第15章聚合酶链式反应ppt课件.ppt

第十五章聚合酶链式反应,聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction ,PCR) 80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个ephendof管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。,PCR的特点,PCR技术简史,2、PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件。3、 PCR的改进与完善, Mullis 最初使用大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。缺点是：Klenow酶不耐高温， 90会变性失活，每次循环都要重新加；引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，但该酶不耐高温。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。PCR技术得以广泛应用。,1983，Mullis建立了PCR反应体系，1987获专利1987，PE-Cetus公司推出PCR自动化热循环仪1988，PE-Cetus公司获得基因工程方法生产的耐 热DNA聚合酶1989，PE-Cetus公司获得PCR方法、天然Taq酶 及重组Taq酶三项专利,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,1988年，在PCR系统引入热稳定的Taq DNA聚合酶，多次循环后Taq DNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需DNA片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。,第一节 聚合酶链式反应扩增原理,PCR是Kary Mullis于1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程，即利用DNA 聚合酶（如Taq DNA聚合酶）等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。 该系统能在体外将特异DNA片段一短时间内迅速扩增106以上。PCR是由引物、聚合酶、底物等组成。该反应全过程分三步：变性、退火和延伸。 类似于DNA的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。,模板DNA变性： 模板DNA经93左右加热一定时间后，双链DNA模板解离成为单链。 模板DNA与引物的退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。由于加入的引物比模板DNA的分子数远远过量，故引物与模板DNA形成复合物的机率远高于DNA分子自身的复性。 引物的延伸： DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的单链。,PCR 循环 第一步 加热变性,PCR 循环- 第二步 引物与靶序列退火,PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸,第1个 PCR 循环完成后 得到两个拷贝的靶序列,30次循环后靶序列扩增的数量,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,PCR的基本原理,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,通常进行聚合酶链式反应，主要考虑反映体系 、反映参数和 DNA变性时间与终变时间三个方面内容 。,（一）反应体系 聚合酶链式反映体系的总体积依试验要求而定 。例如，在50ul聚合酶链式反应（PCR）体系中，加入下列试剂：20pmol上游引物和 20pmol下游引物 ，20mmol/L Tris-Hcl(pH8.3, 20 )、1.5mmol/L MgCl2 、25mmol/L KCl、 0.05% Tween20 、100ug/ml 明胶或无核酸酶的牛血清蛋白、50umol/L dNTP、 2U Taq DNA 聚合酶、 100-200ngDNA模板，将试剂混匀。,（二）反应参数 聚合酶链式反应（PCR）参数包括循环中三阶段的温度及持续时间控制，以及循环的次数，这在一定程度上影响着聚合酶链式反应的成功与否 。通常PCR 反应所采取的反应参数为： 变性温度 95 60s 退火温度 3865 60s 延伸温度 72 12s 循环次数 3035次 复性温度决定 与所用引物的长短与碱基组成，一般需要通过实验来确定。,（三）DNA变性时间与终延伸时间 为了使模板DNA双链充分打开 ，开始时模板DNA变性要适当延长，一般设预变性（predenature)94 35min。一般在扩 增完成后，PCR产物中可能含有长短不一的分子，都需要一步长时间的延伸反应，称为终延伸（post extention），时间要保持在10 min左右，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。反应终止后，可以放到4 中保存，以备电泳检测。,一、反应系统,1Taq DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5 130min，95 40min，97 5min。现在人们又发现许多DNA聚合酶, 这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。 Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74下，30 min， 掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。 在100l PCR反应中，1.5-2 U的Taq DNA聚合酶就足 以进行30轮循环。用的酶量可根据DNA、引物及其它因 素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性 增加，过少则使产量降低。,在细胞内参与DNA复制的因子有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、RNA引物、核苷酸底物、无机离子，解旋酶等，并且反应系统要调节到适宜PH值。 双链DNA变性的温度为94，在PCR问世初期，在每一循环结束时补充新酶，1976年Chien分离出热稳定聚合酶，1986年Erich分离纯化出适于PCR的热稳定性Taq聚合酶，为PCR成为实用方法奠定了基础，现已可用这因重组法生产Taq聚合酶。 Taq DNA聚合酶的最适温度为7580，合成速率约为150个核苷酸/s每个酶分子，即使在70，延伸速率亦可达60个核苷酸以上。普通PCR一般选择72作为延伸温度。,Taq聚合酶在扩增过程中可引起错配，错误掺入核苷酸的比率为1/7500。当采用低浓度的dNTP(各20umol/L)、1.5mmol/L Mg2+及复性温度高于55时，可提高酶的专一性，降低合成的错配率。也可以使用具有35外切核酸的活性的DNA聚合酶参与反应，降低错配率。但是，35外切核酸酶会破坏引物和单链模板，在使用时，应将有35外切核酸酶活性的和无35外切核酸酶活性的酶联用，这样可使错配率降低3倍(2.510-5降低到8.510-6)。,Taq聚合酶具有类似于末端脱氧核苷酸转移酶（Tdt）的活性，可在新生成的双链DNA产物的3端加上一个碱基，尤其易加dATP。因此，克隆PCR产物到载体上时，可采取两种方法：一是直接将构建的dT载体与PCR产物连接；二是先用Klenow片段将PCR产物的3端的A去掉变为平端，与平端载体连接。 Taq聚合酶Taq具有反转录活性，在2-3mmol/L Mg2+浓度下，68时出现类似反转录酶的活性，利用这一活性，可直接用于反转录PCR，尤其适合短片段的扩增。,以往Taq聚合酶进行PCR扩增时，一般只能扩增小于400bP的DNA片段。经过对PCR操作、此酶的结构和功能的改进，已能扩增20kb以上的DNA分子。 通常100ulPCR反应液中含1-2.5ul Taq聚合酶宜，最佳酶浓度在0.55u范围内确定，另外值得注意的是，尽管Taq聚合酶热稳定性较好，但保存时，温度须20。,2模板,PCR反应的模板可以是单链分子、 双链分子、线状分子或环状分子，可以是DNA，也可以是RNA。(线状分子比环状扩增的效果稍好)。当用RNA作模板时首先要先进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。模板来源较广泛，可以从培养的细胞、细菌、病毒和组织中等提取，也可从收集的病理样品和考古标本等获得。 模板的数量和纯度均会影响PCR结果：一般反应中的模板数量为102 -105个拷贝。过多可能会增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。,3引物,引物可以决定PCR扩增产物的特异性与长度。PCR有两种引物，即5端引物与3端引物，是一种寡核苷酸片段，分别与模板5端序列和3端序列互补。 引物设计的一般原则： (1)引物长度：引物不宜太短或太长，一般以16-36bP为宜，引物太短会影响PCR的特异性，引物过长会增加成本和引物的Tm值，Tm值如果超过Taq DNA聚合酶的最适延伸温度，也会明显影响产物的特异性。 (2)G+C含量：引物中G+C含量一般4060为宜。,(3)碱基分布：4种碱基应随机分布，嘌呤或嘧啶不要有3个以上连续排列。尤其是在引物3端，否则会形成引物与核酸G(或C)富集区之间的错误互补，影响PCR的特异性。 (4)引物自身不含互补序列。 (5)两个引物之间的互补或同源碱基应4个。 (6)引物与非特异性靶区之间的同源性要70或者连续互补同源碱基8。 (7)引物3端不能错配。3端最好是G或C，切忌A。 (8)引物5可以修饰，包括增加酶切位点、用生物素、荧光物质、地高辛等标记，以及引入突变位点、启动于序列和蛋自质结合DNA序列等。 一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。,4底物 dNTP为PCR合成DNA的底物，各种dNTP浓度相同，一般浓度为20200umolL。,5缓冲液,根据经验，一个50100ul的标准反应系统，应包括20umol/LTris-Hcl缓冲液(PH7.5)、100mmol/LKCI、1mmol/L DTT、0.1mmol/LEDTA、0.5Tween 20和1.5mmol/LMgCl2。TrisHCl缓冲液可稳定pH值，Kcl有利于引物退火，而DTT与Tween 20，则可以保护Taq聚合酶的催化活性。 在PCR反应系统中应加入Mg2+，因为Taq聚合酶活性需要Mg2+，但该离子浓度变化亦不能过低或过高，过低时酶活性降低，而过高会催化非特异性扩增，且酶活性还会受到抑制。此外， Mg2+的浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的生成等过程。,二、反应过程及条件,1变性 PCR扩增循环变性的温度和时间分别为95、30s，或97、15s。提高变性温度可以使变性时间缩短，但温度过高或时间过长会破坏Taq聚合酶及dNTP。一般选择温度为94或95，时间为3060s。,2复性,变性结束后，DNA快速冷却，以便模板与引物转到复性(即退火)步骤。复性温度过高，融合率低，甚至为零。温度太低，则会增加非特异性结合。复件温度可根据引物长度及其GC含量来确定，引物长度在1525bp之间，Tm(解链温度)值可以按公式：4(GC)2(AT)来计算，引物过长，Tm值会偏高。实际操作中，复性温度可以比Tm值低68为宜。,3延伸,Taq聚合酶的最适温度在7075之间。延伸步骤的温度般选择72左右，这时Taq聚合酶的延伸速度为35100个核苷酸/s。延伸时间的选择可参考下表。在扩增的产物中若存在大量的二级结构时，应加长延伸时间。,4循环次数,循环次数主要取决于初始模板或靶分子的浓度，但循环次数不可以无限地增加，因循环次数过多会导致非特异性产物及增加碱基错配率。,经过若干次循环，酶的活性、dNTP与引物的浓度会逐渐降低，这些因素都会使PCR产物逐渐停止指数增长状态，进而转变到线性或静止增长状态，后一种状态称为平台期。,5扩增产物的分析与克隆,将PCR产物直接(或酶切后)进行琼脂糖凝胶电泳检测，判断扩增片段的有无及分子量大小，还可采用特异性探针或序列测定等方法分析扩增片段。,在PCR过程中：首先要杜绝结构相近的异源DNA污染；其次在操作上须注意：所有器皿应绝对干静、灭菌处理，且与任何DNA污染；操作时应配戴一次性手套，各种试剂应在专用的实验室(或者超净工作台)配制；所有试剂应分装；第三，由于Taq聚合酶缺乏35外切酶活性，可采取以下方法克服：4种dNTP的浓度应等当量，且适宜；选择确当的循环次数；复性温度勿过低等。,对于在PCR反应中出现非预期的DNA条带，首先应考虑PCR系统是否正常，其次，问题可能出在模板和引物方面：模板纯度低；引物不适或降解；调整反应温度和时间；选择适当的Mg2+浓度。 对于PCR产物的克隆，如果是使用无35外切酶活性的Taq聚合酶时，扩增DNA片段的3端均带有一个A，这种DNA片段可采用TA克隆法进行。如果是使用有35外切酶活性的Taq聚合酶时，扩增DNA片段3末端的A可能被切去，可改用平端法克隆，目前，PCR产物克隆时，多用黏性末端克隆法，即在PCR引物中附加内切酶位点，使得PCR扩增产物两端均带有限制酶朗切位点，并且两个引物可携带不同的酶切位点，以利定向克隆。,第二节 PCR类型,主要有普通PCR、原位PCR、反转录PCR、反向PCR、不对称PCR 、巢式PCR和彩色PCR等。一、普通PCR 普通PCR是使用从组织或细胞中分离出来的离体模板DNA进行扩增的。,二、原位PCR,原位PCR是使用细胞或组织的DNA作模板进行扩增的，以确定其生存细胞的类型，或在细胞中的位置，或生存细胞在组织中的百分比等。 1原理 经固定液处理后细胞具有一定的通透性，PCR试剂可进入，可利用标记引物在原位进行PCR扩增。 2操作 三个步骤：切片处理，将制成的细胞切片固定、烤片后，浸入Tween-20及蛋内酶K溶液，采用多种标记系统标记；原位扩增，将切片置玻片上，淌加PCR反应缓冲液、引物、dNTP和Taq聚合酶，随之加盖玻片，并于四周封指甲油，进行PCR扩增。末了根据不同标记物，加入相应底物溶液显色。,端粒荧光原位杂交,三、反转录PCR,扩增真核生物基因时，须从mRNA开始，经反转录成cDNA后，再进行PCR扩增，这一过程称为反转录PCR（RT-PCR）。其间要用反转录酶，最早反转录酶发现于肿瘤病毒中，后来在所有肿瘤病毒中都发现含有此酶。现在常用的反转录酶有AMV禽源和MMlv鼠源两种反转录酶，也有人直接用Taq酶进行反转录。,四、反向PCR,反向PCR可以对一段已知序列两端的未知序列进行扩增分析，操作过程是：用内切酶进行酶切；在连接酶的作用下进行DNA环化；选已知序列两末端的适当序列合成引物，进行扩增。,五、不对称PCR,原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等.其基本方法为固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶.蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K.PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置.杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交.显微镜观察结果。,测定DNA序列是分子生物学的必经步骤，其中的一个重要环节是生成单链DNA模板。利用不对称PCR可以地达此目的，操作要点是两种引物不同的浓度，一般50:1100:1，低浓度的引物通常用0.51pmol/L。在前1015个循环中主要产生双链DNA，此后，一个引物耗尽，只产生另一引物形成的单链，选择合适的循环次数，获得所需数目的单链后，即可应用原引物或第3条内部引物对这种单链DNA进行测序或制备探针。,六、巢式PCR,一对引物一次只能扩增极微量的目的DNA片段，难于满是实验需要，可用多对引物介导，进行两次或多次扩增DNA片段，则能获得良好的结果，这种操作程序称巢式。 巢式PCR的优点在于它扩增的是一个基因内的不同区段，内部引物的模板几乎都是外部引物扩增出的长片段产物，是在长片段内再扩增出所带要的区段，因此基本上没有非特异性片段的产物。在一个反应管内，一次实验就可可扩增出不同长度的片段，并最终得到目的DNA片段，这是常规方法无法比拟的。,七、彩色PCR,将引物5端用荧光物质标记后进行PCR，这种方法称为彩色PCR。通过彩色PCR合成的DNA只有使光标记物，该物质在特定条件下会产生有色反应。引物可用不同色彩的放光染料进行标记，用不向荧光染料标记的引物进行PCR扩增，合成的DNA产物就带有相应的荧光染料，经电泳或离心后，置电泳凝胶或沉淀物于PE荧光计的特定波长下激发后，不同染料将产生不向波长的发射光谱，用肉眼即可观察到彩色条带或沉淀物。另外彩色PCR为核酸测序自动化创造了条件。如果将四种核计酸分别用不同荧光素标记后，就能用自动测序仪对DNA矿列进行全自动分析。,PCR实验中常见问题对策,一.出现假阴性；二.出现假阳性； 所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。三.出现非特异性扩增带；四.出现片状拖带或涂抹带。,一.PCR出现假阴性原因： 1模板因素： 2酶失活： 3引物： 4Mg2+浓度： 5反应体积的改变： 6物理原因： 7靶序列变异：,模板因素：（1）模板中含有杂蛋白；（2）模板中含有Taq酶抑制剂；（3）模板中蛋白质残留， 特别是染色体中的组蛋白残留；（4）提取制备模板时丢失过多；（5）模板核酸变性不彻底。,模板因素引起假阴性解决方案：1.配制有效而稳定的消化处理液;2.提取程序固定,不宜随意改动；3.模板DNA的溶解液应固定不变。,酶失活：1.酶本身的质量问题(供应商的问题）；2.酶存放时间太长；3.酶存放方式不当，或其他意外原因；4.忘记添加Taq酶。,酶失活引起假阴性解决方案：1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq酶；2.更换新的Taq酶;3.新旧两种Taq酶同时使用。,引物：1.引物质量；2.引物浓度；3.两条引物的浓度是否对称等。,引物引起假阴性解决方案:1.选定一个好的引物合成单位;2.引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔浓度；3.引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要求合成单位将固体分装；4.引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。,Mg2+浓度： Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，出现假阴性。,Mg2+浓度引起假阴性解决方案： 设置一组反应，其中每一反应中的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl等），而MgCl2浓度不同（由0.56mmol/L,每次增加0.5mmol/L)，由此来摸索最佳Mg2+浓度。,反应体积的改变： 做小体积PCR后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。,物理原因：1.变性温度低，变性时间短；2.退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率；3.延伸时间过短等。,物理原因引起假阴性解决方案：1.提高变性温度，延长变性时间，特别是首次循环，必要时可设为95 ，10min，或PCR反应以前在开水中煮沸几分钟。2.退火温度应根据Tm值来设定，也可首先将退火温度设为45 ，然后再逐次提高（以2 /次为宜）。3.延伸温度以1000bp/min足够，必要时也可适当延长，特别是末次循环，一定要延伸10min。,靶序列变异： 靶序列变异导致假引性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失效。解决方案： 根据已知序列重新选择区段设计引物。,二.PCR出现假阳性原因：1.引物设计不合适；2.靶序列或扩增产物的交叉污染。（1）整个基因组或大片段的污染；（2）空气中的小片断核酸污染。,引物设计不合适： 1.选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，从而扩增出非目的性序列的PCR产物。2.靶序列太短或引物太短导致特异性不强。解决方案： 选择特异性强的区段设计引物。,空气中的小片断核酸污染： 这些小片断比靶序列短，但有一定同源性，可互相拼接，与引物互补后，扩增出PCR产物，导致假阳性出现。解决方案： 运用巢式PCR来减轻或消除。,三.出现非特异扩增带原因：1.引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体；2.Mg2+浓度过高，退火温度过低，PCR循环次数过多；3.酶的质量不过关，或加Taq酶的量过多。,PCR出现非特异扩增带解决方案：1.必要时重新设计合成引物；2.减低酶量或调换另一来源的酶；3.降低引物量，适当增加模板量，减小循环次数；4.适当提高退火温度或采用二温度点法（94 变性，65 左右退火与延伸）。,四. PCR出现片状拖带或涂抹带原因：1.酶量过多或酶的质量差；2.dNTP浓度过高；3. Mg2+浓度过高,退火温度过低;4.循环次数过多。,PCR出现片状拖带或涂抹带解决方案:1.减少酶量或调换另一来源的酶；2.减少dNTP浓度；3.适当降低Mg2+浓度；4.增加模板量，减少循环次数。,第三节 应用,一、构建cDNA文库 操作过程：根据特定的cDNA片段序列，设计出特异的引物；挑出文库中的菌落，提取DNA，并以其作模板，进行PCR扩增；其产物经琼脂糖凝胶电泳，观察结果若出现特异性扩增条带，即表明所挑菌落中含有目标DNA片段。用PCR筛选编的基因较其他方法更迅速、更省事。,二、直接测序 现在的序列测定几乎都采用PCR法进行。 三、标记DNA 四、寻找新基因 寻找新的基因目前最常用的方法有差异显示法、消减杂交法和丰度差异分析等。差异显示法是显示mRNA差异表达的一种新方法。它通过PCR随机引物与锚定引物的合理搭配，在特定PCR过程中，展示不同条件、个同来源的真核细胞或组织的RNA或DNA的差异扩增片段，为寻找未知基因提供了一条便捷的途径。,五、检测环境中的致病菌与指示菌,Bej等1990年报道了利用PCR检测水体中大肠杆菌类细菌的结果。利用PCR特异地扩增来源于水样中大肠杆菌的lac Z和lam B基因片段，尔后分别用共作探针进行检测，数据表明：扩增的lac Z基因片段，可检测出水样中的大肠杆菌和志贺氏菌，但不能检测出沙门氏菌及其它非大肠杆菌类细菌；扩增的lam B片段，可检出大肠杆菌、沙门氏菌和志贺杆菌；此法检测灵敏度可达15个细胞100mL水。,PCR应用领域 单克隆抗体技术曾使免疫学理论与实践有了新的突破，近几年来PCR技术使分子生物学及相关学科发生了一次方法学的革命。在不到10年的时间内，在以下几个领域中PCR技术已具有实用价值，且其应用范围正在不断扩大中。1遗传病的产前诊断 用胎儿羊膜细胞，羊水或甚至母血可以检查胎儿的性别，这在与性染色体关联遗传病诊断中是必要的。对于高发的遗传病，如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏、DMD等已在临床应用多年，为优生优育作了贡献，对于有遗传倾向的疾病尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂症、甚至肿瘤中的一部分，均是当前研究的重点，近期内可望有突破。,2致病病原体的检测 这些外源入侵的基因，一旦阐明其部分核酸序列，就可以设计引物或探针，用PCR、PT-PCR或杂交方法来检测，其范围包括细菌、病毒、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物，PCR诊断的特点是可以选择其基因中的保守区作通用检测，也可以选定差异较大的基因部位作分型检测。既可以做一病原体的专用检测，也可以将有关病毒、细菌中不同的品种作一次多元检测。而且检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法，所需时间也已达到临床要求，这对于难于培养的病毒（乙肝），细菌（如结核、厌氧菌）和原虫（如梅毒螺旋体）等来说尤为适用。,3癌基因的检测和诊断 虽然对癌基因的研究大部分还属于基础阶段，但癌变是由基因变异所导致的这一基本事实已无庸置疑，所以癌基因、抗癌基因入抗转移基因的研究，离开分子水平的诊断手段是无法进行的，临床上已可应用的例子有白血病残留细胞的定量（包括慢粒和急粒），肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活，神经质瘤N-myc基因的激活和表达。通过原位杂交观察特定癌基因及抗转移基因的植入和反义寡核苷酸对强表达癌基因的阻断均已成为近代基因治疗的着眼点。,4DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证 这一为公、检、法部分所瞩目的课题已经在某些国家取得法律认可。肌红蛋白小卫星基因，-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重复次数的差异都被应用于鉴定，其灵敏度已达到一根头发、一个细胞、一个精子取得个体特征图谱，这一领域也已发展到骨髓或脏器移植配型及动物种系的研究中。,5动、植物检疫 灵敏、特异、快速诊断检测方法是我国进出口口岸的门卫，检查出入国门的人员、动、植物（种畜、种籽）等是否携带烈性传染病（艾滋、动物病毒、植物病毒等）病原体，食品、饲料等是否带沙门氏菌等均需要基因诊断手段将这些病菌拒之于国门之外，是提高我国综合国力的必要保证。6高科技生物医学领域中的应用 在转基因动植物中检查植入基因的存在。PCR技术尚可应用于基因拼接、测序等领域。,