血脂及血浆脂蛋白检验ppt课件.ppt

-,1,第十章 血脂及血浆脂蛋白检验,-,2,血脂、血浆脂蛋白及载脂蛋白检验的重要性,-,3,-,4,临床常规血脂和脂蛋白测定项目:总胆固醇（totalcholesterol，TC，包括FC和CE）甘油三酯(TG)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)低密度脂蛋白胆固醇(LDL- C)载脂蛋白等。,-,5,第一节 概述第二节 血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定,本章内容概要,-,6,一、血脂及血浆脂蛋白,血脂：是血浆中脂类（脂质）物质的总称。包括中性脂肪（甘油三酯TG）和类脂（胆固醇Ch、胆固醇酯CE 、磷脂、糖脂、游离脂肪酸）。,定义：,脂蛋白：脂类难溶于水，正常血浆脂类物质与蛋白质结合成脂蛋白的形式运输和代谢 。,第一节 概 述,-,7,（一）血浆脂蛋白的分类,超速离心法：,乳糜微粒 CM,极低密度脂蛋白 VLDL,低密度脂蛋白 LDL,高密度脂蛋白 HDL,电泳法:,脂蛋白,前脂蛋白,-脂蛋白,乳糜微粒（CM）,中间密度脂蛋白 IDL,脂蛋白(a) Lp(a),-,8,原点 2 1 清蛋白,原点 前（CM）,血浆脂蛋白电泳,-,9,（二）血浆脂蛋白的组成与结构,甘油三酯、磷脂、胆固醇、胆固醇酯,载脂蛋白,-,10,9899%,最少, 1%,9095%,510%,含胆固醇及其酯最多,含脂类50%,2025%,最多，约50%,转运外源性TG,转运内源性TG,转运胆固醇到肝外组织,逆向转运肝外胆固醇回肝,含TG最多,TG多 （次于CM）,7580%,各种血浆脂蛋白的组成及功能,-,11,（三）载脂蛋白,脂蛋白的蛋白部分称为载脂蛋白(apolipoprotein，Apo),定义：,种类：,-,12,apoA apo B apoC apo D apoE B48 B100 C-, E B100A-,CM VLDLLDLHDL,-,13,功能：,与脂质的亲和作用而使脂质溶于水性介质中。运转胆固醇和甘油三酯。作为脂蛋白外壳的结构成分，与脂蛋白外生物信息相联系。以配体的形式作为脂蛋白与特异受体的连接物。（如：apoB100和apoE参与LDL受体的识别；apoE能被CM受体识别）激活某些与血浆脂蛋白代谢有关的酶类（如：ApoAI和CI能激活卵磷脂-胆固醇酰基转移酶LCAT，ApoC激活LPL）,-,14,分布及特点：,-,15,（四）脂蛋白受体,定义：,脂蛋白受体是一类位于细胞膜上的糖蛋白。它能以高度的亲和方式与相应的脂蛋白配体作用，从而介导细胞对脂蛋白的摄取与代谢，进一步调节细胞外脂蛋白的水平。,-,16,脂蛋白受体的作用：,位于各种细胞的膜上，脂蛋白转化分解后的残基主要通过脂蛋白受体被摄入细胞。不仅是运送脂蛋白至细胞所必需，也是从血和外周组织中有效清除具有潜在致动脉粥样硬化的脂蛋白所必需的。,种类：,已有很多种，主要有LDL受体、残粒受体（remnant receptor）及清道夫受体（scavenger receptor）其它有ApoE受体（CM）HDL受体和-VLDL受体等。,-,17,LDL受体：分布于肝细胞、动脉壁平滑肌细胞等细胞膜表面识别结合ApoB100、E的脂蛋白如LDL、VLDL等。合成受体内胆固醇的负反馈调节,各种脂蛋白受体功能,残粒受体： 分布在代谢活跃的心肌、骨骼肌、脂肪等组织细胞。 识别、结合含ApoE的脂蛋白如CM残粒和-VLDL残粒,清道夫受体： 存在于巨噬细胞表面 识别、结合修饰的LDL（氧化型LDL和-VLDL）,-,18,（五）脂代谢有关的酶类与特殊蛋白质,酶：,LPL、肝脂肪酶（HL或HTGL）、LCAT、HMG-CoA还原酶 参与TG分解、FC合成和酯化,-,19,脂质转运蛋白,定义：,血浆中脂蛋白部分含有一种特殊的转运蛋白，能促进血浆各脂蛋白间胆固醇酯、甘油三酯和磷脂的单向或双向转运和交换，这类特殊转运蛋白称脂质转运蛋白（lipid transfer protein,LTP）。,组成：,胆固醇酯转运蛋白（CETP）：可将LCAT催化生成的胆固醇酯由HDL转移至VLDL、IDL和LDL中，在胆固醇的逆向转运中起关键作用,磷脂转运蛋白（PTP）：可促进磷脂由CM、VLDL转移至HDL,甘油三酯转运蛋白（TTP）：在富含TG的VLDL和CM组装和分泌中起主要作用,蛋白质：,-,20,（一）CM的代谢来源：由小肠粘膜细胞合成，经淋巴入血。 代谢过程：,二、血浆脂蛋白代谢,-,21,功能：转运外源性TG。,正常人CM在血浆中代谢迅速，半衰期为5-15分钟，故正常人空腹12-14h后血浆中不含CM。,-,22,（二）VLDL 及LDL的代谢,来源：VLDL主要由肝细胞合成，分泌入血，少量来自小肠；LDL是在血浆中由VLDL转变而来代谢过程：,-,23,功能： VLDL转运内源性TG ；LDL转运胆固醇到肝外组织,-,24,（三）HDL的代谢,来源：主要由肝细胞合成，此外，小肠也可合成少量，还有血浆中CM、VLDL 脂解过程中所释放的磷脂、胆固醇及apo也可产生新生的HDL。代谢过程：,-,25,功能：将胆固醇从肝外组织转运到肝进行代谢（逆向转运）。,-,26,三、脂蛋白代谢紊乱,（一）高脂蛋白血症（多见）,定义：,高脂血症（hyperlipidemia，HLP）是指血浆中胆固醇和（或）甘油三酯浓度异常升高。血浆脂类以血浆脂蛋白形式存在，因此，高脂血症一般指高脂蛋白血症（hyperlipoproteinemia）。,近年来，已逐渐认识到血浆中HDL降低也是一种脂代谢紊乱。,成人空腹1214h血清（浆）TG2.26mmol/L(200mg/dl)，胆固醇6.21mmol/ L (240mg/dl) ，儿童胆固醇4.14mmol/ L (160mg/dl),LDL：与动脉粥样硬化和冠心病呈正相关,HDL：与动脉粥样硬化和冠心病呈负相关,VLDL：与动脉粥样硬化和冠心病呈正相关,-,27,1.按表型分类,主要是基于各种血浆脂蛋白升高的程度不同而进行分型。该分类法不包括病因学，故称表型分类。,分型：,-,28,（罕见）,（罕见）,（常见）,（常见）,（极常见）,（罕见）,CM带明显,脂蛋白明显增高,前及脂蛋白均增高,前及脂蛋白带融合，宽而浓染的“宽带”,前脂蛋白明显增高,CM带明显，前脂蛋白增高,或透明,CM残粒及VLDL残粒（IDL）,-,29,2.按是否继发于全身性疾病分类,继发性高脂血症：,原发性：,继发性者由一些全身性疾病引起血脂异常，如糖尿病、肾病综合征、肾功能衰竭、甲状腺功能减退症、肝胆疾病、系统性红斑狼疮、肥胖症、饮酒等。此外，某些药物如-受体阻断剂、降压药等也可引起血脂异常。,在排除继发性高脂血症后，可诊断为原发性。已知部分原发性高脂血症由先天性基因缺陷所致,-,30,3.高脂血症的基因分型法,表10-5 家族性高脂血症的临床特征,-,31,（二）低脂蛋白血症,一般将血清TC3.3mmol/L，或TG0.45mmol/L，或LDL-C2.1mmol/L者，称为低脂蛋白血症。脂质如TC和TG同时降低或脂蛋白如HDL、LDL和VLDL同时降低多见。,定义：,原因：因某种原因使脂蛋白合成减少，另外分解代谢旺盛也可导致。,分类：原发性和继发性,-,32,第二节 血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定,TC测定TG测定HDL-C测定LDL-C测定,Lp（a）测定ApoAI测定ApoB测定,脂蛋白电泳分析其他测定： 有关的蛋白质、酶和受体测定,血清脂质和脂蛋白检测的分析程序及项目选择,-,33,血脂测定标准化：,血脂分析前变异来源于：生物因素，如年龄、性别、种族等因素的个体差异。生活方式，包括饮食习惯、吸烟、运动及应激等。临床方面包括疾病或药物引起的脂代谢改变。血标本采集与处理方面,准确测定应从分析前的准备开始，包括受试者的准备，标本采集，合格的试剂、校准物的选用，检测方法选择。,方法学上应该采用美国疾病控制中心（CDC）或中华医学会检验分会推荐的操作方法。,-,34,抽血前应有两周时间保持平常的生活习惯，近期内体重稳定，无急性病、外伤、手术等意外情况，24小时内不饮酒，禁食12-14小时，早上空腹、安静状态下采血。,注意事项：（1）检验前，应根据药物的特性，尽可能停止用药数天或数周。（2）妊娠前、后期各项血脂都会增高，产后、终止哺乳3个月后，才能反映其基本血脂水平。（3）血脂水平有季节性变动，对于体检者建议应在每年同一季节检查。（4）结合生理和临床情况，综合、动态分析检验结果。,1.受检者的准备,标本采集与处理,-,35,2.静脉采血,3.抗凝剂,4.标本处理,除非是卧床的患者，一般在采血时取坐位。止血带的使用不可超过1 min ，穿刺成功后应立即松开止血带，然后抽血。,我国多用血清作血脂分析。如果用血浆，多主张用EDTA 2Na 抗凝,标本应尽快送往实验室，室温下放置30 - 45 min 后离心，分离血清。,-,36,-,37,TC、TG均正常,（正常人）,TC,TG正常,（IIa型）,TC,TG,（IIb型）,TC N/,TG,（I型）,TC,TG,（III型/V型）,TC,TG,（ IIb型/III型）,TC N/ ,TG ,（IV型）,TG,CM,VLDL,CM及VLDL,血清（浆）静置试验,将患者空腹12h后采集静脉血分离出血清置4冰箱中过夜，然后观察其分层现象及清澈度。,-,38,-,39,-,40,TC测定TG测定HDL-C测定LDL-C测定,-,41,血清（浆）总胆固醇（TC）测定,化学法,酶法,血清中TC包括CE和FC， 其中CE占70，FC占30。,-,42,（一）化学测定法,（直接法和间接法）,1.胆固醇与醋酐 硫酸试剂产生蓝绿色L B反应： Liberman发现胆固醇在硫酸、醋酐溶液中显色， Burchard用此反应测定胆固醇称为L-B反应。（条件要求严格、试剂腐蚀性强、对FC与CE的显色强度不一致、呈色不稳定 ） Abell法（ALBK法）：公认的参考方法皂化（KOH乙醇溶液水解CE成为FC）、抽提（正己烷或石油醚提取FC）、显色（L-B反应）。2.胆固醇与高铁 硫酸试剂产生稳定的紫红色Zak反应： Zak提出用硫酸、醋酸和Fe3+等与胆固醇作用生成紫红色化合物来测定胆固醇，称为Zak反应。 （比L-B反应的灵敏度高，呈色稳定不需要皂化，反应特异性差）3.胆固醇与邻苯二甲醛 硫酸试剂生成稳定的紫红色,-,43,CEH-COD-PAP法,原理： CEH2O FCFFA FCO2 4-胆甾烯酮H2O2 H2O24-AAP苯酚 醌亚胺H2O,试剂：胆固醇酶测定法的试剂中，除了上述三种酶、酚和4-氨基安替比林外，还有维持pH恒定的缓冲液、胆酸钠、表面活性剂以及稳定剂等。胆酸钠是为了提高胆固醇酯酶的活性，表面活性剂的作用是促进胆固醇从脂蛋白中释放出来,500nm,(二)酶测定法(常规方法）,-,44,评价：,优点：特异性好，精密度和灵敏度都能很好地满足临床实验室的要求，操作简便，试剂无腐蚀性，手工和自动分析皆可，终点法与速率法皆可。,缺点：,某些胆固醇酯酶对胆固醇酯的水解不完全，不能用纯胆固醇结晶以有机溶剂配制的溶液作为TC分析的校准液，而应以准确定值的血清作为标准。,表面活性剂，如吐温-40可以干扰胆固醇酯酶的作用，而聚乙烯醇6000可使结果提高12；,本法具有氧化酶反应途径的共同缺陷，易受到一些还原性物质如尿酸、胆红素、维生素C和谷胱甘肽等的干扰。,-,45,血清总胆固醇合适范围：5.20mmol/L (200mg/dl)，边缘升高：5.235.69mmol/L(201219mg/dl)，升高：5.72mmol/L (220mg/dl)。,参考范围：,-,46,TC除了作为高胆固醇血症的诊断指标之外，不能作为其它任何疾病的诊断指标，对于动脉粥样硬化和冠心病而言，TC是一个明确的危险因子，与冠心病的发病率呈正相关。,临床意义：,高TC血症：原发和继发 （了解）,低TC血症：原发和继发 （了解）,-,47,TC测定TG测定HDL-C测定LDL-C测定,-,48,血清（浆）甘油三酯（TG）测定,化学法,酶法,-,49,基本操作：,（一）化学测定法,1、抽提：用有机溶剂抽提标本中的TG，并去除磷脂等干扰物质2、皂化：用碱（ KOH ）水解（皂化 ）TG生成甘油3、氧化：以过碘酸氧化甘油生成甲醛4、显色：用显色反应对甲醛定量（变色酸、乙酰丙酮）,Van Handel法（参考方法）,氯仿抽提TG、硅酸吸附掉磷脂、KOH皂化、过碘酸氧化、变色酸显紫红色,-,50,(二)酶测定法,1、磷酸甘油氧化酶法（GPO-PAP法）常规方法,原理：,-,51,去除FG干扰可用下列方法：1、外空白法：同时用不含LPL的酶试剂测定FG 作空白。2、内空白法：又称两步法或双试剂法将LPL和4-AAP组成试剂2，其余部分为试剂1。此两步法目前为中华医学会检验分会推荐方法。,特异性和准确性好，主要缺点是测定结果包括血清中的游离甘油（FG）,特点：,-,52,2乳酸脱氢酶法,原理： TG + 3H2O LPL Glycerol + 3RCOOH Glycerol + ATP GK+Mg2+ G-3-P + ADP ADP + 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶 丙酮酸 + ATP丙酮酸+NADH LDH NAD+ + 乳酸,由于反应消耗NADH，故可利用NADH在340nm吸光度降低来测定甘油三脂的浓度。,-,53,评价：,本法结果准确，但灵敏度较低，试剂也不太稳定。由于血清本身存在游离甘油和丙酮酸等干扰物质，所以测定时除了要做试剂空白外，还要做标本空白（外空白）,-,54,3甘油氧化酶法,第一步： FG + O2 甘油氧化酶 甘油醛+ H2O2 H2O2 + EMAE POD 无色物质消除游离甘油的影响，3-5min后进行第二步反应：TG + 3H2O LPL Glycerol + 3RCOOHFG + O2 甘油氧化酶 甘油醛+ H2O2H2O2 +4-AAP+ EMAE POD 有色化合物注：EMAE作用与酚相似，是还原剂，但灵敏度比酚高。,原理：该法分两步完成。,-,55,参考值,血清甘油三酯一般随年龄增加而升高，体重超过标准者往往偏高。 合适范围：1.70mmol/L(150mg/dl)， 升高：1.70mmol/L (150mg/dl)。,-,56,临床意义,原发性高TG血症多有遗传因素，包括家族性高TG血症与家族性型高脂（蛋白）血症等。继发性高TG血症见于糖尿病、糖原累积病、甲状腺机能减退、肾病综合征、妊娠、口服避孕药、酗酒等。 大量前瞻性的研究证实，富含TG的脂蛋白是CHD的独立的危险因子，TG增加表明患者存在代谢综合症，需进行治疗。甘油三酯降低比较少见，甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能减退和肝功能严重损伤时可以见到甘油三酯降低,-,57,TC测定TG测定HDL-C测定LDL-C测定,-,58,HDL-C测定,常以测定HDL-C含量代表HDL水平。,HDL分离（超速离心、沉淀、层析等）,HDL-C测定（化学法、酶法）,-,59,常规方法:,1磷钨酸-镁法,2HDL直接测定法 （匀相法）,参考方法:,超速离心除去VLDL，然后用肝素-Mn沉淀LDL，上清液中的HDL-C用ALBK法测定。,-,60,磷钨酸-镁法,此法曾为中华医学会检验分会的推荐方法，目前基层单位还在应用，虽不能完全自动化，但测定结果尚能满足临床要求。,原理：,-,61,HDL直接测定法 （匀相法）,HDL直接测定法大致分三类，分别是:聚乙二醇/抗体包裹法酶修饰法选择性抑制法，又称掩蔽法，目前国内应用最多。,最近中华医学会检验学会血脂专题委员会推荐匀相法作为临床实验室测定HDL C的常规方法,-,62,成人：男性1.161.42mmol/L(4555mg/dl)女性1.291.55mmol/L(5060mg/dl) 理想范围：1.04mmol/L (40mg/dl), 降低：0.91mmol/L (35mg/dl),【参考范围】,【临床意义】,流行病学与临床研究证明，HDL-C与冠心病发病呈负相关，HDL-C低于0.9 mmol/L 是冠心病危险因素。HDL-C大于1.55mmol/L被认为是冠心病的“负”危险因素。 HDL-C下降还多见于脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬化病人。高TG血症往往伴以低HDL-C，肥胖者的HDL-C也多偏低。吸烟可使HDL-C下降，适量饮酒、长期体力劳动和运动会使HDL-C升高。,-,63,TC测定TG测定HDL-C测定LDL-C测定,-,64,1Friedewald公式法 LDL-CTCHDL-CTG/5（以mg/dl为单位时），或LDL-CTCHDL-CTG/2.2（以mmol/L为单位时）。,2聚乙烯硫酸盐沉淀法 本法并非对LDL-C作直接测定，而是用聚乙烯硫酸（PVS）选择性沉淀血清中LDL，再以血清TC减去上清液（含HDL与VLDL）胆固醇即得LDL-C值。,3直接测定法:两类,目前各类方法测定的LDL-C值都包括IDL和LP(a)的chol在内,LDL-C测定,常以测定LDL-C含量代表LDL水平。,-,65,LDL-C合适范围：3.12mmol/L (120mg/dl)， 边缘升高：3.153.61mmol/L(121139mg/dl) 升高：3.64mmol/L (140mg/dl)。,【参考值】,【临床意义】,LDL-C增高是动脉粥样硬化发生发展的主要脂类危险因素。由于TC水平同时也受HDL-C水平的影响，所以最好以LDL-C代替TC作为冠心病危险因素指标。美国国家胆固醇教育计划成人治疗专业组规定以LDL-C水平作高脂蛋白血症的治疗决策及其需要达到的治疗目标。,-,66,Lp（a）测定ApoAI测定ApoB测定,-,67,脂蛋白(a)测定,脂蛋白（a）是由特异的载脂蛋白apo(a)与LDL的apoB-100以二硫键相连而成,因而脂质组成与LDL相似。apo(a)决定 Lp(a)的特异性,是Lp(a)的特异性抗原, apo(a)结构与纤溶酶原(PNG)极为相似,二者有交叉反应。apo(a)可以竞争性结合PNG受体或纤维蛋白等大分子，LP（a）携带的胆固醇结合至血管损伤部位，促进动脉粥样硬化形成，也阻碍血管内凝血块的溶解，它是动脉粥样硬化的一项独立危险因子。,-,68,Lp(a)测定有两类方法,一是以免疫化学原理测定其所含Apo(a)，结果以Lp(a)质量表示，也有以Lp(a)颗粒数mmol/L表示的。 另一类方法测定其所含的胆固醇，结果以 Lp(a)-C表示。目前大都用免疫学方法测定。,-,69,正常人群的Lp(a)水平呈明显的正偏态分布，大多在200mg/L以下，平均数在120180 mg/L，中位数约100mg/L。Lp(a)水平高于医学决定水平（300mg/L），冠心病危险性明显增高。,【参考值】,【临床意义】,血清Lp(a)水平是动脉粥样硬化性疾病的独立危险因素,与动脉粥样硬化成正相关。,-,70,Lp（a）测定ApoAI测定ApoB测定,-,71,血清载脂蛋白测定,免疫化学法：,单向免疫扩散（RID）电免疫分析（如火箭电泳法）放射免疫分析（RIA）酶联免疫吸附分析（ELISA）等,早期,目前：,目前比较适合于临床实验室的是免疫浊度法，包括免疫散射比浊法（INA）和免疫透射比浊法（ITA）。,-,72,免疫透射比浊法（ITA）,Apo的特异抗体与血清中相应的抗原结合形成抗原抗体免疫复合物，并形成微细颗粒，混悬于溶液介质中，光线通过这种浑浊介质溶液时被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比。在抗体量一定的条件下，抗原越多，抗原抗体复合物越多，溶液越浑浊，吸收光越多，以此对抗原进行定量，这种通过测定光吸收量的方法称为透射比浊法。该法是目前使用最为广泛的方法，快速准确，可在自动生化分析仪上作批量检测。,-,73,免疫散射比浊法（INA）,当光线通过含抗原体复合物的浑浊介质溶液的混悬颗粒时，出现光散射作用，散射光强度与溶液中混悬颗粒的量成正比，这种测定光散射强度的方法称为免疫散射比浊法。该法的进行，需要有具备测定散射光的仪器如散射比浊仪等。,-,74,【参考值】：,Apo AI：1.001.50g/L，Apo B：0.801.00g/L。,【临床意义】,ApoAI是HDL的主要结构蛋白， ApoB是LDL的主要结构蛋白，因此，ApoAI和ApoB可直接反映HDL和LDL的含量。在某些病理情况下，ApoAI与HDL和ApoB与LDL并非成正相关，因此，同时测定载脂蛋白及脂蛋白HDL和LDL对病理发生状态的分析很有帮助。冠心病、肾病综合征和糖尿病等都有ApoAI下降和ApoB升高。临床上常将ApoAI和ApoB比值作为冠心病的危险指标。,-,75,脂蛋白电泳分析其他测定： 有关的蛋白质、酶和受体测定,-,76,血清脂蛋白电泳,脂蛋白电泳分析可分为预染法和电泳后染色法两大类。,预染法的操作比较简单，分离效果直观。其操作过程是先将待测血清和苏丹黑染料按一定比例混合进行预染处理，离心后取上清液进行电泳分析。,电泳后染色法为用电泳方法先将血浆脂蛋白各成份分开，再用苏丹黑或油红O进行染色。,临床上比较常用的是预染法电泳。,测定血清（浆）脂蛋白的组成及各组分的相对含量，对高脂蛋白血症的分型有重要意义,-,77,前,血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳图谱,乳糜微粒,按其移动的快慢，可将脂蛋白依次分为：-脂蛋白、 前-脂蛋白、-脂蛋白，乳糜微粒在原点不动。,-,78,血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳：-脂蛋白：0.30-0.40，前-脂蛋白：0.13-0.25，-脂蛋白：0.50-0.60，乳糜微粒：阴性。,【参考值】,-,79,-,80,1.试述载脂蛋白的生理功能,脂蛋白受体,胆固醇酯转运蛋白（CETP）,胆固醇的逆转运,高脂蛋白血症,2.简述高脂蛋白血症的分型及各型的主要生化特征（增高的脂蛋白及脂质、血清4度过夜外观、脂蛋白电泳）,血清静置试验,3.用反应式写出酶法测定TC的原理,4.写出LDL-C测定用的Friedewald公式,名词解释,简答题,