《发酵工程》总体介绍ppt课件.ppt

一、发酵工程总体介绍二、本课程拟讲述内容三、本课程第一讲,一、发酵工程总体介绍发酵原理 第一章 绪论 第二章 发酵过程的生物学基础：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌等 第三章 发酵过程的生物化学基础：糖代谢，脂肪代谢，蛋白质代 谢、氨基酸代谢等。 发酵工程技术 第四章 培养基及其设计、制备、优化 第五章 培养基的灭菌及设备 第六章 空气除菌的工艺及设备 第七章 生产菌种的扩大培养及保藏,第八章 发酵过程的工艺控制及有关参数的检测 第九章 发酵设备 第十章 发酵动力学 第十一章 工业发酵的染菌及防治 第十二章 发酵产品的提取、精制工艺及设备 生产实例 第十三章 传统发酵 第十四章 基因工程菌发酵 第十五章 固态发酵 第十六章 固定化细胞发酵,上 游 原料 原料处理 培养基的配制、设计与灭菌菌种的选育 保藏菌种 种子制备 发酵培养 空气 空气除菌 无菌空气 下 游发酵液 预处理 初步纯化 精制加工 成品 工艺、设备、传统、现代,菌种筛选,摇瓶种子,种子罐种子,发酵罐生产,有关参考书,发酵工程原理（肖冬光） 中国轻工业出版社2004.7发酵工程原理与技术（李艳）高教出版社2007.1曹军卫主编 微生物工程科学出版社2002.8生物工艺学（俞俊棠 唐孝宣） 华东理工大学出版社发酵工艺原理（熊宗贵）中国药科大学出版社发酵工程与设备 轻工出版社生物工程设备（梁世中）轻工出版社微生物工程（焦瑞身） 化学工业出版社Principles of Fermentation Technology (Stephen J. Hall, Peter F. Stanbury &Allan Whitaker),二、本课程拟讲授的内容第一章 绪论 ：基本概念，有关背景。第二章 工业微生物：工业微生物的特点和要求，分离、选育、保藏方法。第三章 微生物发酵培养基：发酵培养基的组成，常用的原料，发酵培养基优化与设计的思路。第四章 培养基的灭菌：大生产发酵培养基灭菌的方法、原理，灭菌的影响因素。,第五章 空气除菌：空气除菌的原理、方法、设备，空气除菌介质。 第六章 种子的制备：实验室（菌种室）、生产种子的制备，种子的影响因素、质量控制。 第七章 发酵设备介绍：好氧、厌氧等发酵罐介绍 第八章 发酵过程的工艺控制：控制的目的、方法，温度等参数对发酵的影响及调控。,第九章 发酵生产染菌的防治：染菌的危害，防治方法。第十章 微生物培养过程的参数检测：发酵参数的类型，各类参数的检测方法第十一章 发酵工程下游技术 ：基本情况介绍第十二章 发酵生产实例：多种类型发酵产品的生产机制，工艺流程。,第一讲（2011.9.7）第一章 绪论第一节 发酵工程的定义、特点第二节 发酵工程的发展历史第三节 发酵工业的应用第四节 发酵工程的发展趋势,第一章 绪论第一节 发酵工程的定义、特点1、定义：1.1 何为发酵？,1.2 发酵工程: 利用微生物的性状和机能，通过现代化工程技术，生产人们所需要产品或为人类服务的过程。如抗生素、酒类、有机酸、基因工程药物等的生产。发酵过程是以微生物反应为核心的，因此，发酵工程又被称为微生物工程。,1.3 生物工程：生命科学应用于产业方面，称为生物工程学。也就是利用生物体（生物作用剂：微生物、动物细胞、植物细胞等）的机能，通过现代化工程技术，生产人们所需要产品的过程。生物工程包括：发酵工程、酶工程 、基因工程 、细胞工程 。 发酵工程与生物工程的关系 发酵工程是生物工程的重要组成部分，在生物工程中处于中心地位。无论是从微生物得到酶或用基因工程菌获得产品都必须依赖发酵工程技术。发酵工程的发展直接影响生物工程的进一步发展。,2、发酵工业的一般特点：2.1 生产所用原料通常以淀粉、糖蜜等碳水化合物（可再生资源）为主，辅料包括一定的无机或有机氮源和少量无机盐。2.2 微生物生化反应过程能通过微生物代谢活动完成，因而产品在发酵设备中一次合成,从而获得某些具有一定经济价值的物质。2.3 微生物能利用简单的物质合成复杂的高分子化合物。2.4 微生物能进行氧化、还原、官能团导入等转化反应。从而获得更大经济价值的物质。,发酵工程与化学工程、生化工程的比较 工业发酵的过程是依靠微生物细胞生命活动获得目的产物的过程，从根本上区别于化学合成工业和生化工业。在工业化学过程中没有生物活性物质参与催化。工业生化过程属于由酶催化的体外酶反应过程，酶具有生物活性。当酶失活、辅酶耗尽，过程就停止了。,第二节 发酵工程的发展历史1、自然发酵时期（传统发酵技术，从史前到19世纪） 人类利用微生物的代谢产物已经有几千年的历史了。 5,000-6,000 BC，古埃及人熟悉酒、醋、奶酪的生产方法。2000 BC，古希腊人、古罗马人已会酿造葡萄酒。 4,000-5000 BC ，中国制曲酿酒。 2,000 BC酿制出葡萄酒，1,000 BC中国开始制醋。 人们对发酵的认识及发酵的发展只有200多年的历史！ 从史前到19世纪，人们对发酵的本质不了解，“自然发生说”盛及一时，此阶段一般都是手工作坊，谈不上发酵工业。产品简单，质量不稳定。国外：啤酒、葡萄酒等 国内：酱油，米酒，醋等。,2、纯种培养技术的建立（1872年） 虽然17世纪就发现了微生物的存在，但是没有把微生物与发酵联系起来。 Leeuwenhoek在1683年寄给英国皇家协会信的部分内容。（A和B代表杆菌，C和D表示菌体运动的轨迹， E代表球菌F代表长杆菌，G代表螺旋菌，H代表一簇球菌）,直到1859年Pasteur以著名的Pasteur实验，证明发酵是由于微生物的作用，揭开了发酵的秘密，彻底否定自然发生说。 巴斯德的雁颈瓶实验,在此基础上，以Koch为杰出代表科学家们创立了加热灭菌和纯培养技术，在微生物的发酵史上产生突破性的进展。1881年 Robert Koch提出科赫定律，并完成了细菌的纯培养法（获1905年诺贝尔奖）1878年 HanSen建立酵母的纯培养法1872年 Brefeld创立了霉菌的纯培养法1897年 Buchner(德国人) 发现了酶（Enzyme酵母中）,(a)伟大的微生物学家科赫 (Robert Koch)；(b)科赫的 研究工具。钟罩(A)用来培养 微生物，照相设备(B)、显微 镜(C)、染料和其它化学试剂(D)。 划线法获得单菌落,此阶段人类开始开始对发酵有所认识，发酵技术从天然发酵转变为纯培养发酵，控制微生物发酵的过程。提高发酵的质量和水平，提高产品的稳定性和纯度。 主要产品：一些厌氧发酵和表面固体发酵产生的初级代谢产物。酒精、丙酮丁醇、有机酸、酶制剂等,3、通风搅拌发酵技术的建立（1943年）1928年 Fleming(英国人)发现了青霉素（Penicillin）1940年 Florey, Chain两博士分离得到青霉素二十世纪四十年代初，第二次世界大战爆发，急需药品青霉素的发现，迅速形成工业大规模生产。1941年美国和英国科学家合作对青霉素进行生产研究表面培养：1升扁瓶或锥形瓶，内装200mL麦麸培养基， 40u/ml，收率：35%，1kg20%纯度的青霉素需8000个培养瓶。,1943年 由科学家和化学工程工作者参与开创深层发酵（Submerged fermentation ）（5m3 发酵罐， 200u/ml ）。同时，反映生物与化工两大学科相交叉的新学科：生物化学工程诞生了。从而推动抗生素工业及整个发酵工业的发展，随后链霉素、金霉素、新霉索、红霉素等好氧发酵相继投产。 （当今：青霉素 100m3200m3 ， 5-7万u/ml）此阶段：建立以青霉素为先锋的抗生素发酵工业， 建立了一套完整的深层好氧发酵技术，大型搅拌发酵罐培养方法，使好氧发酵走上大规模、工业化的道路。我国1953年在上海（现在为上海三药厂）开始生产抗生素。,4、代谢控制发酵技术（1950年1960年） 抗生素工业的迅速发展促进了其他发酵产品的生产，20世纪50年代氨基酸发酵工业引进了“代谢控制发酵技术”即将微生物通过人工诱变，获得代谢发生改变的突变株，在控制条件下，有选择性地大量生产某种人们需要的产品。这项技术也被用于核苷酸、有机酸和抗生素的生产中。代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。,5、现代生物技术的发展（1970年） 1953年，沃森和克里克通 过对DNA的X射线衍射图片的分析，提出了DNA双螺旋结构模型。不久又提出了DNA半保留复制原则沃森和克里克与DNA双螺旋模型,1974年Boyer和Cohen：实现了基因转移，启开了基因工程技术的大门。 1977年Boyer：基因操作与克隆技术，构建出高表达的基因工程菌，使微生物产生自身不能产生的外源蛋白。很快形成了产品，如：胰岛素、生长激素、细胞因子等众多基因工程药物。 基因工程菌的发酵产物层出不穷，发酵技术有了突飞猛进的发展。一大批自然微生物不能生产的生物制品问世。,第三节 发酵工业的应用： 发酵工程技术已给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力，解决了人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题 。1. 酿酒工业：啤酒、葡萄酒、白酒等2.食品工业：主食品，副食品，调味品，乳制品。面包、腐乳、酱、酱油、醋、酸乳、色素等3.有机溶剂发酵工业：酒精、丙酮、丁醇、甘油等4.抗生素发酵工业：青霉素、链霉素、土霉素等5.有机酸发酵工业：柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸等6.酶制剂发酵工业：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等,7. 氨基酸发酵工业：谷氨酸、赖氨酸、精氨酸等8. 核苷酸类物质发酵工业：肌苷酸、肌苷、鸟苷酸等9.生理活性物质发酵工业：维生素、激素、免疫抑制剂等10.微生物菌体蛋白发酵工业：活性干酵母（ADY）、单细胞蛋白（SCP）、活性乳酸菌等11.微生物农药与微生物肥料：细菌杀虫剂、生物除草剂、钾细菌等12.微生物环境净化工业：利用微生物处理废水、污水等13.生物能工业：沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙烯等，能源物质,14.微生物冶金工业：利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等15.转基因产品:利用基因重组技术将动、植物细胞的基因转入微生物，通过微生物生产动、植物细胞的产品。产品有胰岛素、生长激素、干扰素、疫苗、单克隆抗体等。,第四节 发酵工程的发展趋势1、基因工程技术：改造传统的微生物工业，对生产菌进行基因重组、转殖，使其高产。生产转基因产品。2、微生物资源的开发：制药微生物的开发，环境生物工程微生物的开发，新能源微生物的开拓。3、发酵过程优化与控制：微生物生长、反应的计量、反应动力学、生物反应器工程。4、生物分离新技术：新设备、新材料、新技术。,第二章：生产菌种的来源、选育、保藏一、工业生产菌种的要求及其特性二、自然界中生产菌种的来源三、菌种的选育、分子育种四、菌种的保藏与复壮,第一节 工业上生产菌种的要求及种类1、工业化菌种的要求：发酵工程的目的产物有多种类型，所使用的微生物菌种是多种多样的，但用于大规模发酵生产的菌种，不论是野生菌种，还是突变株，或是基因工程菌株，应该具备如下基本特性：1.1能够利用廉价的原料，简单的培养基大量高效地合成产物。1.2遗传性能要相对稳定，不易变异退化，保证发酵生产和产品质量的稳定性。,1.3 不易感染它种微生物或噬菌体,1.5 在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物及其他产物。 1.6 生长繁殖能力强，有较高的生长速率，发酵生产的周期较短。,1.4 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）,2、工业上常用微生物的种类及功能2.1细菌(Bacteria)2.1.1醋酸菌(Acetobacter)：醋单胞菌:发酵产物为乙醇 醋酸，葡萄糖葡萄糖酸醋酸杆菌:发酵产物醋酸水+二氧化碳2.1.2乳酸菌(Lactobacteriaceae):乳球菌:发酵产物为酸奶、泡菜、调味品等乳杆菌:发酵产物为酸奶、乳酸等2.1.3大肠杆菌(Escherichia coli.)基因工程重要的宿主菌，食品及公共卫生的指标菌，发酵产物为谷氨酸脱羧酶、天冬酰氨酶,2.1.4芽孢杆菌(Bacillus)枯草芽孢杆菌：发酵产物为淀粉酶、中性蛋白酶。苏云金芽孢杆菌：可生产生物农药BT(Bacillus thuringiensis )梭形芽孢杆菌：可生产丙酮、丁醇多粘芽孢杆菌：可生产多粘霉素地衣芽孢杆菌：可生产杆菌肽2.1.5 棒状杆菌(Corynebacterium) 可发酵生产谷氨酸等氨基酸，如：北京棒状杆菌,2.1.6 假单孢菌(Pseudomonas) 可降解有机废水，能产生维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸、抗生素等。2.1.7甲烷产生菌甲烷杆菌(Methanobacterium)、甲烷八叠球菌(Methallosarcina) 、甲烷球菌(Methanococcus)：这些甲烷菌在有机废料甲烷发酵中起作用。,放线菌（链霉素四环素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢霉素等）,一些产芽孢的细菌（多粘霉素、杆菌肽）,植物或动物来源,2.2 放线菌（Actinomyces),放线菌能产生多种抗生素，抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：,2.3酵母菌(Yeasts)2.3.1酿酒酵母：用于酿造啤酒、酒类，生产酒精 酵母长：宽=2，用于酿造葡萄酒、果酒、啤酒，有时简称葡萄酒酵母。 酵母长：宽=12，用于制造面包和酿造酒精，因不耐高浓度的盐类，只适用于淀粉原料的酒精发酵。 酵母长：宽2，用于酿造酒精，是糖蜜原料酒精发酵的主要菌株，俗称台湾酵母。2.3.2卡尔斯伯通酵母：啤酒酿造中典型的下面酵母，又可作食用、药用和饲料酵母。,2.3.3毕赤氏酵母(Pichia hansenula) 多边芽殖，有多种能形成菌丝体。发酵或不发酵，是饮料酒酿造的污染菌，可利用石油或农副产品及工业废料生产菌体蛋白（SCP）。2.3.4 粟酒裂殖酵母(Schizosacharomyces Pombe Lindner) 从非洲粟酒中分离得到，在糖蜜和水果上也能找到。能利用菊芋（鬼子姜）发酵生成产量很高的酒精。有自絮凝功能，能进行固定化连续发酵。2.3.5假丝酵母(Candida Berkhout) 解脂假丝酵母：不发酵任何糖，分解脂肪和蛋白质(用于石油脱蜡） 产朊假丝酵母：降解废液，利用造纸废液、废料生产SCP，能发酵葡萄糖、蔗糖、棉籽糖,热带假丝酵母：利用石油原料生产SCP ，能发酵多种糖，不分解脂肪2.3.6 红酵母（Rhodotirula Harrison) 多边芽殖，能产生明显的红色或黄色色素，不发酵。2.4霉菌(Mould)2.4.1 曲霉属： 黑曲霉：有多种活性强大的酶系，发酵生产柠檬酸、葡萄糖酸、抗坏血酸、淀粉酶、酸性蛋白酶。 米曲霉：产生淀粉酶、蛋白酶、果胶酶用于 酿造酱油。 黄曲霉：产生淀粉酶、蛋白酶、果胶酶能力，某些菌系能产生黄曲霉毒素。,红曲霉：能产生鲜艳的红曲霉红素和红曲霉黄素，可用作中药、食品染色剂和调味剂2.4.2青霉属 产黄青霉：主要用于发酵生产青霉素，还能生产柠檬酸、抗坏血酸。 桔青霉：生产5-核苷酸（5-肌苷酸， 5 -鸟苷 酸），许多菌系会产生桔霉素毒素。,2.4.3根霉属：米根霉，药酒、酒曲中常见（参与发酵），生产L（+）乳酸，产量70%左右。2.4.4毛霉属鲁氏毛霉：分泌产生蛋白酶，有分解大豆的能力，可生产腐乳。 总状毛霉：分布广，能产生3-羟基丁酮2.5其它微生物2.5.1藻类：螺旋藻，珊列藻，光能自养微生物，主要用作人类保健食品和动物饲料等。,2.5.2 病毒：病毒疫苗2.5.3担子菌：菇类微生物。可以开发多糖、橡胶物质和抗癌物质等。2.5.4基因工程菌：基因工程药物,第二节 生产菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。,1、菌种分离的一般过程,样品的采取, 预处理, 培养, 菌落的选择,初筛 复筛性能的鉴定菌种保藏,如何使样品中含所需微生物的可能性大,如何在后续的操作中使这种可能性实现,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题：,1.1样品的采集1.1.1 土样采集方法采样时要注意的问题：根据微生物的特点，综合分析决定采样地点，一般有机质较多的土壤，微生物的种类也较多。在园田土中以细菌和放线菌为主，在有很多动、植物残骸的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多。采样取地表下510厘米深度为宜。 注意：季节、水分、土壤酸碱度。,标签：地点、时间、气候等,1.1.2 植物体采集方法在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。,1.1.3 水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4下贮存。,1.2 样品的预处理增加目的菌数量，尽可能清除、减少其它菌的数量。如：高温处理： 去除非耐热菌的干扰。 100加热1小时，减少细菌、真菌数量 培养基中添加：适合目的菌生长的成分。 膜过滤、离心：浓缩微生物。等方法。1.3富集培养目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,定向培养的富集方法,从一切能提高目的微生物相对生长速度的方法：如：1、底物 2、pH条件 3、培养时间 4、培养温度等，使目的微生物在培养过程占优势。,1.4 纯化 微生物分离：划线、稀释涂布、毛细管分离、小液滴分离。 选择压力分离法：不同pH条件、高糖、高盐、好氧、厌氧 加入不同抗生素：抗细菌（青霉素，链霉素等）、抗真菌（制霉菌素、杀真菌素等） 1 . 5 性能鉴定：大生产能力，毒副作用，分类鉴定。,第三节 菌株选育、分子改造,目的,提高生产能力,提高产品质量,开发新产品,解决生产实际问题,防止菌种退化,方法,基因突变：,自然选育、诱变育种,基因重组：,杂交、原生质体融合、基因工程,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9,自然突变有两种情况：,一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。,另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。,1、自然选育,自然选育在工业生产上的意义,自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。,回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变,问题：,高产菌株是正突变高，还是负突变高？,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞(孢子)悬液的制备,平板分离,挑选单菌落(注意形态的观察),发酵试验 高产菌株,2、诱变育种,用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种,诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂,诱变剂,物理：紫外，X射线，射线，快中子等,化学：硫酸二乙酯（EDS），亚硝基胍等,2.1诱变剂的作用原理物理： UV嘧啶 嘧啶二聚体a光复活作用 光解酶嘧啶二聚体 嘧啶,化学： 与核酸碱基进行化学反应：烷化剂（EMS，EDS）、亚硝酸、羟胺等 G+EMS 6-乙基-G （与T配对） T+EMS 4-乙基-T（与G配对） 碱基类似物：5-FU、5-BU、8-NG等 错误地掺入DNA。 移码突变：吖啶类染料、原黄素 平面型三环分子，与一嘌呤嘧啶碱基对结构类似，能嵌入两个相邻的DNA碱基对之间，引起移码突变，目前该原理还不是很清楚。,2.2 诱变育种的一般步骤2.2.1 出发菌株的制备：选用优良的出发菌株2.2.2 诱变剂处理：单细胞或单孢子悬浮液,使用最佳诱变剂量. 剂量 = 强度（浓度） 作用时间2.2.3 突变菌株的初筛：定性2.2.4 突变菌株的复筛：定量,2.3营养缺陷型菌株的选育 营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。 与营养缺陷型对应的是野生型,能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)；在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基(SM)；能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。,3、原生质体融合,4 基因工程（分子育种） 在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。是获得新物种的一种崭新的育种技术。,获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物）筛选和鉴定应用,第四节 菌种的保藏与复壮,1、菌种的保藏 1.1 菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。,1.2 目的：不死，不衰，不被污染，便于研究交换使用1.3 原理： 挑选优良纯种，最好是休眠体， 创造最有利于休眠的环境条件，创造使微生物代谢不活泼，生长受抑制（休眠）的环境条件，如：干燥，低温，缺氧，缺乏营养，添加保护剂及酸度中和剂等干燥：硅胶，无水氧化钙，P2O5是良好的干燥剂低温：生长温度低限约为-30，水溶液中酶促反应温度低限-140,一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。,1.4 菌种保藏的方法,斜面低温保藏法：酵母菌等 石蜡油封保藏法：酵母菌等 砂土管保藏法：放线菌，霉菌，细菌冷冻干燥法：细菌，放线菌 液氮超低温冻结法：细菌，真菌,1.4.1 定期移植保藏法：措施：低温（4）优点：简便; 缺点：保存期短，传代多，易退化斜面冰箱保藏法接种适宜斜面培养基 培养 4保藏适用：各大类保藏期：36个月半固体穿刺冰箱保藏法穿刺接种适宜半固体（0.5-0.7%琼脂）培养4保藏适用：细菌，酵母保藏期：612个月,1.4.2液体石蜡法（石蜡油封藏法）,措施：低温，缺氧方法：斜面或半固体接种 培养 加高出无菌液(或斜面)培养基1cm的蜡415保藏适用：不能利用石油的各大类微生物保藏期：12年优点：简便,1.4.3 砂土管保藏法,措施：无营养，缺氧，干燥方法：孢子或芽孢悬液 加入无菌砂土管中 干燥 封口 保藏适用：产孢子（芽孢）微生物保藏期：110年或更长,1.4.4 冻结真空干燥保藏法：,措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂方法：菌种培养 用保护剂悬浮 加入安醅管中低温冻结（-25-40）抽真空（至0.01mmHg） 真空封口 检查真空度 保藏适用：各大类保藏期：515年或更长1.4.5 液氮超低温保藏法：措施：低温、有保护剂-196，10%甘油作保护剂，保藏期长。,几种常用菌种保藏方法的比较,菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）,2、菌种的退化和复壮,菌种退化及其防治 菌种衰退：菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。2.1菌种退化的表现：生产性状劣化，遗传标记丢失，原有的典型性状变得不典型,具体表现： 菌落及细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越小； 代谢产物生产能力下降； 抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱,2.2退化原因,基因自发突变：诱变后菌株本身不纯，多核细胞中单核突变，单核细胞中单链改变等；其他原因：菌种保藏不当 生长条件不满足 回复突变,2.3 退化的防治,从菌种选育方法上考虑 1)进行充分的后培养及分离纯化 2)增加突变位点，减少基因回复突变的几率：从菌种保藏方式上考虑 1)尽量减少传代次数 2)选择适宜的保藏培养基 从菌种培养适宜条件上考虑 1)抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复突变细胞。 2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失,从菌种管理的措施上考虑 1）定期对保藏菌种分离纯化，淘汰已退化细胞 2）定期对发酵液进行分离筛选，选取自发性突变的细胞,菌种复壮：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性。复壮措施：对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化淘汰衰退的个体。 选择合适的培养条件。,谢 谢！,