细胞生物学实验课件PowerPointPres.ppt

细胞生物学实验,主讲人:康美玲 单 位:枣庄学院生命科学系,实验一 血涂片的制备及细胞大小的测量,一、实验目的1.掌握血涂片的制备方法；2.认识红细胞及各种白细胞的典型形态；3.掌握显微测微尺的使用方法。,二、实验原理,涂片技术是制备血液样品最常用的技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本，染色后可对血液中各种细胞形态进行形态观察、细胞计数、细胞大小测量等工作。,三、实验用品,1.器材:医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗净的载玻片 、双凹片（推片） 。2.试剂:Wrights染液：Wrights色素粉末0.1g，溶于60 ml甲醇。,四、方法与步骤,一.血涂片的制备与血细胞的观察二.显微测微尺的使用,采血前用70酒精棉球消毒人的指腹,采血,由于第一滴血中含单核白细胞较多，因此弃去第一滴血。,推片：挤出第二滴血置于载玻片的右侧,再取另一张边缘光滑的双凹片，斜置于血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状。,3045,两玻片的角度以3045为宜，轻轻将双凹片向前匀速推进，即涂成血液薄膜。,染色,待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴Wrights染液盖满血膜为止，染色3 min。然后滴加等量蒸馏水，使其与染液均匀混合，静置5 min。用蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干，镜检。,结果显示,淋巴细胞,单核细胞,嗜中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞,显微测微尺的使用,显微测微尺是用来测量在显微镜下所观察到的物体的长度、面积的工具，包括镜台测微尺、目镜测微尺两部分。在使用的过程中，镜台测微尺起标定作用，利用它可以确定目镜测微尺旋钮上每小格代表的实际长度。目镜测微尺标定完成后，即可用于细胞样品的测量。,每个大格又可分为10个小格，每小格的实际长度为0.01mm,总长0.1mm,镜台测微尺,总长1mm,共分为10格,目镜测微尺,可以通过旋转旋钮移动目镜测微尺中交叉线的位置,使用方法,1.取下目镜,将目镜测微尺的刻度面向下放入目镜中,旋上透镜；2.将镜台测微尺盖片面朝上放在载物台上,用低倍镜观察,调节焦距看清镜台测微尺的刻度；,3.移动镜台测微尺,同时转动目镜,使目镜测微尺与镜台测微尺平行靠近,并将两尺的“0”点刻度线或某刻度线对齐.然后从左向右查看两尺刻度线另一重合处,记录重合线间目镜测微尺与镜台测微尺的格数.按下式计算目镜测微尺每格等于多少微米。,目镜测微尺的标定,naX= M,X:目镜测微尺每格的实际长度a:镜台测微尺每格的实际长度n:镜台测微尺的刻度数。M:目镜测微尺的刻度数。,4.移去镜台测微尺，换血涂片，目镜测微尺测量细胞所占小格数X目镜测微尺每小格代表的实际长度=被测细胞的实际长度。,实验作业,Company Logo,实验二 细 胞 凝 集 反 应,一、实验目的： 1. 学习制备土豆凝集素 2. 掌握细胞凝集反应的实验方法及细胞凝聚的原理。 3. 观察凝集的现象,二、 实验原理,细胞质膜外表面的一层黏性多糖物质构成的细胞全委会被在细胞间的联系和识别、细胞的生长分化、免疫反应及肿瘤发生等过程中发挥着重要作用。 动物细胞表面的糖蛋白、糖脂中的糖链伸向膜表面，它们是细胞识别、细胞免疫及细胞接触抑制现象的必要组分。,凝集素是一类含糖的(少数例外)并能与糖专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果。凝集素与糖分子结合有一定的专一性和结合价，并与细胞膜上受体的分布有关。,Company Logo,三、实验仪器,显微镜、粗天平、载玻片、滴 管、 离心管、离心机等.,五、实验内容与实施过程,1.凝集素粗提液制备（50分钟）： 用天平称取去皮的土豆块茎2g+10mlPBS缓冲液，浸泡2h粗提液中含有可溶性土豆凝集素。2.鸡红细胞悬液制备（35分钟）： 以无菌方法抽取鸡血注射器中抽取3.8%柠檬酸钠1ml抽取鸡静脉血液2ml，用生理盐水洗5次，每次2000r/min，离心5min，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成2%红细胞液。,实验内容与实施过程,3.细胞凝集反应现象的观察与讨论（50分钟）：用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置20min后于低倍显微镜下观察血球凝集现象。 本实验过程很简单，只需要将植物凝集素与红细胞混合后用低倍显微镜观察现象即可。具体如下：,实验内容与实施过程,4、实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。共150分钟。,实验作业,实验总结,1.为什么对照组有PBS液作对照呢？ 没什么巧，因为凝集素中本身含PBS缓冲液，当含本身凝集素是不含PBS的，只是因为本实验中凝集素的提取时用到了PBS.,实验总结,2.那么红细胞悬液是怎么制备的呢？ 其实也不难，无菌抽取动物静脉血液，当然血液抽出来后肯定要先加抗凝剂了，然后再加生理盐水。那么怎么从血液中将红细胞分离出来呢？想想，血液中有血清、红细胞、白细胞和血小板，按道理来讲红细胞应该最重吧(有待查证)，用离心机在2000r/min下离心5min，去掉上清液，得到的应该就是红细胞了，再加适量生理盐水洗涤几次后，加一定量是(按压积红细胞体积算)生理盐水即可配成相应浓度的红细胞悬液了。,备注,凝集素是一类含糖、并能与糖专一结合的蛋白质,被认为与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控有关。,实验三 细胞膜的渗透性,一、实验目的：了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。,二、 实验原理,细胞膜为一种半透膜，对物质的通透具有选择性。当红细胞放入低渗溶液中时，细胞吸水膨胀而发生溶血。 当红细胞放入含不同溶质的等渗溶液中时，由于细胞膜对不同溶质的透性不同，细胞发生溶血的时间也会不同，故发生溶血现象时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。,三、实验仪器,离心机移液枪,试管架试管,五、实验内容与实施过程,1.鸡血细胞悬液的制备：一份鸡血+10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的鸡血。2.低渗溶液：一支试管中，加入10ml蒸馏水+1ml稀释的鸡血，观察溶液颜色的变化？,实验内容与实施过程,3.鸡红细胞的渗透性观察：在10种等渗溶液中观察细胞溶血现象及时间。,实验内容与实施过程,4、实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。,实验作业,实验作业,实验总结,溶血时间及现象的观察比较困难，可采用离心辅助的方法来判别鸡血在哪些等渗液中最易溶血，哪些较慢，做一些定性的分析。经过离心之后，若上清液无色，证明在这个时间段血细胞没发生溶血，若上清液略红，证明有溶血发生。当然这个方法不很精确，但却快速、便于观察。,实验四 线粒体和液泡系的 超活染色与观察,一、实验目的：1.观察动、植物活细胞内线粒体和液泡系的形态、数量及分布；2.掌握细胞超活染色技术及原理；3.学习一些细胞器的超活染色技术。,二、 实验原理,活体染色：应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些细胞结构而又很少影响细胞生命活动的染色方法。 中性红：中性红对高尔基体、液泡系的染色具有专一性。只将活细胞中的液泡系当成红色，细胞核与细胞质完全不着色(这可能与液泡系中某些蛋白质有关。,詹纳斯绿B：詹纳斯绿B能专一的对线粒体进行活体染色。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，即有色状态，呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态,三、实验仪器,显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。,五、实验内容与实施过程,1.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察清洁载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上 滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液 用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞 刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中 染色10-l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) 盖上盖玻片,显微镜下观察,实验内容与实施过程,2. 植物细胞液泡系的超活染色与观察 取小麦种子发芽的根尖 用刀片纵切根尖 放入中性红染液滴中，染色510min。 吸去染液，滴一滴Ringer液 盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察),实验内容与实施过程,3.实验结果 在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。,实验内容与实施过程,4、实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。,实验作业,实验总结,人口腔上皮细胞的线粒体的超活染色与观察效果很好，但是洋葱表皮细胞和小麦根尖细胞的染色效果不是很理想。,实验五 叶绿体的分离与荧光观察,一、实验目的： 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法； 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。,二、 实验原理,组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。,三、实验仪器,普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。,烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。,五、实验内容与实施过程,（一）叶绿体的分离与观察 1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3-5min。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。 5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分细胞核)。,实验内容与实施过程,6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。在普通光镜下观察。在荧光显微镜下观察。取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙荧光染料，在荧光显微镜下观察。,实验内容与实施过程,（二）实验结果：普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。在选用B（blue）激发滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。加入丫啶橙后，叶绿体可发出橘红色荧光，其中混有的细胞核则发绿色荧光。,实验内容与实施过程,(三)实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。,实验作业,实验总结,实验结果非常理想，提醒学生们在使用荧光显微镜时应注意保护眼睛，避免紫外线的伤害。,实验六 植物原生质体的 分离与培养,一、实验目的： 原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的条件下，分离的原生质体能够再生细胞壁，进行细胞分裂，并再生完整植株。通过实验，掌握原生质体分离和培养的基本方法，并对培养结果进行观察和分析。,二、 实验原理,植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁而使原生质体释放出来。,原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。,三、实验仪器,台式离心机、 高压灭菌锅、倒置显微镜、超净工作台,三角瓶、离心管、烧杯、200目不锈钢滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2m滤膜、滤器、培养瓶（注：以上用品要进行高压灭菌）,五、实验内容与实施过程,1、实验原理的讲解；（15分钟）2、液体培养基的配制；（实验前由教师完成）3、酶液的制备：（20分钟）1纤维素酶、1果胶酶、0.6mol/L甘露醇 、0.1%MES、0.05mol/LCaCl22H2O、 pH6.87.0,实验内容与实施过程,4、植物原生质体的分离和培养（ 课内完成，180min）取充分展开的嫩叶，用自来水冲洗干净；将叶片在0.1%升汞溶液中浸泡灭菌10min，然后用无菌蒸馏水漂洗5次；用镊子撕去叶的下表皮，然后将叶放有酶液的培养皿或带盖三角瓶，每10ml酶液放2g叶片；,在2528黑暗条件下，酶解23h,用200目网过滤除去未完全消化的残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入3 4ml 0.2mol/LCaCl22H2O洗液，用注射器向离心管底部缓缓注入20蔗糖溶液6ml，在1000rpm条件下离心510分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20的蔗糖与0.2mol/LCaCl22H2O之间，破碎的细胞残渣沉入管底。,实验内容与实施过程,用200l移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液)，放入另一干净的离心管中加4ml 0.2mol/LCaCl22H2O悬浮，1000rpm离心25分钟，弃上清,实验内容与实施过程,将收集的原生质体悬浮在适量的DPD培养基中，用血球计数板调整原生质体密度为5104/ml（请参考细胞计数）之间。用带皮头的移液管将原生质体悬液分装在培养皿中，每皿放5ml。用石蜡膜带封口。置26左右条件下进行暗培养。,实验内容与实施过程,5、培养结果的观察（活力检查，细胞壁再生的观察，细胞分裂的观察）:在课外由教师指导学生进行.,实验内容与实施过程,实验内容与实施过程,6、实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。共225分钟。,实验的意义,植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。,实验作业,实验总结,将原生质体培养分化过程进行显微摄影，并分析结果。以植物根、茎、叶、叶柄作为原生质体的分离材料,经过分离收集在一定条件下才能培养获得完整的原生质体,原生质体培养基的渗透压应与酶液的渗透压相等.,实验七 动物血细胞的 电融合技术,一、实验目的： 本实验使学生在了解电融合原理的基础上，学会掌握各种细胞悬液的制备及电融合过程的操作。,二、 实验原理,制备的游离细胞或原生质体，置于电融合室中，在高频交流电场的作用下，细胞被极化，成为偶极子，造成细胞之间相互连接，如果施加的高频交流电压(即正弦波的p-p值)过高或作用时间过长，则细胞连接成串珠状，应适当控制以上条件，尽量使两细胞处于点接触状态，然后施加方波脉冲予以刺激，由于电脉冲的瞬间作用，可击破两细胞接触点部位的质膜，此时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，使两细胞融合逐步完全。,动物的游离细胞在电刺激下可进行细胞融合，且具有融合率高、无毒性、操作简便及融合后的细胞继续培养成活率高等特点，是细胞工程手段的又一进展。,三、实验仪器,CRY-3型细胞融合仪、细胞融合池、倒置显微镜,刻度离心管、移液枪、血细胞计数板,五、实验内容与实施过程,（一）动物血细胞的制备（二）细胞电融合（三）实验结果 （四）实验小结,实验结果,在倒置显微镜下可观察到由同种细胞融合形成的细胞，称为同核体 (homokaryons). 利用不同亲本的不同细胞彼此融合所形成的细胞，称为异核体 (heterokaryons)，还可观察到3个以上细胞融合在一起的合胞体。,返回,实验内容与实施过程,（四） 实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。共180分钟。,返回,实验作业,实验总结,1.影响细胞电融合因素： 用于供原生质体或动物细胞悬浮的介质，必须满足两个条件：一是为了保持细胞的生物活性，使融合后的细胞能继续存活，并通过培养能继续分裂和分化，其介质要求与细胞本身具有等渗性；,实验总结,二是为了保证融合之前所施加的各项电参数充分发挥作用，其介质应具有高纯度的非离子溶液，如果在溶液中存在Na+、 K+、Ca2+等金属离子或Cl离子，将使介质的导电性增加，当施加脉冲波刺激时，据报导，其总能量Q将通过离子的传导作用损失80以上，而直接通过细胞，用于击穿膜接触点使其细胞融合的能量仅占1020%，当有离子存在并使电脉冲能量高度损失的情况下，将不能保证细胞进行融合。,实验总结,在介质中有金属离子存在，当施加高频正弦波电场时，不能将细胞极化成偶极子，从而不能使细胞间相互接触和连接，更谈不上细胞间相互融合。为了解决以上存在的问题，一是采用高纯度的蒸馏水(三蒸水或四蒸水)来配制介质，二是选用适当的非电介质溶质如甘露醇、山梨醉或蔗糖等来配制供细胞悬浮的等渗溶液，另外，在清洗电融合室时，以要以高纯度的蒸馏水用毛笔擦净。,备注,电融合发展于20世纪80年代，是使细胞在电场中成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，膜的脂类分子发生重排，由于表面张力作用，两细胞发生融合。,实验八 利用PEG为媒介 物进行动物血细胞融合,一、实验目的： 掌握利用聚乙二醇为介导物对各类细胞的融合方法,二、 实验原理,制备的游离细胞或原生质体，置于电融合室中，在高频交流电场的作用下，细胞被极化，成为偶极子，造成细胞之间相互连接，如果施加的高频交流电压(即正弦波的p-p值)过高或作用时间过长，则细胞连接成串珠状，应适当控制以上条件，尽量使两细胞处于点接触状态，然后施加方波脉冲予以刺激，由于电脉冲的瞬间作用，可击破两细胞接触点部位的质膜，此时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，使两细胞融合逐步完全。,动物的游离细胞在电刺激下可进行细胞融合，且具有融合率高、无毒性、操作简便及融合后的细胞继续培养成活率高等特点，是细胞工程手段的又一进展。,三、实验仪器,CRY-3型细胞融合仪、细胞融合池、倒置显微镜,刻度离心管、移液枪、血细胞计数板,五、实验内容与实施过程,（一）动物血细胞的制备（二）细胞电融合（三）实验结果 （四）实验小结,实验结果,在倒置显微镜下可观察到由同种细胞融合形成的细胞，称为同核体 (homokaryons). 利用不同亲本的不同细胞彼此融合所形成的细胞，称为异核体 (heterokaryons)，还可观察到3个以上细胞融合在一起的合胞体。,返回,实验内容与实施过程,（四） 实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。共180分钟。,返回,实验作业,实验总结,1.影响细胞电融合因素： 用于供原生质体或动物细胞悬浮的介质，必须满足两个条件：一是为了保持细胞的生物活性，使融合后的细胞能继续存活，并通过培养能继续分裂和分化，其介质要求与细胞本身具有等渗性；,实验总结,二是为了保证融合之前所施加的各项电参数充分发挥作用，其介质应具有高纯度的非离子溶液，如果在溶液中存在Na+、 K+、Ca2+等金属离子或Cl离子，将使介质的导电性增加，当施加脉冲波刺激时，据报导，其总能量Q将通过离子的传导作用损失80以上，而直接通过细胞，用于击穿膜接触点使其细胞融合的能量仅占1020%，当有离子存在并使电脉冲能量高度损失的情况下，将不能保证细胞进行融合。,实验总结,在介质中有金属离子存在，当施加高频正弦波电场时，不能将细胞极化成偶极子，从而不能使细胞间相互接触和连接，更谈不上细胞间相互融合。为了解决以上存在的问题，一是采用高纯度的蒸馏水(三蒸水或四蒸水)来配制介质，二是选用适当的非电介质溶质如甘露醇、山梨醉或蔗糖等来配制供细胞悬浮的等渗溶液，另外，在清洗电融合室时，以要以高纯度的蒸馏水用毛笔擦净。,备注,电融合发展于20世纪80年代，是使细胞在电场中成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，膜的脂类分子发生重排，由于表面张力作用，两细胞发生融合。,