第一章 酶工程ppt课件.ppt

酶 工 程 ENZYME ENGINEERING 主 编：陈 守 文,酶工程Enzyme Engineering,教材和教学参考书教材：酶工程（第二版）陈守文编著科学出版社2015,课 程 简 介,教材和教学参考书教学参考书酶工程（第三版），郭勇，科学出版社，2009现代酶学（第二版），袁勤生，华东理工大学出版社，2001酶学原理与酶工程，周晓云，中国轻工业出版社，2007酶工程（第二版），罗贵民，化学工业出版社，2008,课 程 简 介,课程主要内容酶工程（第一章）酶的生产酶的发酵（第二章）酶的分离工程（第三章）酶的改性固定化酶与固定化细胞（第四章）化学酶工程（第五章）生物酶工程（第六章）非水相酶催化（第七章）酶的应用酶反应器和酶传感器（第八章）酶及酶制剂的应用（第九章）,课 程 简 介,教学目的和要求以酶学的内容为基础，酶的工程应用为主，融入各章节内容中通过本课程的学习，要求系统地掌握酶的生产、改性与应用的技术过程理解和掌握酶工程的主要理论、概念，掌握酶工程的研究方法，熟悉工程应用了解相关的新进展考核方式期末笔试（闭卷）70分， 实验：20分，平时成绩：10分,课 程 简 介,酶 工 程Enzyme Engineering,第 一 章 酶 工 程,第一节：酶工程概述第二节：酶的催化特点以及影响因素第三节：酶的活力测定第四节：酶反应动力学,第一章 酶工程,第一章 酶 工 程,酶及酶工程的研究意义,酶-是具有特殊作用的蛋白质， 能够在生命体内（包括动物、植物和微生物）催化化学反应，维持生命特征。,第一章 酶 工 程,生物技术,基因工程,发酵工程,细胞工程,酶工程,：酶的生产和应用的技术过程,在食品、轻工、医药、化工、能源、环保、科研等领域得到广泛的应用。,催化效率高,专一性强,反应条件温和,第一章 酶 工 程,：基因拼接技术和DNA重组技术,：改变生物的结构和功能,：把微生物应用于工业生产过程,酶工程利用酶或细胞的催化作用，在特定的生物反应器，将原料转化成所需的产品并应用于社会生活的一门科学技术。,第一章 酶 工 程,酶及酶工程的研究意义,酶的研究简史,最早4000年前的夏禹时代酿酒技术,公元前10世纪豆酱的制作,2700年前的周代利用麦芽制麦芽糖,2500年前利用酒曲治疗消化疾病,春秋战国时期漆酶制作油漆,中国古代,第一章 酶 工 程,最早6000年前古巴比伦人利用麦芽酿酒,古埃及时代酵母发酵面包,磨粉、去糠、打碎麦芽萌发、浸润成酒发酵、装瓶,酶的研究简史,第一章 酶 工 程,古巴比伦人,巴斯德,微生物学的奠基人,李比希,有机化学创始人,发酵与活细胞有关，发酵是整个细胞而不是细胞中的某些物质在起作用,发酵是细胞中的某些物质起作用，这些物质只有在酵母细胞死亡裂解释放之后才能发挥作用,第一章 酶 工 程,巴斯德和李比希的论战,1833 帕耶恩和珀索兹从大麦芽中分离出淀粉酶,Monod,用酒精处理麦芽水抽提液，得到白色无定形粉 末，命名为diastase,“变构模型”，定量解释某些酶活性可以通过与效应物结合进行调节，揭示了酶的调控作用,1961 莫诺提出“变构模型”,Payen,第一章 酶 工 程,酶的研究简史,近代 酶作用学说的提出1894年，Emil Fisher 锁钥学说酶分子和底物在结构上需有严格的互补关系底物须契合到酶活性中心，如钥匙插入锁中,Emil Fisher,第一章 酶 工 程,酶的研究简史,1913 米彻利斯和曼吞建立米氏方程。,从刀豆种子里分离出一种纯结晶体,然后把结晶体放进人尿中,这时人尿素便很快就分解成了二氧化碳和氨.萨姆纳发现,它的作用和脲酶一样.经进一步分析,证明这种结晶体就是脲酶.最后,萨姆纳证明脲酶确实是一种蛋白质,第一章 酶 工 程,酶的研究简史,1926 萨姆纳得到尿酶结晶，证实酶的蛋白质本质,近代 酶的本质和结构研究1926年，J. Sumner从刀豆中提取脲酶（urease），首次获得酶的结晶体1937年又获得过氧化氢酶结晶证实了酶是蛋白质获得1946年诺贝尔化学奖,第一章 酶 工 程,酶的研究简史,现代酶学 快速发展时期核酸类酶（Ribozyme）的发现,1982年，Cech发现四膜虫（Tetrahymena）的26S rRNA前体在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，催化得成熟的rRNA,第一章 酶 工 程,酶的研究简史,酶工程发展概况酶工程开始于人类有意识地去生产酶和酶制剂，并进行工业应用1894年，Takamine Joichi（高峰让吉）利用米霉菌固体培养法生产Taka淀粉酶（第一个商品酶制剂），并用作消化剂，开创了酶生产和应用的先例，其方法至今仍被采用1908年，胰酶 皮革的软化1908年，细菌淀粉酶 纺织品褪浆1911年，木瓜蛋白酶 啤酒的澄清,第一章 酶 工 程,酶工程发展概况酶生产方法的突破加速了酶工程的发展从天然生物提取 生物发酵生产 质的飞跃1949年，微生物液体深层发酵生产细菌-淀粉酶1960年，操纵子学说 酶生物合成的调控 揭示酶合成机制1980s，动植物细胞培养技术 扩展了酶的来源,第一章 酶 工 程,酶工程发展概况酶的改性和固定化技术是酶工程发展的里程碑最早的固定化酶 1916年，发现吸附在骨碳上的蔗糖酶仍显示催化活力 物理法1953年，用重氮化聚氨基苯乙烯树脂共价结合水解酶 化学法1969年，固定化酶的工业应用 氨基酰化酶拆分DL-氨基酸生产L-氨基酸1971年，第一届国际酶工程学术会议在美国召开1973年，以E. coli 为载体固定天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸1978年，固定化细胞生产-淀粉酶1980s中期，开发了固定化原生质体技术,第一章 酶 工 程,酶的催化特点及影响因素酶的催化特点1. 极高的催化效率酶的催化速率是没有催化剂催化的化学反应速率的10121020倍，比一般催化剂催化反应的速率高1071013倍。例如：H2O2 的分解反应Fe3+ 催化，效率为 610-4 mol/(mols)过氧化氢酶催化，效率为 6106 mol/(mols)过氧化氢酶将 H2O2 分解反应的活化能从 75.24 kJmol-1 降低到8.36 kJmol-1,第一章 酶 工 程,酶催化作用的特点酶催化作用效率高酶与非酶催化时所需的活化能示意图图中酶催化反应和非酶催化反应的活化能差异显著,第一章 酶 工 程,酶的催化特点及影响因素,酶的催化特点,2. 高度的专一性,绝对专一性：只作用于一种底物；相对专一性：作用于一类化合物或一类化学键；立体异构专一性：旋光异构专一性、几何异构专一性,第一章 酶 工 程,酶催化作用的特点酶催化作用专一性的相关学说“三点结合”的催化理论酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现,第一章 酶 工 程,酶催化作用的特点酶催化作用专一性的相关学说锁钥学说整个酶分子的天然构象是刚性的，酶表面具有特定的形状酶与底物的结合，如同一把“钥匙”对一把“锁”一样,第一章 酶 工 程,酶催化作用的特点酶催化作用专一性的相关学说诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状,第一章 酶 工 程,3. 活性的可调节性,4. 活性的不稳定性,酶促反应受一系列外界理化性质的影响，如：底物浓度及酶与底物的相对浓度；温度； pH值；激活剂； 抑制剂；强酸/强碱； 重金属盐；紫外线,酶活性调控,酶含量调控,酶的催化特点及影响因素,第一章 酶 工 程,酶的催化特点,影响酶催化作用的因素,1. 底物浓度的影响,矩形双曲线：一级反应；混合反应；零级反应。底物抑制：有些酶在高底物浓度下，速度没有维持较高水平，反而下降的现象,第一章 酶 工 程,酶的催化特点及影响因素,3. 酶浓度的影响,= E ,底物浓度够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。,2. 产物浓度的影响,反馈调节作用：许多代谢途径的中间产物或终产物 是酶的变构剂，使酶变构从而影响其反应速度。,影响酶催化作用的因素,第一章 酶 工 程,酶的催化特点及影响因素,4. 温度的影响,在一定温度范围内，反应速度随温度升高而加快。超过一定范围，温度的升高导致酶三维结构的变化，甚至变性，催化活性下降,5. pH的影响,影响酶催化作用的因素,第一章 酶 工 程,酶的催化特点及影响因素,当酶分子处于最适pH值反应介质中时，使酶促反应速度达到最大值。,6. 抑制剂(inhibitor)的影响,凡能降低酶催化反应速率的物质都称之为抑制剂抑制剂与酶的必需基团（包括活性基团及辅基）结合，改变 其结构与性质，引起酶反应速率下降抑制剂对酶有选择性，不包括酶蛋白的水解及变性失活作用,影响酶催化作用的因素,第一章 酶 工 程,酶的催化特点及影响因素,7. 激活剂(activator)的影响,（1）无机离子激活剂：Cl-,Br-,I-,Zn2+,Mg2+,Ca2+,Na+,（2）小分子有机化合物：抗坏血酸，半胱氨酸，谷胱甘肽,（3）生物大分子激活剂：激酶,影响酶催化作用的因素,第一章 酶 工 程,酶的催化特点及影响因素,酶的活力测定,酶活力,又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力可 用酶催化的某一化学反应的速率来表示。,化学反应的速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增 加量来表示。,酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的 速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活 力愈低,第一章 酶 工 程,酶活力单位,酶活力单位是表示酶量多少的单位。,酶活力单位（U）特定条件下（最适温度、pH），每1min 催化1mol 底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,国际酶活力单位催量（kat）,1kat = 1mol/s = 60mol/min = 6107U,在最适条件下，每秒钟催化1mol的底物转化为产物的酶量。（1972年国际酶学委员会）,酶活力单位,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,酶的比活力,酶的比活力可用来表示酶制剂的纯度或活力的高低，是酶纯度的一个指标。在特定条件下，单位质量的酶（蛋白或RNA )所具有的酶活力单位数称为酶的比活力（specific activity）。,酶的比活力 = 酶活力（U）/mg（蛋白或RNA ),酶的活力测定,第一章 酶 工 程,酶的转换数和催化周期,转换数（Kcat）,酶催化效率的指标，指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数一般用每mol的酶活力单位数 IU 来表示（min-1）,酶分子只有一个催化中心,催化中心活性等于摩尔催化活力例如：单体酶,酶分子有n个催化中心,催化中心活性等于摩尔催化活力除以n例如：寡聚酶,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,催化周期 （T）,T = 1 / Kcat,酶的催化周期为转换数的倒数，单位为毫秒(ms)或微秒(s)。,指酶进行一次催化所需的时间。,酶的转换数和催化周期,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,酶活性的测定要求测得的反应速度必须和酶的浓度有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。酶活力测定是通过“可视化”酶催化其特定底物为产物，可用终止反应法或连续反应法进行测定。,活力的测定方法,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,酶反应进程曲线：纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。 酶浓度曲线：纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线，检验反应测定系统是否合适。,通常酶活力测定时，先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线,酶的活力测定,活力的测定方法,第一章 酶 工 程,酶活力与底物浓度、酶浓度、pH值、温度、激活剂和抑制剂 的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。 底物浓度：一般选用底物的浓度S=100Km。 pH值：选用适宜的缓冲离子和离子强度、适宜的pH值缓冲系 统来控制pH。 温度：酶反应的温度通常选用25、30、37，实验中温 度的变动应控制在0.1以内。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些酶需要相应的辅酶。,酶活力测定条件,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,1.终止反应法：终止法是在恒温系统中进行酶促反应，间隔一段时间之后，终止酶反应，然后测定反应物的消耗量或产物的生成量，从而计算出酶活性 催化反应的底物或产物可用化学法、放射性化学法、酶偶联法等方法进行测定。,酶活力测定是通过“可视化”酶催化其特定底物为产物，可用终止反应法或连续反应法。,酶活力测定方法,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,1.1 化学法：化学法是利用化学反应使底物或产物变成一个可用某种物理方法测定的化合物。如脲酶催化尿素水解，得到产物NH3和CO2，便可用比色、滴定、气体量度法等方法测出酶活性。,碱滴定法,对硝基苯酚法,铜皂法,酶活力测定方法,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,1.2 放射性化学法：用同位素标记底物元素，终止反应后将底物与产物分离，然后测定底物或产物的放射性。常用于标记的同位素有35P和14C等。1.3 酶偶联法：有些酶促反应的产物不易直接测定，需加入指示酶转变成可测定产物。另脱氢酶需要以NAD+（或NADP+）为辅酶，它们在340nm处消光系数很小，而NADH（或NADPH）在340nm处有较大的消光系数。,酶活力测定方法,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,2. 连续反应法：连续法测酶活力，不需要取样终止反应，而是基于反应过程光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度等的变化，用仪器跟踪监测反应，记录结果，算出酶活。2.1 光谱吸收法：,分光光度法,荧光法,紫外光,可见光,酶活力测定方法,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,2.2 量气法：计算气体释放或吸收的量。2.3 量热法：用灵敏度较高的量热计测定酶反应速度。2.4 粘度变化法：测定CMC粘度降低的方法分为旋转粘度计法和工研法。旋转粘度计法采用旋转粘度计，测定底物3min和18min的粘度，利用公式推算出酶活力。工研法采用奥氏粘度计，测定底物粘度减至12时所需的时间，以10min使底物粘度降低12的酶活作为1个活力单位。,酶活力测定方法,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,2.5 结构鉴定法：酶促反应中的底物和产物能产生不同的NMR波谱,可以通过测定底物或产物的量来检测反应。2.6 偶联的连续法：偶联的连续法就是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将待测酶的反应产物直接或间接转变成一个可用光谱吸收仪检验的化合物。,酶活力测定方法,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,酶活力测定中应注意的问题,1. 测定的反应速率必须是初速度，即底物消耗量在5%以内，或产物形成量占总产量的15%以下的速度。,2. 底物浓度、辅因子的浓度必须远大于酶浓度；反应条件为酶的最适条件；反应系统中不含酶的激活剂、抑制剂，底物自身不能裂解。,酶的活力测定,第一章 酶 工 程,酶反应动力学是研究酶反应速度规律以及各种因素对酶反应速度影响的科学。,酶反应动力学,研究酶反应动力学对阐明酶作用机制和建立最优化的反应体系（包括酶反应器的设计选型和酶催化工艺）有重要的意义。,第一章 酶 工 程,本节主要介绍均相体系的单底物反应动力学。,影响酶反应速度的因素,浓度,外部因素,内部因素,酶浓度,底物浓度,效应物浓度,温度、pH值、离子强度、溶液的介电常数、压力等,酶的结构、底物和效应物的结构、载体等,此外，对于固定化酶反应、非水体系酶反应等非均相反应体系，还涉及物质扩散等因素。,酶反应动力学,第一章 酶 工 程,米氏方程,对于单底物酶促反应，最简单的酶促反应方程式为：,单底物反应是由一种底物参与的不可逆反应，水解酶、异构酶及多数裂解酶的催化反应均属此类型。单底物反应方程式可用米氏方程描述。,在酶促反应方程式中，酶E和底物S形成不稳定的中间产物ES复合物，中间产物分解，形成产物P，释放出游离酶E。它们的正反应与逆反应的速度常数分别为 k1、k2 和 k-1。,酶反应动力学,第一章 酶 工 程,反应速度和底物浓度之间的关系，服从双曲线方程：,米氏方程最初由Michaelis和Menten（1913年）应用“快速平衡法”解析出来（平衡态假说）；以后Briggs和Haldane（1925年）发展了“稳态法”解析扩展（稳态假说）；2003年，丁勇等人提出极值原理假说，用于完善不足之处，扩大了酶动力学的应用范围。,酶反应动力学,第一章 酶 工 程,米氏方程,1913年， Michaelis和Menten提出平衡态假说：,是一个快速平衡反应；且k2k-1；,在反应达到平衡时， k1ES= k-1ES,用Et表示总酶浓度，由于Et= E+ ES,k1(Et- ES)S= k-1ES,记KS= k-1/ k1=(Et- ES)S/ ES为解离常数， = k2ES为反应速度，Vm= k2Et为最大反应速度,（方程一）,酶反应动力学,第一章 酶 工 程,米氏方程,Michaelis-Menten方程的推导 快速平衡假设,(1-1),(1-2),(1-3),酶反应动力学,第一章 酶 工 程,设ES形成E+S的解离常数为Ks，则有,平衡时，S不变（假设(2)），,由式(1-1) 和式(1-2) 得,由假设(1)，由条件(2)，由此可得将式(1-4)、式(1-6)代入式(1-3)可得,(1-4),(1-5),(1-6),(1-7),Michaelis-Menten方程的推导 快速平衡假设,酶反应动力学,第一章 酶 工 程,稳态假说修正了平衡态假说，然而仍有其不足之处：（1）有些情况下酶反应不一定能达到稳态；（2）在稳态假说下,公式二在理论上有自相矛盾之处： 如果ES的生成和分解的速度相等,即其浓度达到了稳态,则ES为一个定值,由方程二可知 ，由于k2、Vm和Km均为常数，故S也应该为定值。但这与实际情况不符，事实是底物浓度S在反应过程中不断减少。,酶反应动力学,第一章 酶 工 程,米氏方程的意义,（1）通过酶反应动力学常数可以反映出反应性质、反应条件、反应速度之间的关系,（2） 反映出反应速度与底物浓度之间的关系,（3）反映出反应速度与酶浓度之间的关系,酶反应动力学,第一章 酶 工 程,米氏方程可以转换为各种其它形式，并用相应的作图法反映，可以求得相关动力学常数，如 Km和Vm 。常用的方法有以下四种：,动力学常数 Km 和 Vm 的求取,酶反应动力学,第一章 酶 工 程,1. Linewear-Burk 作图法,以1/对1/S作图可得直线。纵轴截距为1/ Vm，斜率为Km/ Vm ，横轴截距为-1/ Km ，换算即可求得Vm和Km。,酶反应动力学,第一章 酶 工 程,2. Hames-Woolf 作图法,以S/对S作图得直线，纵轴截距为Km/Vm，横轴截距为-Km，斜率为1/Vm，换算即可求得Vm和Km 。,这种方法的优点是作图点在坐标图中分布较为平均，另外它也 是求Vm的好方法。,酶反应动力学,第一章 酶 工 程,4. Eisenthal-Cornish-Bowden直接线性作图法,把S标在横轴的负半轴上，测得的v数值标在纵轴上，相应的S和v联成直线，这一簇直线交于一点，其坐标为Km和Vmax。,优点：不需要计算，可直接读出Km和Vmax值；易于识别不正确的观测结果。,酶反应动力学,第一章 酶 工 程,3. Eadie Hofstee 作图法,以对/S作图得直线，纵轴截距为Vm，横轴截距为Vm/Km， 斜率为-Km，换算即可求得Km和Vm。,这种方法适用于值实验误差较大情况。,酶反应动力学,第一章 酶 工 程,第一章 酶 工 程,思考题：名词解释：酶工程；转换数；比活力；酶活力； 酶活国际单位；酶反应动力学；简述酶的研究简史。简述酶工程的发展概况。简要回答酶的催化特点。简要回答影响酶催化作用的因素。简要回答米氏方程的意义。,