南师大 分子生物学PPT课件.ppt

第一章 氨基酸序列中的功能性密码,第一节 氨基酸序列的合成 第二节 氨基酸序列与蛋白质分选 第三节 氨基酸序列与信号肽 第四节 氨基酸序列与导肽 第五节 氨基酸序列与蛋白质折叠第六节 氨基酸序列与酶的活性第七节 氨基酸序列与细胞凋亡,蛋白质中的结构基础 多肽的转运与定位 蛋白质的折叠 蛋白质的分泌与分选 蛋白质的降解以及细胞的的信号转导,氨基酸序列的作用,氨基酸以及缩写符号,第一节 氨基酸序列的合成,氨基酸彼此在核糖体上缩合成多肽链，是通过核糖体循环而实现的。此循环可分为肽链合成的起始(intiation)，肽链的延伸(elongation)和肽链合成的终止(termination)三个主要过程。,1 肽链合成的起始,肽链合成的30S起始复合物,三元复合物(trimer complex)，又称IF3-30S亚基-mRNA三元复合物。在起始因子2(IF2)的作用下，甲酰甲硫氨酸-起始型tRNA(fMet-tRNA) ，依靠密码子与反密码子相互反应，与mRNA分子中的起始密码子(AUG或GUG)相结合。同时IF3从三元复合物脱落，形成30S前起始复合物(30S pre-initiation complex)，即IF2-30S亚基-mRNA-fMet-tRNA复合物。此步需要GTP和Mg2+参与。,肽链合成的70S起始复合物,50S亚基与上述的30S前起始复合物结合，同时IF2脱落，形成70S起始复合物，即30S亚基-mRNA-50S亚基-fMet-tRNA复合物。此时fMet-tRNA占据着50S亚基的肽酰位（peptidyl site，简称为P位或给位），而50S的氨基酰位（aminoacyl site，简称为A位或受位）暂为空位。,2 肽链的延伸,这一过程包括进位、肽键形成、脱落和移位等四个步骤。肽链合成的延长需两种延长因子(Elongation factor，简写为EF)，分别称为EF-T和EF-G 。此外尚需GTP供能以加速翻译过程。,进位：即新的氨基酰-tRNA进入50S大亚基A位，并与mRNA分子上相应的密码子结合。此步需GTP、EF-T及Mg2+的参与。 肽键形成：在大亚基上肽酰转移酶的催化下，将P位点上的tRNA所携带的甲酰甲硫氨酰(或肽酰基)转移给A位上新进入的氨基酰-tRNA的氨基酸上，即由P位上的氨基酸(或肽的羧基端氨基酸)提供-COOH基，与A位上的氨基酸的-NH2基形成肽链。此步需Mg2+及K+的存在。脱落：即50S亚基P位上无氨基酸负载的tRNA脱落。 移位：指在EF-G和GTP的作用下，核糖体沿mRNA链(53)作相对移动。每次移动相当于一个密码子的距离，使得下一个密码子能准确的定位于A位点处。,3肽链合成的终止,肽链合成的终止，需终止因子或释放因子(releasing factor，简写为RF)参与 。RF具有识别mRNA链上终止密码子使肽链释放，核糖体解聚的作用。,第二节 氨基酸序列与蛋白质分选,细胞内合成的蛋白质之所以能够定向的转运到特定的细胞器，取决于两个方面：其一是蛋白质中包含特殊的信号序列（signal sequence or targeting sequence ），其二是细胞器上具特定的信号识别装置（分选受体，sorting receptor）。,两类蛋白质分选信号：信号序列（signal sequence）：存在于蛋白质一级结构上的线性序列，通常15-60个氨基酸残基，有些信号序列在完成蛋白质的定向转移后被信号肽酶（signal peptidase）切除。信号斑（signal patch）：存在于完成折叠的蛋白质中，构成信号斑的信号序列之间可以不相邻，折叠在一起构成蛋白质分选的信号。,哺乳动物细胞大约含有 10, 000 种蛋白质， 酵母约含 5, 000 种 除了少量的蛋白质由线粒体和叶绿体 DNA 编码外，其余蛋白质都是由细胞核 DNA 编码，在细胞质（cytosol）游离核 糖体（free ribosomes）上合成,细胞要发挥正常功能，必须使每一个蛋白 质都要在膜（细胞膜，细胞器膜）或水相 腔室（细胞质，细胞器基质或内膜腔）中 正确定位。 如： 1、受体蛋白、离子通道蛋白和转运蛋白需要嵌在质 膜内； 2、 DNA 、RNA 聚合酶需送到核（nucleus ） ； 3、蛋白酶（proteolytic enzymes）和过氧化氢酶 （catalase）应分别转运至溶酶体（lysosome） 和过氧化物酶体（peroxisome）；4、其他如细胞外间质（ECM）和激素则需要分泌到 细胞外。,蛋白质的转运 一、信号序列（斑块）、跨膜疏水区和分拣信号 二、伴侣蛋白（chaperone） 三、翻译同步转运和翻译后转运,一、信号序列（斑块）、跨膜疏水区 和分拣信号,1. 信号序列（斑块） 2. 跨膜疏水区 3. 分拣信号,1. 信号序列（斑块）（signal sequece/patch）,内质网（endoplasmic reticulum, ER）信号序列： 存在于所有分泌蛋白质的前体中。一般位于肽链 N-terminus ，引导新生肽从细胞质进入内质网。基质（matrix）信号序列：引导新合成的蛋白质经过跨 膜转运从细胞质进入细胞器基质。,内膜腔（intermembrane space）信号序列： 新合成的蛋白质进入基质后，基质信 号序列被切除，然后由内膜腔信号序 列引导蛋白质进入内膜腔（即内、 外膜间隙）。 信号斑块：蛋白质分子中由于肽链折叠而使 互不连续的肽段相互靠拢，而构成的 局部立体结构，其功能与信号序列相 似。 信 号 斑 块：蛋白质分子中由于肽链折叠而使互不连续的肽段相互靠近构成的局部立体结构，其功能与信号序列相似。,2.跨膜疏水区,信号-锚定序列（signal-anchor sequence）：引 导新生肽链从细胞质进入内质网并锚定在 内质网膜中。 停止转运-锚定序列（stop transfer-anchor sequence） ：停止新生肽链的转运并锚定在内 质网膜中。 信号-停止转运-锚定序列（signal-stop transfer anchor sequence）：兼有上述二者功能。,3.分拣信号（sorting signal）,存在于已合成的蛋白质中，能被特异的 受体所识别，从而引导蛋白质到达合适的 地点。 如溶酶体分拣信号 M6P、内质网分拣信 号 KDEL 等 （赖天谷亮）,各种蛋白质含有一种或多种信号序 列或跨膜疏水区，从而决定了它们在细 胞内的精确定位。,两类分选信号,一些典型的分选信号,二、伴侣蛋白（chaperone）,细胞内 95% 以上的蛋白质处于天然构象状 态，所以蛋白质的折叠效率很高。 有些蛋白质由于自身内部发生的相互作用 而进行自我组装（self assembly），但更 多蛋白质的折叠需要伴侣蛋白参与。,伴侣蛋白广泛地存在于所有生物细胞 内，他们与靶蛋白的活性表面结合， 阻止这些活性表面与蛋白质其他部分 发生作用，从而防止蛋白质形成错误 构象。 伴侣蛋白有 ATP 酶（ATPase）活性， 它们结合并稳定靶蛋白的过程需要 ATP 水解。,伴侣蛋白的功能,伴侣蛋白与正在合成中的肽链结合， 介导各功能域乃至整个蛋白质分子的 正确折叠。与胞液中合成的线粒体及叶绿体蛋白 质结合，使肽链保持伸展状态而被跨 膜转运。应激状态下，与非天然构象的蛋白质结 合，稳定其结构，防止蛋白质变性后内 部疏水基团暴露而发生不可逆的凝集。 另外，伴侣蛋白还介导新复制的 DNA 和组蛋白装配成染色质，蛋白质的降解， 类固醇激素信号传递中类固醇受体的变 构，某些酪氨酸蛋白激酶的活化等多种 生理生化过程。,伴侣蛋白可分为两类,1. molecular chaperone：与未折叠或部分 折叠的蛋白质结合，防止蛋白质降解。 2. Chaperonin：陪伴蛋白。多个分子伴侣 蛋白形成的复合体，能直接推动蛋白质 的折叠。,1. molecular chaperone,Hsp70（heat shock protein）分子伴侣家族。 包括 Hsp70（细胞质、线粒体基质），Bip （immunoglobulin heavy-chain binding protein, 内质网），DnaK（细菌）。 Hsp70 的作用机制： Hsp70 与 ATP 结合后， 呈开放形式，其疏水“口袋”暴露出来，与靶 蛋白的疏水区结合。然后 ATP 水解，hsp70 变成关闭形式，释放蛋白质。,2. chaperonin,少数蛋白质（如细胞骨架中的肌动蛋白、 微管蛋白）的正确折叠需要chaperonin 辅助. 真核 chaperonin: 如TCIP(tubular cell interaction products )，大的桶形多聚 体复合物，由 8 个 Hsp60 亚基组成。,细菌 chaperonin：GroEL（大肠杆菌 Hsp60 ）， 14 个相同的亚基组成，形成两个七聚体的环。每个 亚基结合一个 ATP。两个环上下堆叠在一起，中间 形成一个通道。 GroES（大肠杆菌陪伴蛋白之一） 是 一个七聚体复合物，与GroEL结合，帮助 GroEL 完成蛋白质折叠，因此称为 co-chaperonin,三、翻译同步转运和翻译后转运,真核生物细胞中所有蛋白质的起始合成都是在游离核糖体 1. 翻译同步转运（co-translational translocation） 2. 翻译后转运（post-translational translocation）,1. 翻译同步转运（co-translational translocation）,蛋白质在游离核糖体中先合成N-terminus 信号序列（即内质网信号序列），信号序列介导核 糖体与内质网膜结合，使新生肽链边合成边进入内 质网腔（ER lumen）或插入内质网膜。,进入内质网腔或膜的蛋白质，除了一部分留 在内质网外， 其他的形成转运小泡（transport visicle）被运输到各个细胞器或分泌到细胞外（分 泌途径）。分泌途径（secretory pathway）是指通过翻 译同步转运、小泡介导的方式把蛋白质 分泌到细胞外。,蛋白质分泌有两种形式：,组成型分泌（constitutive secretion），即蛋白质持续 地进行的分泌。这些蛋白质在外侧高尔基体网 （trans-Golgi network）进行分拣，然后由转运 小泡运送到质膜并与质膜融合，最后通过外吐作 用（exocytosis）释放到细胞外 调控型分泌（regulated secretion），蛋白质在外侧高 尔基体网络分拣后形成分泌小泡（secretory vesicles），然后储存在细胞内，有神经或激素 刺激时从细胞内释放出来,新生蛋白质从核糖体进入内质网的过程, 分泌性蛋白通过内质网膜进入内质网腔 膜蛋白插入内质网膜, 分泌性蛋白通过内质网膜进入内质网腔, 信号序列 信号识别颗粒和受体 易位子 能量供应, 信号序列,由 1630个氨基酸残基组成，一般位于 N-terminus， 含有一个或两个带正电荷残基，后面是连续的612 疏水性氨基酸残基. 引导游离核糖体与内质网结合，起始新生肽链向内质 网膜的转运. 疏水残基形成的信号序列与内质网膜上受体蛋白结合 的位点有关. 信号序列由内质网腔内的信号肽酶（signal peptidase） 切除。所以成熟的蛋白质没有信号序列., 信号识别颗粒（ SRP ）和受体（SRP receptor）,SRP 是一种核糖核蛋白（ribonucleoprotein）， 由 6 条多肽链及含 300 个核苷酸的 7S 小 RNA 组成。 P54 的一个区域含有甲硫氨酸残基簇。甲硫 氨酸的疏水侧链向外伸展，与信号序列的疏 水氨基酸残基相结合。P9 / P14 与核糖体相互作用。 P68 / P72 为蛋白质转运所必需。,SRP 功能,：介导新生肽链与内质网膜结合； 在核糖体没有与内质网膜结合时阻止肽 链延长。,信号识别颗粒受体（ SRP receptor ），又称停靠蛋 白（docking protein） 由两个亚基组成： subunit 为膜蛋白：含 300 个氨基酸残基。 subunit 是膜周边蛋白 ：含 640 个氨基酸残基， 负载着GDP，并且有 GTP 酶活性。 SRP receptor 功能: 与 SRP 结合并起始肽链向内质 网膜转运；使肽链的延长继续进行。, 易位子（translocon）,新生肽链由于 N-terminus 带有正电荷，不 能轻易进入疏水的内质网膜。所以要完成蛋白 质的转运，需要内质网膜提供一个水相通道 （aqueous channel）。这个水相通道就是易位 子。,易位子含两种蛋白成分,转位链相关膜蛋白（translocating chain-associated membrane protein, TRAM protein） TRAM 蛋白 至少跨膜 8 次，能与新生肽链进行交联。 Sec61 蛋白（酵母secretion gene 产物），易位子通道的主 要蛋白成分。哺乳动物 Sec61p 含 10 个跨膜 helices，与 Sec61 和 Sec61 共同形成 Sec61 复合 物。这个复合物能与核糖体大亚基紧密结合，从而 把核糖体与内质网膜连接起来。,易位子的功能,无蛋白质转运时，易位子的胞质面被 Sec61p 蛋白的一个片段关闭。 核糖体-新生链复合物结合后，易位子打开， 同时核糖体与易位子之间紧密密封以防止小 子物质进入易位子。 然后肽链一边合成一边通过易位子通道进入内 质网。, 能量供应,SRP 的 P54 蛋白和 SRP 受体的 subunit 都 负载着 GDP，且都有 GTPase 活性。 GTP 取代 GDP，促进核糖体-新生肽链-SRPSRP 受体复合物的形成。 水解 GTP，复合物解离，核糖体-新生肽链易位子复合物形成。SRP 和受体进入下一轮 循环，而肽链转移继续进行。,分泌性蛋白通过内质网膜进入内质网腔的 全过程, 膜蛋白插入内质网膜,膜蛋白以翻译同步转运的方式一边合成一边插入内 质网膜中。 合成完毕后，一部分留在内质网膜，但大部分通过 小泡转运到质膜或其他细胞器膜（如滑面内质网、 高尔基复合体、溶酶体、内体）。 在转运过程中，蛋白质的方向保持不变。比如，同 一个片段总是向着细胞质。所以膜蛋白的方向都是 在内质网膜上合成时建立的。 膜蛋白插入内质网膜的过程需要多种信号序列。,各种膜蛋白在内质网膜中的方向,2. 翻译后转运（post-translational translocation）,翻译后转运指的是游离多聚核糖体上合成的蛋 白质的运输。 （1）转运到线粒体（mitochondria） （2）转运到叶绿体（chloroplast）（3）转运到过氧化体（peroxisome） （4）转运到细胞核（nuclear）,第三节 氨基酸序列与信号肽,经典的信号肽（signal peptide）概念 ：,是指某种分泌蛋白质及细胞膜蛋白质等，以前体多肽的形式合成，其N末端含有作为通过膜时之信号的氨基酸序列，这种氨基酸序列称信号肽或信号序列。由1525个氨基酸所组成，在N末端附近除有碱性氨基酸外，还主要含疏水性氨基酸，特别是在其中部没有带电荷的氨基酸。,分泌蛋白质通过内质网膜的机理,第四节 氨基酸序列与导肽,导肽的概念 导肽又称转运肽(transit peptide)或导向序列(targeting sequence)，它是游离核糖体上合成的蛋白质的N-端信号。 导肽是新生蛋白N-端一段大约2080个氨基酸的肽链, 通常带正电荷的碱性氨基酸(特别是精氨酸和赖氨酸)含量较为丰富。不同的转运肽之间没有同源性，说明导肽的序列与识别的特异性有关，而与二级或高级结构无太大关系。,需要受体；消耗ATP；需要分子伴侣；要电化学梯度驱动；要信号肽酶切除信号肽；通过接触点进入；非折叠形式运输。,导肽运送蛋白质时具有以下特点:,穿越线粒体膜需要一系列的折叠和非折叠,第五节 氨基酸序列与蛋白质折叠,蛋白质执行各种特定的生物功能完全仰赖其特定的氨基酸序列和三维空间结构。蛋白质结构预测与蛋白质折叠是生命科学研究的核心问题之一,也是后基因时代推动生物学朝着定量化发展的重要方向之一,它是分子生物学中心法则还没有解决的一个重大生物学问题。,1 蛋白质折叠的热力学与动力学控制,天然蛋白质多肽链采取的构象是在一定环境条件下热力学上最稳定的结果采取天然构象的多肽链和它所处的一定环境条件（如溶液组分、pH、温度、离子强度等）使整个系统的总自由能最低处于变性状态的多肽链在一定的环境条件下能够自发折叠成天然构象。,从总体上讲，蛋白质的折叠是遵循“热力学假说”的，从高能态向低能态转变，但在这个过程中会受到动力学上的控制。热力学控制与动力学控制在蛋白多肽链的折叠反应中是统一的，不同的蛋白质的折叠过程中所体现出来的二者所起作用大小可能有所不同。对一些小分子单结构域的蛋白质来说，折叠过程简单，在热力学控制下较易完成；一些结构较复杂的蛋白质特别是一些在折叠时需要二硫键重排。,2 大分子拥挤环境(macromolecular crowding),由于大分子的不可穿透性，使得任何一个大分子的实际可及空间大大减少, 这样的生物大分子活动环境被称为“大分子拥挤环境” ，它对生物大分子行为的影响用比较准确的术语描述就是“排斥容积效应” (excluded volume effect) 。,在生命科学研究中引进大分子拥挤概念成为一个学术动向,已有大分子拥挤对生化反应影响的理论预测和一些研究大分子拥挤对蛋白质折叠影响的实验, 但是这方面的实验实在还进行得不多。,(a) 大肠杆菌细胞质内的蛋白质、RNA、核糖体、微管物大分子； (b) 蛋白质周围的拥挤环境,大肠杆菌细胞质内的蛋白质、RNA 、核糖体、微管物大分子的分布情况,3 levinthal假说,一个未折叠的蛋白质分子，没有时间寻找所有可能的构象，然而它很快就能到达唯一的自然状态。传统的观点认为，部分未折叠中间体的存在对于解释假说是关键的 近来的观点认为未折叠的分子是在漏斗样能量地形中寻找自然状态的,第六节 氨基酸序列与酶的活性,酶的分子结构的基础是其氨基酸的序列，它决定着酶的空间结构和活性中心的形成以及酶催化的专一性。,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)受体家族,第七节 氨基酸序列与细胞凋亡,死亡受体都是跨膜蛋白，其胞内区都有一段氨基酸与凋亡信号的传递密切相关，被称为死亡结构域(death domain,DD),死亡效应结构域(death effector domain, DED),所有Caspase蛋白水解酶都具有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性，它们均以酶原(Proenzyme)形式存在，由N端长区(Prodomain)约30KD，大亚单位约20KD和小亚单位约10KD三个结构域组成，其结构具有三个共同特点：N端序列和长度具有高度可变性，与激活调控密切相关；所有结构域都有相同的裂解位点ASP- X,提示其可自我激活或被其它Caspase所激活；各成员在负责底物结合区域的氨基酸序列十分保守，具有qACRq五肽结构。,本章摘要,氨基酸序列是指由20种常见氨基酸按照遗传信息组合连接而成的序列，即我们通常所说的肽链，它是蛋白质结构的基础。然而，其功能不仅仅局限于作为蛋白质中的结构基础，在多肽的转运与定位，蛋白质的折叠，蛋白质的分泌与分选，蛋白质的降解以及细胞的的信号转导等众多机制中，氨基酸序列都有着重要的信号作用。,本章习题,1.多核糖体，蛋白质的分选，信号肽，导肽，蛋白质分子的折叠，分泌蛋白，Levinthal假说，大分子拥挤环境2.蛋白质是怎样进行分选的？3.阐述导肽的结构特征与功能。4.氨基酸序列与蛋白质分子的折叠有哪些关联？5.蛋白质的分泌与氨基酸序列有何关系？,