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    实验四、PCR产物的T载体克隆和转化ppt课件.ppt

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    实验四、PCR产物的T载体克隆和转化ppt课件.ppt

    医用分子生物学实验技术,青海大学医学硕士研究生课程,重组DNA技术操作步骤,基本原理,主要步骤: 制备目的基因和选择相关载体 目的基因和有关载体进行连接 重组的DNA导入受体细胞 DNA重组体的筛选和鉴定 DNA重组体的扩增、表达和其他研究,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,(三)PCR扩增特定基因,(四)人工合成,一、目的基因的获得分,(一)从基因组文库中获得,(二)从cDNA文库中获得,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,从基因组DNA文库获取目的基因,用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库,从cDNA文库获取目的基因,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,几种常用克隆载体的比较,注:+表示可用;-表示不可用,比较内容 质 粒 噬菌体 黏性质粒 M13噬菌体克隆容量 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb基因组DNA文库 - + + -cDNA文库 + + - -亚克隆 + - - +序列分析 + + - +E.coli表达 + + - -,二、载体的选择与准备选,三、DNA分子的体外连接接,(一)黏性末端,(二)人工接头的使用,(三)加入同聚体尾,(四)平端连接,(一)黏性末端,(二)人工接头,(三)加入同聚体尾,待克隆DNA片段,重组质粒,混合、退火,空白质粒,(四)平端连接,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5 3 T(T)nT,T(T)nT 35,3 A(A)nA,A(A)nA,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶+ dATP,末端转移酶+ dTTP,5,35,四、外源DNA导入宿主细胞转,受体菌条件:安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式:转化 (transformation)转染 (transfection)感染 (infection),外源基因导入宿主细胞后,筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。,五、目的基因的筛选和鉴定筛,1. 借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选(2) 利用基因的插入失活/插入表达 特性筛选(3) 利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选,2. 序列特异性筛选 (1) RE酶切法 (2) PCR法 (3) 核酸杂交法(4) DNA测序法,(一) 遗传学方法,1. 插入灭活法,插入失活筛选带有重组载体的克隆,2. 蓝-白筛选(互补),许多载体(如M13系列、pUC系列、pGEM系列)都含有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性,但它们可以互补形成具有活性的-半乳糖苷酶,使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物,出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段,将使lac Z基因灭活,不能生成有活性的-半乳糖苷酶,结果菌落呈现白色。,互补筛选(蓝-白筛选),PCR产物的T载体克隆和转化,实验目的: 学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。实验要求: 掌握利用T载体克隆PCR产物的方法;复习连接实验流程。技术应用: 目的基因片段与T载体DNA连接,达到克隆基因的目的。,材料:目的基因片段(回收的PCR产物)药品:pEMG T-Vector (Promega公司),质粒(plasmid) 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数千碱基对。常 有1 3个抗药 性基因,以利于 筛选。,质粒载体,克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入,储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。,实验原理,普通Taq酶会在3末端加一个A,这样所有PCR产物都会在双链DNA的3端均有一个单链状态的A;T-载体是线状DNA片段,在DNA双链的3端均有一个单链状态的T;二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子,从而达到克隆的目的。,载体结构的三大要素: 多克隆位点 选择标记(耐药性,LacZ) 独立的复制单位,GEM-T 载体的结构,GEM-T Easy 载体的结构,实验步骤,(1)目的片段的制备-胶回收法回收PCR产物:,(2)连接实验: 在0.2ml PCR管加入以下试剂: 目的片段(100ng/ul) 3l pGEM-T Easy(50ng/ul) 1l T4 DNA Ligase 1l 2Rapid Ligation Buffer 5l Total 10 L 备注:混合均匀,瞬时离心。 4连接16小时,-20储存或直接用于转化。,说 明,1.回收DNA片段可以用沉淀法,但是只适用于PCR扩增产物为单一片段,而且需要检测PCR扩增结果后进行;2.此种连接方法是根据普通Taq酶会在3末端加一个A的原理发明的;注意不同的酶的性能不同,保真性强的Taq酶会自动切除末端的A,所以,这种酶的扩增产物需要补加A后再连接。3.T-载体的阳性克隆筛选同样可以使用“蓝白斑”法,方便,快捷。,

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