第六讲典型生物催化的反应 氧化还原反应ppt课件.ppt

氧化还原反应,氧化还原酶 Redox Enzyme 主要包括三种酶： 1、脱氢酶（Dehydrogenase） 2、加氧酶（Oxygenase） 3、氧化酶（Oxidase）,1 还原反应,脱氢酶广泛用于醛或者酮等羰基和CC键 的还原反应根据底物的取代方式，这两个反应都会由 具有不对称潜力的潜手性底物生产手性产 物其逆过程（反应）如醇的氧化或者脱氢反 应通常会伴随着手性中心的破坏，因而限 制了它的应用,脱氢酶催化的还原反应,辅酶的再生,氧化还原酶的催化特点 氧化还原酶需要氧化还原辅酶，提供（或 接受）还原（或氧化）反应中的化学平衡 物质。辅酶的类型 NAD（H）：80 NADP（H）：10 黄素（FMN，FAD）和吡咯喹啉醌（PQQ）比较少,辅酶的特点 1、分子相对不稳定 2、价格昂贵（化学计量的数量） 反应中辅酶仅仅是其氧化还原状态发生变化，因此可以用另外一个氧化还原反应进行原位（in situ）再生。 需要加入催化计量的辅酶，降低费用,辅酶重复利用性能的表征 TTN（Total turnover number） 总转换数：代表循环过程的效率 即：在一个完整的反应过程中每mol辅酶可 以产生的产物的总mol数。 辅酶分子会在循环过程中受到破坏 一般TTN需要达到103104，对于大规模生产，最好能够达到105。,还原反应技术应用的“瓶颈” 辅酶的价格（大规模反应） 认识问题深入研究解决问题 当使用完整的微生物细胞作用生物催化剂时，辅酶的再生不再是一个关键问题。 微生物含有代谢过程中所需的所有酶和辅酶。通过加入象糖类这些廉价易得的氧化还原平衡物质可以进行辅酶的再生。,还原性尼克酰胺辅酶的再生,1、非酶的化学还原比如用Na2S2O4TTN100，简单，效率较低酶会由于Na2S2O4而引起失活,2、电化学、光化学再生 优点：价格低廉，易于使用 缺点：反应区域控制性差，副反应多 TTN10003、酶法还原NADH和NADPH 高效，复杂，费用高,酶法还原再生,底物偶联法,方法：辅酶的再生是通过加入一种辅助底 物（Donor，供体），在同一种酶的 作用下，向相反的方向进行反应。 为使反应平衡向所期望的方向进行， 供体通常是过量的，TTN103缺点：1、增加了产物纯化难度 2、供体的加入可能引起酶的失活 3、辅助底物浓度高，引起底物抑制 可以考虑使用气膜等进行反应与分离耦合,酶偶联法,方法：两个平行的氧化还原反应，分别由 两种不同的酶催化主要底物和辅酶 再生的转化过程。特点：两个酶对各自的底物有足够的专一 性，使两个酶反应可以各自独立进 行。所有的底物和辅助底物不会竞 争某一个酶的活性中心，反应效率 较高，各自独立进行转化 需要加入另外一种酶,NADH有一些进行再生的好方法，已经获得 广泛应用，各有优缺点。NADPH仅在实验室规模进行再生，对于大 规模生产尚需开始一种廉价高效的方法,FDH法：NADH的再生,酶：Formate Dehydrogenase,优点：1、辅助底物和副产物对酶没有抑制 作用 2、辅助底物和副产物容易和产物进 行分离 3、FDH有商品酶供应，容易进行固 定化，稳定缺点：FDH价格昂贵，比活较低（3U/mg） 固定化FDH可以解决上述问题最广泛使用再生NADH的方法TTN：103105，但是不能用于NADPH的再生,葡萄糖脱氢酶法：NAD(P)H的再生,酶：GDH（Glucose dehydrogenase）,特点：从Bacillus cereus中提取的GDH很稳 定，比活较高缺点：1、GDH价格昂贵 2、产物分离困难 如果不考虑纯化问题，此法在实验室中应用是一个很好的方法，也是再生NADPH的最简单的方法之一,G6PDH也可以用于同样的反应体系从Leuconostoc mesenteroides肠链球菌中 提取的酶廉价，稳定，可以NAD(P)为底 物，而酵母中的G6PDH仅以为NADP底物缺点：G6P价格昂贵解决方法：用己糖激酶从葡萄糖利用酶法 制取，但是又涉及到ATP的再生,可以使用6-硫酸-葡萄糖和从酿酒酵母中提 取的G6PDH再生NADPH。硫酸不会作为酸 催化剂水解NADPH，且底物比磷酸盐容易 制备。作为Glucose/GDH方法的补充，是再生 NADH和NADPH的比较好的方法,乙醇脱氢酶和醇脱氢酶法,乙醇脱氢酶（Ethanol DH）醇脱氢酶（Alcohol DH）酵母中：NADH L. mesenteroides：NADPH,广泛用于NADH和NADPH的再生优点：1、ADH价格适中 2、乙醇、乙醛有挥发性缺点：1、只有醛或者环酮这样有活性羰基 的底物产率较高 对其他底物必须加入过量（乙） 醇或者不断去除（乙）醛 方法：通入氮气，扫除乙醛 把乙醛转化为乙酸,2、TTN较低 3、复杂、不稳定的多酶体系 4、低浓度的乙醇和乙醛会抑制酶的活力 或者引起酶的失活,氢化酶（Hydrogenase enzyme）,直接以分子氢作为供体，再生NADH优点：1、还原性强 2、不损伤酶和辅酶 3、没有副产物缺点：1、对氧化很敏感 2、无商品酶 3、发酵制备工作复杂,氧化型尼克酰胺辅酶的再生,最好也是应用最广泛的再生NAD(P)的方法 是用谷氨酸脱氢酶(Glutamate DH, GluDH) 催化的-酮戊二酸生成L-谷氨酸的反应NADH和NADPH都可以作为辅酶-酮己二酸可作为底物，产物为L-氨基 己二酸,丙酮酸和乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase）,再生NAD优点：1、LDH价格便宜 2、比活较高，比GluDH高缺点：氧化还原势能较低, 无法再生NADP,乙醛和乙醛脱氢酶,再生NADTTN在103104之间缺点：酶失活 优点：1、酵母来源的醛脱氢酶价格便宜 2、试剂具有挥发性,用酶还原醛和酮,许多酮可以用脱氢酶进行立体选择性还原 获得手性仲醇产物可能为S醇或者R醇Prelog法则：根据底物的空间结构需要而决 定的立体化学反应过程可用一个简单 的模型进行判断,Prelog法则,在Curvularia falcata细胞进行微生物法还原 的立体化学基础上建立脱氢酶主要是从潜手性酮的Re面释放氢大多数商品化的脱氢酶以及大多数微生物 在进行酮的立体专一性还原的时候都遵循 Prelog法则（如YADH，HLADH）获得到产物为S醇,Prelog法则示意图,各种脱氢酶的底物范围,酵母醇脱氢酶（YADH） 底物专一性范围较窄，一般仅以醛和甲基 酮为底物，碳链长于一个甲基的酮不能作 为底物其他没有商品酶供应的ADH应用受限制HLADH是一种常见酶，具有广泛的的底物 专一性，较好的立体专一性，因此是生物 转化中应用最广的脱氢酶,HLADH由两个几乎相同，各含有两个锌原 子的亚基组成的二聚体 X衍射对其三维结构研究表明，HLADH的一 级结构虽然和YADH相差很大，但是它们的 三维结构很相似 主要用于对中间单环酮（49个C）和双环 酮的还原。大于10个C的环酮不易作为底 物，无环酮还原时，对映体选择性较低,HLADH拆分双、多环酮,含N杂环酮会使酶失活，和含锌活性中心发 生作用HLADH催化2-烷基噻喃-4-酮的还原反应， 转化率可达100，以非对映体选择性方式 进行，得到顺，反-S-醇的混合物。后者经 色谱分离后再氧化，可以得到光学纯度很 高的酮。,HLADH催化的非对映体还原,潜手性萘烷二酮的选择性还原,YADH和HLADH不能用于开环酮的不对称还 原，而TBADH可以还原开环甲基、乙基酮， 带杂环取代基的-卤代烷基、甲基或三氟 乙基酮，得到相应的仲醇，立体选择性很 高,-不饱和酮和取代基大于乙基的酮不能 作为底物,TBADH对映体选择性还原酮,TBADH遵循Prelog法则，得到的是S-醇对于小分子底物，得到的是R-醇,TBADH最大的缺陷在于需要NADP(H)作为辅酶NAD(H)V可以代替NADP(H)NAD(H)V用NAD(H)和无机钒酸盐(HVO42-) 在溶液中合成由于加入钒酸盐引起的副反应由咪唑缓冲 体系来抑制,羟基甾体脱氢酶（HSDH）,HSDH适用于还原大型单环和双环酮天然底物为甾体类化合物，类似的空间结 构产物可以用Prelog法则判断小分子底物也可以还原，但是选择性就会 比较差,从上述酶中选择合适的脱氢酶可以将各种 化学合成的酮转化为相应的手性仲醇以NADH作为辅酶的LDH可以将-酮酸还原为R或者S型的羟基酸甘油脱氢酶（GDH），有商品酶。可以用于-羟基酮的立体选择性还原嗜热微生物的研究：酶的稳定性好温度对反应选择性的影响:可供选择范围大,完整细胞还原醛和酮,和用纯酶进行还原不同，利用完整细胞不 需要昂贵的辅酶循环，具有以下优点： 1、含有多种可以非天然物质为底物的脱氢 酶 2、含有所有需要的辅酶 3、含有辅酶再生的代谢过程 4、可用廉价碳源作为辅助底物 5、辅酶、酶的稳定性好,缺点： 1、生产效率低，因为非天然底物的浓度较 低（0.10.3左右） 2、产物回收困难，特别对于胞内产物 3、C源产生大量副产物，少量用于辅酶再 生 4、反应专一性变化大 5、微生物菌种特异性强，重复实验结果难,课堂作业:请描述酶法制备S-2-氯丙酸联产S-乳酸过程所用的原料名称和酶,微生物还原的选择性差的原因,只有一种氧化还原酶催化还原反应，但是手性识别能力不高两种或者两种以上氧化还原酶可以还原底物不同的异构体，产生选择的竞争性 反应的选择性取决于各个反应的相对反应速率 米氏方程，Vmax/Ks,改善微生物还原反应选择性的方法,加反应后可除去的保护基团修饰底物通过固定化技术改变代谢参数用不同生长阶段的细胞改变发酵条件筛选更好的微生物选择性抑制竞争酶的酶活,酵母细胞还原醛和酮,面包酵母（Bakers Yeast）或酿酒酵母应用最广泛的进行酮不对称还原的微生物来源广，不需要无菌发酵，设备要求低用于生物转化历史悠久，可供参考文献多还原简单的脂肪醇和芳香醇遵循Prelog法则 获得S-醇除了长链甲基酮，其他长链酮不能作为底物,带有氯、溴、氟、硝基、羟基和甲硅烷基等基团的酮也可以作为底物,脂肪族-酮酯被酵母还原产生-羟酯,反应产生分歧的原因不是单酶底物选择性 根据底物结构不同而发生了变化，主要是 有一系列不同的脱氢酶，对同一种底物产 生竞争，从而具有不同的立体选择性D专一性酶（属于脂肪酸复合酶系）对短链 醇基的底物更具亲和性，如甲酯L专一性酶对长链醇基的底物更具亲和性， 比如辛酯,因此可以通过仔细设计底物来调节控制反应的选择性选择性抑制其中一种竞争性的酶其他方法，比如固定化,选择性抑制L型酶,选择性抑制D型酶,酵母还原-单取代-酮酯,还原后产生顺/反-羟酯顺/反不是1:1，烯醇化引起快速原位消旋非对映体选择性由酶的立体选择性决定， 动力学拆分过程取代基较小时，主要为顺式（Syn） 取代基较大时，主要为反式（Anti）,a:获得的是2R,3R-Syn和2S,3R-anti,羰基还原产生的仲醇手性遵循Prelog法则模型预测：非对映体选择性 1、-取代基小于羧基部分，进入S -取代基大于羧基部分，进入L 2、酵母中存在多种脱氢酶，可以获得各种 可能的非对映体产物-取代基为羟基、硫代烷基、叠氮基、 乙酰氨基或者位完全取代时，不利于 发生烯醇异构化，不能原位消旋,环状酮酯的还原,根据上述模型，可以推测酵母还原-环酮 获得相应的顺式-羟酯。原因在于环状结构的刚性，使、-碳碳 键不能旋转因此环酮还原反应的对映体选择性比无环酮要高环结构中引入S，生物转化后再除去，增加 对映体选择性,用相同方法可以将-酮酯， -酮酰胺转 化为相应的-羟基衍生物根据Prelog法则，利用酵母作为催化剂，可 以将丙酮酸盐和-酮苯乙酸酯转化为高光 学纯度（e.e.为91100）的S-乳酸盐和 R-扁桃酸酯,环状-双酮,还原产物为-羟基酮，而不会产生双羟基碳上的H具有酸性，可能会导致底物和乙 醛发生缩合反应。所以可在此处用取代基 进行取代，以避免这一副反应对于小环，顺式产物占优势，光学纯度高环变大时，立体选择性比较难以预测，产 率会下降,酵母还可以用于还原带有硝基、氟、硫和 杂环功能化合物的还原，以及金属有机化 合物的还原。产物一般是S-醇很多成功的实例，有些已经工业化除了酵母外，当酵母催化的反应立体选择 性较低，或者产生的产物与所需构型相 反，则可以考虑用其他微生物进行催化,无环-双酮的还原,生产二醇首先是空间位阻较小的羰基被还原为S- 羟基酮（Prelog法则）然后是空间位阻较大的酮被进一步还原， 产生二醇，主要产物为反式二醇,完整细胞还原CC键,酶立体选择性催化还原潜手性CC双键具 有较高的专一性，可用于很广的底物范 围，一般来说是用传统化学方法很难实现 的酶：以NADH为辅酶的烯酸还原酶很多微生物中都存在，比如Clostridia，Proteus sp.以及酵母中,烯酸还原酶已经被分离纯化和鉴定制备性生物转化还是利用完整细胞，因为 存在辅酶再生的问题，同时烯酸还原酶对 痕量氧很敏感酶反应的立体化学过程：氢反式加成在 CC双键上（植物细胞中有顺式加成）,酵母细胞不对称还原CC双键,1934年发现面包酵母可以不对称还原CC建立了一套面包酵母对CC不对称还原的 作用规律，有时可以用于其他微生物C=C需经吸电子取代基团活化以后才能被还 原，单独的CC和碳碳三键无法被还原具体的活化基团见随后的具体例子,-不饱和碳酸和酯的还原,产物的绝对构型可以通过起始烯烃的顺反 异构体（E，Z）来控制一般是酯先被水解为相应的酸，然后再被 还原,-不饱和内酯也可以作为还原底物，产 物为R型,不饱和内酯,-不饱和醛的还原,首先CC被烯酸还原酶还原生产饱和醛饱和醛被脱氢酶还原得到手性链烷醇烯丙醇也可以作为底物,共扼二烯中只有,双键被选择性还原,-不饱和酮的还原,CC首先被还原，得到饱和酮然后被脱氢酶还原产生手性仲醇有些时候，吸电子基团活化的不饱和酮首 先被还原,-不饱和硝基化合物可被转化为手性 硝基烷烃，但是光学纯度不高,全细胞体系的辅酶再生技术,可以避免辅助底物产物不需要的代谢物将不可降解的有机染料分子用于电子传递的中间体提高反应速率，相当于加入了辅酶中间体的还原形式可以直接或者间接再生NADH氧化型中间体可以用廉价还原物质酶法再生再生所需酶微生物体内都具备,课堂作业:请描述酶法制备S-2-氯丙酸联产S-乳酸过程所用的原料名称和酶,2 氧化反应,氧化反应是向有机分子引入功能基团的重 要反应化学方法立体选择性差，副反应多，环境 污染严重生物法一般具有较好的立体选择性,醇和醛的氧化,酶：氧化酶，加氧酶脱氢酶一般不用于氧化反应 1、热力学上来说，醇的氧化反应比较困难 氧化型辅酶的再生也比较困难 2、产物抑制严重，醛、酮和酶结合比较紧密 3、酶氧化反应最佳pH一般为89，而此时 辅酶和产物（尤其是醛）是不稳定的 4、仲醇的氧化一般涉及到手性中心的破坏,多元醇的区域选择性氧化,酶催化醇的氧化反应只有涉及到复杂分子 如多元醇才具有实际意义传统方法氧化这些物质存在选择性问题， 涉及到羟基的一系列保护和去保护步骤各种微生物，如Acetobaoter或Pseudomonas 等可以一步反应就将多羟基化合物选择性 氧化为相应的酮醇或者酮酸,醇的氧化拆分,理论转化率100,用HLADH进行对映体的选择性氧化,R=-CH2OH,-CH2F,-CH2Cl,-CH2Br,-CH3,-CH2NH2,-CH=CH2,-CH2CH3,用HLADH进行对映体的选择性氧化，从而 进行醇的拆分主要困难在于NAD的再生FMN再生体系可以用于HLADH对单、双、 多环仲醇的拆分为避免酶的失活，过程中产生的过氧化氢 可用过氧化氢酶去除醇氧化为醛，继而氧化为酸,不对称氧化潜手性或者内消旋二醇,仲醇的拆分一般用酯酶代替上述氧化还原 反应潜手性或内消旋结构的二醇的不对称反应 是合成手性内酯的好方法HLADH一般选择性氧化S或者潜手性S羟基存在自发形成半缩醛的反应,S型，高选择性，e.e. 100,HLADH对双环内消旋二醇的拆分,总的来说，HLADH对连接S-中心的羟甲基 具有完全的对映体专一性经HLADH催化，先生成的羟醛变成半缩 醛，然后被进一步氧化产生内酯仅在双环辛烷体系中有少量中间体半缩醛 存在,加氧反应,直接催化分子氧进入有机分子的酶称为加 氧酶非活性有机底物的直接加氧官能团反应对 合成化学来说有很多难以解决的问题酶催化加氧反应就比较容易进行反应尤其是存在区域选择性或者对映体专一性 的要求时，用生物催化可以实现高选择性 的加氧反应,氧进入有机受体分子的机制,单加氧酶的作用下，以NADH或者NADPH 作为辅酶，形成H2O，一分子氧加到底物上双加氧酶直接将氧分子加到底物上，因此 有时也称为氧转移酶氧化酶涉及到氧上面的电子传递，可以是 传递2个或者4个电子，形成过氧化氢或者 水 包括：黄素蛋白氧化酶（如葡萄糖氧化酶） 金属黄素氧化酶（如醛氧化酶） 亚铁蛋白氧化酶（如过氧化氢酶）,单加氧酶,单加氧酶的反应机理根据酶底物的种类不 同而有不同，但他们激活氧的方式是一样 的分子氧被还原剂如NADH，NADPH的还原过 程所激活，其中一个氧转移到底物上，另 一个还原形成H2O,活化氧传递物质的产生由含有过渡态金属 （Fe或Cu）的辅酶或由杂芳香烃系统来传 递在Fe基础上的单加氧酶的催化循环，主要 是细胞色素P450另外一种反应机制则是以黄素为辅酶的,细胞色素P450是各种生物的血红蛋白所广 泛具有的一类物质它在肝脏这类解毒器官中含量丰富，在微 生物体内也有虽然不同来源的酶具有显著差异，如氢的 供体等，但是所有细胞色素P450单加氧酶 中类似于血红素亚基地26个氨基酸序列都 是相同的,细胞色素P450的反应机制类似于高价金属 离子的化学氧化（亲电攻击）FAD的机制类似于过氧化物和高价酸对有机 化合物的氧化（亲核攻击）很多单加氧酶是与膜相结合的，因此很难 分离，加上NAD(P)H的再生问题，所以大 部分单加氧酶催化的反应是利用全细胞的缺点是目标产物产率较低，因为细胞会继 续利用产物，可以通过筛选阻遏产物降解 或者酶缺陷株来解决这个问题,链烷烃的羟化反应,碳氢化合物非活性中心的羟化反应是生物 转化中最有用的反应之一生物羟化反应中C原子的相对反应活性： 仲叔伯，而自由基反应则是叔仲伯20世纪40年代后期开始研究链烷的立体选 择性羟化，已经有工业化应用选择适当的微生物，实现选择性羟化任一 立体中心,在对多种微生物对非天然脂肪族化合物的 羟化能力的研究中，真菌Beauveria bassiana 是研究得最多的。一般来说，底物中象乙酰胺、苯甲酰胺或 对甲苯磺酰胺等有极性基团的存在，对于 底物在酶活性中心上的定位是有利的羟化发生在距极性结合基团3.36.2埃的地 方不同大小的环烷的环发生竞争时，羟化按 照以下顺序进行，环庚基环己基环戊基,大多数情况下，B. bassiana羟化反应有很 高的区域选择性，但对映体选择性一般比 较差改进区域和对映体选择性方法 1、改变培养条件 2、筛选微生物 3、修饰底物,芳香族化合物的羟化反应,使用纯化学方法进行芳香族化合物的区域 选择性羟化反应是很难的（邻、对位羟化 试剂，危险，副产物多）单加氧酶可进行邻、对位选择性羟化，间 位羟化反应很少酚类化合物可以被多酚氧化酶选择性氧 化，获得邻位羟化产物，产率较高，但是 反应会继续下去生产不稳定的邻苯醌，发 生聚合，尤其是在水中,反应在合成上的应用可用于含对羟基酚部分的氨基酸和醇的氧化，如合成L-多巴等。,