生物学研究基础 高通量的现代仪器分析技术平台 大规模的计算机处理系统 海量数据的宏观整合能力,先进的技术平台支撑大科学计划不可缺少的资本,89,国际蛋白质组研究技术平台发展,引进规模化、高通量蛋白质组研究技术平台,血浆蛋白质组： 100台HPLC+50台Ion Trap新近购买：10台Bioflex, 5台4700TOF/TOF,技术和约,与新技术制造商签定技术平台和约,最大限度地发掘人类蛋白质资源,90,鉴定1000点 累计5000高丰度蛋白点，产出量20%,现有技术平台一年工作量, 鉴定点的增多 蛋白丰度下降 产率下降 周期延长 阻滞科研项目进展,（2003年9月“第二届国际HUPO大会”3000点）,91, 平行的2D-Gel为分离基础的技术平台 MD-HPLC为分离基础的技术平台,必须构建并行的蛋白质组研究技术平台,92,机械化技术平台的优势： 提高流程速率，操作过程标准化 最大程度地去除操作者带来的个体误差 消除人生物钟耗时两条2D-gel生产线的平行配制的必要性： 相同样品的平行处理便于进行实验数据的比对及互补 两条生产线的同时运转保证实验的连续性，某一平台的斩时性故障不会导致样品的损失,93,通量技术平台引进计划, 完善BioRad-Micromass 2D-Gel技术平台 平行配套Amersham-Finnigan 2D-Gel系统 建立MD-HPLC-MALDI-TOF-TOF-MS体系,目的：大规模构建肝脏蛋白质组表达谱及修饰谱,94,2D-Gel分离系统 扫描系统切胶系统,一、BioRad-Micromass 流水线,大规模染/脱色盘，摇床 自动酶切/点靶仪,自动化PMF鉴定系统,自动化测序系统,基于BioRad公司和Micromass公司的技术和约,95,96,MDLC-TOF-TOF-MS系列技术平台, 与2D-Gel分离模式进行比对 补充2D-Gel分离模式下响应度不高的蛋白,97,大量（mg）蛋白质MD-HPLC分离,微量（pmol）肽混合物MD-HPLC分离,AB 4700 TOF-TOF-MS系统,MD-HPLC流水线原理,浓缩、酶切,机械手自动点靶,整体分子量,PMF检索,序列信息,MS,MSMS,98,三、MDLC-MS分离系统技术平台,ProteomeLabTM PF-2D,Nano-2D-CapLC,4700 MALDI-TOF-TOF-MS,99,三条流水线的比对与补充,蛋白质分离模式互补,多肽离子化模式互补,100,技术体系今后的拓展引进新技术： 分离技术、离子化技术、检测技术 如：Agilent公司：MD-LC-MS Ion Spce公司：FT-MS Bluker公司：PSD-MS Ciphergen公司：SELDI-MS AB公司：ICAT等新方法优化： 样品予分离技术、增加多维色谱分离的峰容量、经典分离检测仪器的批量引进等,101,思考题： 蛋白质质谱鉴定的基本原理 及主要类型 PMF鉴定蛋白的原理与方法 串联质谱测定肽段序列的原理与方法 什么是PST、PSD?,
