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色 谱 分 离,生 物 工 程吴 灵 玉,概述色谱分离过程的基本原理色谱的分类色谱分离过程基础理论色谱技术的应用,1.概述-发展,关于色谱分离方法的研究始于1901年，俄国植物学家 Tswett（茨维特）在研究植物叶子的组成时，用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散三种颜色的6个色带。两年后他发表了他的研究成果“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”，提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法，在这一方法中把玻璃管叫做“色谱柱”，碳酸钙叫做“固定相”，石油醚叫做 “流动相”。三年后，他将这种方法命名为色谱法（Chromatography）。,色谱法于二十世纪五十年代之后飞速发展，并发展出一个独立的三级学科-色谱学。1952年英国科学家阿切尔马丁、理查德辛格因发明了分配色谱法而共同获得诺贝尔化学奖，此外色谱分析方法还在12项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关键作用。,1.概述-色谱分离的特点,应用范围广 复杂混合物，有机同系物，异构体，手性异构体。 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。分离效率高 若用塔板理论数来表示色谱柱的效率，每米柱长可达几千至几十万的塔板数，特别适用于极复杂混合物的分离，且通常收率、产率、和纯度都较高。操作模式多样 可通过选择不同的操作模式，以适应不同样品的分离。灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。,2.色谱分离过程的基本原理,色谱分离的几个概念所有的色谱分离操作均分为：装柱、上样、层析、洗脱。其中的固定不动的相，称为固定相；携带试样混合物流过此固定相的流体，称为流动相；作为流动相的液体或气体，称为洗脱剂；洗脱时从柱中流出的溶液，称为洗脱液；加入洗脱剂使各组分分层的操作，叫层析，也叫展开。,分离原理,色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。 不同组分在色谱分离过程中分离情况取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等的差异。,常用的固定相（色谱柱填料）,硅胶活性炭离子交换树脂大孔吸附树脂,凝胶纤维素衍生物环糊精聚丙烯酰胺,硅胶：应用广泛，适合各类成分氧化铝：主要用于碱性或中性亲脂性成分，如生物碱、甾体、萜类等活性炭:用于水溶性氨基酸、糖类及苷类聚酰胺：主用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及鞣质等成分,3.色谱的分类,按两相状态 气固色谱、气液色谱、 液固色谱、液液色谱 按固定相几何形式 柱色谱、纸色谱、薄层色谱 按分离原理 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、 凝胶色谱、排阻色谱、亲和色谱,色谱分离法,吸附色谱,物理吸附：硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行的吸附色谱；化学吸附：黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生物碱被酸性硅胶吸附等；半化学吸附：聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间的氢键吸附，吸附力较弱，介于物理吸附与化学吸附之间。常用的极性吸附剂：硅胶、氧化铝。常用的非极性吸附剂：活性炭。,凝胶过滤色谱（凝胶渗透色谱、分子筛滤过色谱、排阻色谱）原理：分子筛作用葡聚糖凝胶（sephadex G） 羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20),凝胶过滤色谱,离子交换树脂法,原理：可交换离子与树脂上的交换基团进 行离子交换，并被吸附，用适当的溶剂 从柱上洗脱下来，实现物质的分离。吸附规律 阳离子交换树脂分离碱性成分 阴离子交换树脂分离酸性成分,大孔吸附树脂,吸附性和分子筛性原理相结合以苯乙烯为母体，二乙烯苯为交联剂（非极性）吸附性：范德华力或氢键工艺流程：树脂预处理树脂上柱药液上柱树脂的解吸树脂的清洗、再生。,分配色谱,原理：被分离成分在固定相和流动相之间的 分配系数不同。正相分配色谱：流动相极性固定相极性HPLC、MPLC、LPLC,4.色谱分离过程理论基础,随着色谱技术的发展，为了解释色谱分离现 象，指导色谱技术的发展，许多研究者对色谱基 础理论进行了不懈的研究，提出了多种色谱过程 的理论。主要有速率方程理论、平衡色谱理论、 塔板理论、轴向扩散理论。,4.色谱分离过程理论基础,塔板理论由马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间被固定相占据，而另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，其分离效果就越好。,4.色谱分离过程理论基础-保留值,保留时间（t R）：从进样到某个组分的色谱峰顶点之间的时间间隔死时间（t M）：不被固定相滞留的组分从进样开始、通过色谱柱、到出现峰最大值所需要的时间。调整保留时间（t R ）：t R= t Rt M,保留值是色谱过程的基本热力学参数之一。在相同的操作条件下，不同的物质有各自固有的保留时间，因此它也是色谱定性的基本依据。,峰宽Wb：色谱峰拐点处的两条切线与基线的两个交点之间的距离；半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽，为2.35 ；相邻色谱峰峰顶之间的距离除以此二色谱峰的平均宽度。用R表示：,分离度,定性时要求：R =1.0（相邻两峰分离程度98%）定量时要求：R =1.5（相邻两峰分离程度99.7%，基线分离，作为完全分离的标准）。一般将R1作为色谱能较好分离的判据。,柱效率实际工作中，塔板数的计算用下列公式： 而理论塔板数的计算公式为： n = L / H 其中L为色谱柱的柱长； H为理论板高度。,考虑到组分在死时间内不参与柱内分配，用调整保留时间代替保留时间，得有效塔板数和有效塔板高度：,5.色谱分离的应用,色谱法的应用可以根据目的分为分析性色谱和制备性色谱两大类。 分析性色谱的目的是定量或者定性测定混合物中各组分的性质和含量。定性的分析性色谱有薄层色谱、纸色谱等，定量的分析性色谱有气相色谱、高效液相色谱等。制备性色谱的目的是分离混合物，获得一定数量的纯净组分 。,5.色谱分离的应用,薄层色谱（TLC）高效液相色谱（HPLC）气相色谱法（GC）典型制备色谱,1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家Stahl出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用。,优点：设备简单、操作方便、运行费用低；分离时间短，工作效率高；展开剂选择范围广，展开方式多样；显色方便，检测手段丰富；既可分析，又可制备；试样一般不需要经过严格预处理即可分离。 缺点： 分离效率较低；不适用挥发性试样分离；定性定量不便。,比移值（Rf值）:用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，用Rf表示。,显色方法,日光下观察,划出有色物质的斑点位置在紫外灯下(254nm或365nm),观察有无荧光的产 生,用硅胶G板荧光淬灭法,适用于有紫外吸收的物质，用GF254板显色剂显色,破坏性检出方法,常用显色剂,硫酸 硫酸-水；硫酸-甲醇/乙醇；0.5%碘的氯仿溶液 对很多化合物显黄棕色中性0.05%高锰酸钾溶液 易还原性化合物在淡 红色背景上显黄色碱性高锰酸钾试剂 还原性化合物在淡红色背景 上显黄色,TLC的应用,1. 用于柱层析后相同组分的合并2. 有机合成监控反应，摸索最佳条件3. 制备有机化合物4. 中药材的鉴定 在中华人民共和国药典中，共有超过约600种化学合成药和超过约400种中药的质量控制应用了高效液相色谱的方法。,5.色谱分离的应用,薄层色谱（TLC）高效液相色谱（HPLC）气相色谱法（GC）典型制备色谱,高效液相色谱仪,高效液相色谱是20世纪60年代末发展的一种以液体为流动相的色谱技术。特点如下：高压 一般可达（150350）105 Pa高速 一般可达110mL/min高效高灵敏度分析时使用样品少 一般仅几毫升,高效液相色谱仪流程（图）,1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2高压泵（输液泵）3进样装置4色谱柱分离5检测器分析6废液出口或组分收集器 7记录装置,贮液器,高压泵,梯度洗脱装置,进样器,色谱柱,记录仪数据处理机,检测器,组分收集器,试样,压力表,输液系统,流动相脱气的方法,超声波振荡脱气惰性气体鼓泡吹扫脱气在线（真空）脱气,HPLC用水,专门的纯水机或超纯水机；二次或三次重蒸水；市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；其它途径；,流动相溶剂的要求,溶剂对于待测样品 必须具有合适的极性和良好的选择性。溶剂要与检测器匹配 对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。高纯度 由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。化学稳定性好低粘度 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙睛等。,洗脱方式,等度洗脱用恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的浓度配比。优点：缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度。缺点：有时引起基线漂移；重复性不佳。,HPLC 色谱柱类型,化学键合相,利用化学反应将不同的有机官能团通过共价键键合到载体硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相。种类非极性键合相： 如键合C18、C8、苯基等，其中十八烷（ODS或C18）键合相是常用的代表，可完成HPLC分析任务的80%。中等极性键合相： 如键合醚基，可分离能形成氢键的化合物（如酚类）,评价色谱柱好坏的标准,1）理论塔板数n2）拖尾因子Tf 3) 色谱柱批与批之间的重现性4）pH值的适用范围5）使用寿命,拖尾因子Tf,对理想检测器的要求,高灵敏度；适用范围广，对所有组分都有响应；温度、流动相流速的变化对响应没有影响；可梯度洗脱，响应与流动相的组成无关；死体积小；使用方便、可靠、耐用；线性范围宽；响应时间快；,常用检测器,紫外检测器（UV）荧光检测器（FD）示差折光检测器（RID）蒸发光散射检测器（ELSD）,紫外检测器（UV）,配置最普遍；主要用于检测具有-、p 共轭结构的化合物，如芳烃、稠环芳烃等；灵敏度高；可用于梯度洗脱 缺点：只能检测有紫外吸收的样品；（衍生化解决）对流动相的选择有一定的限制；（截止波长）,荧光检测器（FD）,适用于能产生荧光的化合物；主要用于氨基酸、多环芳烃等样品；灵敏度极高（比紫外高13个数量级），适用于痕量分析；可梯度洗脱 缺点：许多化合物不产生荧光（可衍生化解决）；,示差折光检测器（RID）,通用性好；对糖类分析灵敏度尚可； 缺点：灵敏度低（比紫外低3个数量级）；不能梯度洗脱（否则，基线会漂移）,蒸发光散射检测器（ELSD）,20世纪90年代新开发；是示差折光检测器的理想替代品，对葡萄糖最小检出量5 ng；高灵敏；可梯度洗脱；缺点：对有紫外吸收的样品，检测灵敏度较低；,检测器比较,HPLC定性、定量分析,定性分析利用保留值定性；色谱-光谱联用定性； 利用馏分收集器收集 后，再用光谱定性；,定量分析归一化少用外标法内标法,5.色谱分离的应用,薄层色谱（TLC）高效液相色谱（HPLC）气相色谱法（GC）典型制备色谱,GC：以气体（即载气）为流动相的柱色谱 分离技术。 GC中常用作的载气的气体有N2、 He、 H2、 Ar，均为惰性气体。GC载气的功能仅仅是携带试样、洗脱组分。GC的选择性主要取决于固定相和组分分子 间的作用，所以可通过改变固定相来改变 GC的选择性。,气相色谱仪-GC,气相色谱仪流程（图）,气路系统进样系统分离系统（色谱柱系统）检测系统数据处理和控制系统（含温控系统）,样品,进样汽化,色谱柱分离,检测器,信号记录,载气,进样系统,由进样器和气化室构成。液体样品微量注射器气体样品六通阀、微量注射器气化室温度：要保证样品瞬间、完全气化，一般高于沸点50以上，但也不宜太高，以防分解,GC的特点,1.优点 分离效率高（填充柱上千块塔板） 分析速度快 样品用量少（检测限低，高灵敏检测器）2.缺点：（约20%样品适用） 样品须能气化（350下有一定的挥发性） 热稳定性要好 定性困难,柱温的选择,柱温应低于固定液的最高使用温度；柱温过高，易造成固定液流失、检测器噪声变大、基线漂移。柱温一般选择接近或略高于组分的平均沸点。降低柱温可在一定程度内改善分离；升高柱温可加快分析速度。组分复杂，沸程宽（80-100）的试样，采用程序升温。,对检测器的要求,稳定性好、噪声低；灵敏度高；线性范围宽；死体积小，响应快,噪声和漂移,噪声（N） ：在没有样品进入检测器时，基线在短期内发生的波动。噪声的来源：固定液的流失、载气的不纯，电子元件不稳定、温度变化、外磁场干扰等。基线漂移：基线在一定时间内产生的单向、缓慢移动。良好的检测器其噪声与漂移都应很小。,HPLC与GC比较,GC：适于能气化、热稳定性好的样品； 约占有机物的20%；HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限 制，对分子量大、难气化、热稳定性差的 样品均可检测 ，约占有机物的80%。,5.色谱分离的应用,薄层色谱（TLC）高效液相色谱（HPLC）气相色谱法（GC）典型制备色谱,典型制备色谱,制备色谱是适应科技和生产需要发展起来的一种新型、高效、节能的分离技术，目前在工业生产中应用的色谱分离技术主要是中、高压液相色谱。由于新的高选择性能固定相的开发，新型色谱技术的出现，以及色谱机制、色谱柱放大效应理论及相关数学模型研究的不断深入，使色谱分离取得了长足的发展。同时新的概念如SMBC（模拟移动床色谱）、Pre-SFC（制备型超临界流体色谱）以及EBAC（扩展床吸附色谱）也被引入，大大扩展了色谱作为一种工业提纯工具的应用领域。,模拟移动床色谱（SMB）,SMB色谱是连续操作的色谱系统 它由多根（大多为512根）色谱柱组成。每根柱子之间用多位阀和管子连接在一起，每根柱子均设有样品的进出口，并通过多位阀沿着流动相的流动方向，周期性的改变样品进出口的位置，一次来模拟固定相与流动相之间的逆流移动，实现组分的连续分离。,SMB色谱原理示意图,9,7,8,10,12,11,6,5,4,1,2,3,进料液A+B,带,带,带,带,萃取液,洗提液,萃余液,液体循环方向,模拟移动床色谱（SMB）,SMB的优势： 是一个连续的色谱分离过程； SMB色谱技术比其他制备色谱的分离效率高； SMB色谱技术可以实现旋光异构物分离过程从分析型色谱条件快速、可靠的放大； SMB色谱装置可以适合不同规模的色谱分离过程。,制备型超临界流体色谱,制备型超临界流体色谱（Pre-SFC）已应用于许多化学工业中的提取过程。最常见的是采用Pre-SFC提取香料或咖啡因等。目前SF-CO2在缓释药物合成及生物分子稳定和转移等方面的应用，使Pre-SFC制药工业的广泛关注。超临界流体是用二氧化碳等一类气体，使其处于临界状态下成为流体，以这种临界流体做流动相的色谱法，是处于液体色谱和气体色谱之间的色谱方法。CO2是SFC中最常用最安全的超临界流体。,SF-CO2色谱的工作示意图,p,净化,1,T0,CO2循环,色谱柱,Det,4,5,3,2,T0,T0,进料液,泵,气态区,泵,p,超临界状态区,液态区,液态CO2,纯组分,超临界流体色谱的优势： 在Pre-SFC中，通过改变流动相温度或压力即可改变其密度，色谱分享的特性就会改变； 收集的馏分中的流动相容易除去； 流动相回收简便，处理后可循环使用。然而Pre-SFC的应用也受到其自身特点的局限： 技术相当昂贵； 超临界流体的溶解性能不可能溶解所有物质，通常需要加入改良剂改善溶解性能，但同时部分抵消了其一些优势。,色谱法的应用,石油和石油化工分析环境分析食品分析药物和临床分析物化参数测定聚合物分析,人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。,