尼氏染色 全面ppt课件.ppt

用尼氏染色法观察小鼠海马及皮层中神经元的分布情况,神经生物学实验室,一、实验原理,尼氏染色法（Nissl staining）是德国病理学家F.Nissl（1860-1919）于1892年创立的，碱性染料染色后发现了神经元胞体中的尼氏体。神经元是神经系统的结构和功能单位,尼氏体是神经元的特征性结构之一,尼氏体（Nissl body）又称虎斑,广泛存在于神经元胞体和树突内,具有嗜碱性的特点。,以往显示神经元中尼氏体多采用苏木精-伊红染色方法,此法虽然也能观察到胞质中嗜碱性颗粒,但结构不甚清晰,胞核、核仁、尼氏体颗粒模糊,分界不清,轴突、树突难以辨认。在尼氏染色中尼氏体清晰可辨,核、核仁也非常清晰,而且很容易区分轴突和树突,收到了既可辨认器官又可同时观察细胞质特殊结构的效果。,尼氏染色法的优势何在？,尼氏染色中尼氏体受染后呈块状(形如虎斑) 或颗粒状,核周围尼氏体颗粒较大,近边缘处较小而细长。在电镜下观察，尼氏体主要由平行排列的粗面内质网和核糖体组成。,尼氏体的主要功能是合成蛋白质，作为神经活动时所需，如细胞中的某些成分的更新以及产生神经递质有关的蛋白质和酶类。轴突端的蛋白质大都来自胞体的尼氏体。神经元在兴奋传导过程中，不断消耗某些蛋白质物质，尼氏体可合成新的蛋白质以补充这种消耗。在生理情况下, Nissl小体大而数量多，说明神经细胞合成蛋白质的功能较强；相反在神经细胞受到损伤时，Nissl小体的数量会减少甚至消失。,尼氏体的功能是什么？,用于尼氏染色的常用染料有：焦油紫（cresyl violet）、硫堇（thionine）和甲苯胺蓝 (toluidine blue)。,二、实验步骤,1、昆明小鼠以0.48%的戊巴比妥钠0.02ml/g腹腔注射麻醉，待其麻醉后，迅速用手术剪刀及镊子剪开肚皮使其心脏暴露，将针头从右心房插入，并用动脉夹夹住，剪破静脉窦。2、灌流和固定：先用生理盐水灌注（约30min），待小鼠肝脏变白后，再换成4%多聚甲醛灌流，直到小鼠肝脏变硬，尾巴僵硬为止（约2h）。3、待充分固定后，剪下小鼠头部并开颅取脑，再浸入4%多聚甲醛1d。,4、将脑组织用502胶水固定，在振荡切片机上切片，厚度为25m。5、将切好的脑片浸于0.5%的明胶中，用毛刷将脑片贴到预先用明胶处理的载玻片上，然后自然风干。6、切片染色：将脑片置于0.5%甲苯胺蓝（母液：甲苯胺蓝1g，无水乙醇100ml。使用时按1:1比例与新鲜的0.1%NaCl溶液混合成工作液）或焦油紫（焦油紫0.1g；蒸馏水99ml；1%冰醋酸1ml）中室温下染色30min；,7、切片用蒸馏水冲洗3次；8、切片依次浸入75%、80%、95%的酒精中，每次约1min；9、切片入特殊分色液中分色，约15s；10、切片浸入100%酒精I，II，各1min；11、切片浸入二甲苯I，II中透明，各5min；12、中性树胶封片。13、显微镜下观察照相并对尼氏染色阳性神经元进行计数。,三、注意事项,Nissl染色液的染色能力很强，并且染色后很难去除，请注意勿使染色液沾染皮肤和衣物等。,四、思考题,除了尼氏染色法以外，你知道还有哪些方法可以对神经元进行特殊的染色，并详述其原理和步骤。,