DNA的粗提取与鉴定使用ppt课件.ppt
专题5 DNA和蛋白质技术,课题1 DNA的粗提取与鉴定,课题目标,目标:1本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，2理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。课题重点：DNA的粗提取和鉴定方法。,知识要点：,1. DNA的物理化学性质，尤其是DNA的溶解性2. 二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。,基础知识,1、提取大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理、化学方法分离具有不同物理或化学性质的大分子。,2、提取DNA分子的基本思路又是什么？ 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质上的差异，提取DNA，去除其他成分。,3、提取和鉴定DNA的具体的依据有哪些方面？(原理),1）、DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。,1、在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在Nacl 溶液中的溶解度是如何变化的？,在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。,2、如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,3、提取和鉴定DNA的具体的依据有哪些方面？,1）DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。,DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精,2）、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶只能使蛋白质水解大多数蛋白质不能忍受6080的高温而变性，但DNA在80 以上才变性。洗涤剂能瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。,3、DNA的鉴定沸水浴下，DNA遇二苯胺被染成蓝色；二苯胺鉴定DNA的化学原理： DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成-羟基-酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。紫外灯照射法： 紫外灯照射法用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm处)。,甲基绿 （蓝绿色）,实验设计,（一）实验材料的选取,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,（三）去除滤液中的杂质,（四）DNA的析出与鉴定,实验设计,（一）实验材料的选取 含有DNA的组织且DNA含量较多的组织。比较下列材料哪些DNA含量高、适于提取DNA？为什么？,哺乳动物红细胞：大肠杆菌： 鸡血细胞：,没有细胞核，没有DNA。,原核生物，DNA含量少。,DNA含量丰富，材料易得，易吸水胀破。,DNA含量相对较高的生物组织。,。,较好的实验材料应该满足以下几个条件 ：1组织中DNA的含量比较丰富,能够适合大量提取。 2该组织中所含化合物种类应比较单纯,避免由于其他 物质化学性质与DNA相近，从而对实验现象产生某 些干扰。 3实验材料的价格适宜，从而能相对的降低实验成本。 4实验材料在实验过程中的可操作性较强，在相对简单 的条件下能大量提取出DNA，便于学生实验操作,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞：蒸馏水 搅拌,1、为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。,旁栏问题,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞：蒸馏水 搅拌2、植物细胞：洗涤剂和食盐 搅拌和研磨若探究提取效果，可设置对照实验。,2、加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。,旁栏问题,3如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。,旁栏问题,4此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。,（三）去除滤液中的杂质方案一： DNA在不同浓度NaCl中溶解度不同；,实验设计,旁栏问题,5为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。,（三）去除滤液中的杂质方案一： DNA在不同浓度NaCl中溶解度不同；方案二： 加入嫩肉粉（含木瓜蛋白酶）方案三： 6075恒温水浴保温1015min,实验设计,旁栏问题,6方案二与方案三的原理有什么不同？,方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。,（四）DNA的析出与鉴定：95%的冷酒精静置23min，出现白色丝状物玻璃棒卷起加入2mol/L氯化钠溶解，加入4mL二苯胺试剂，摇匀，沸水浴5min，观察颜色变化。 （注意设置空白对照）,实验设计,使用冷的乙醇溶液具哪些优点？,一、抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二、降低分子运动，易于形成沉淀析出；三、低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。,P56操作提示,1、血液应加入柠檬酸钠（抗凝剂）防止血液凝固；2、加洗涤剂，动作要轻缓，防止产生大量气泡； 加酒精、玻棒搅拌，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂。3、二苯胺试剂现配现用。,结果分析与评价,（一）是否提取出了DNA 观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。,结果分析与评价,（二）分析DNA中的杂质 本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。（三）不同实验方法的比较 对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。,练习,提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。,1、请解释提取DNA的实验操作中主要 步骤的目的。,练习,提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。,2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗？为什么？,案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,实验案例,鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长,1、鸡血细胞做实验材料的原因,鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得,2、实验原理, DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。, DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。, DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,4、课前准备鸡血细胞液,取质量浓度为01g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）,过程,柠檬酸钠作用,防止血液凝固,作用机理,柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固,鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液,注意事项,讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆,5、方法步骤,将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。,提取鸡血细胞的细胞核物质,讨论：,答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破,（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？,（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？,答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA,（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA,溶解细胞核内的DNA,将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态,沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 molL）,析出含DNA的粘稠物,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出,将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕,注意事项：,滤取含DNA的粘稠物,用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上,将DNA的粘稠物再溶解,取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中,提取含杂质较少的DNA,在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：,（2）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（1）为什么要加50mL的冷酒精？,取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0015 molL的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化, DNA的鉴定,讨论：,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（2）这一鉴定结果说明什么问题？,（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是DNA,（3） DNA的直径约为2010-10 m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？,答： DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的,答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”,6、讨论：,两次蒸馏水,第一次：细胞吸水胀破 第一步第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步,（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？,过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层,三次过滤,第一次： DNA存在于滤液里 第一步第二次： DNA被留在纱布上 第四步第三次： DNA存在于滤液里 第六步,两次析出,第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含杂质多,第三步,第二次：用冷却的95的酒精,第七步,六次搅拌：第一、二、三、五、七步,其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA,（2）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,教材中建议采用洗发香波、洗涤剂等一些去污剂，使植物细胞膜破碎，释放DNA。学生可以设置对照实验，比较哪一种方法可以提取到纯度更高的DNA。一般实验室提取高纯度的DNA都采用一种阳离子去污剂十六烷三甲基溴化铵分离缓冲液，使细胞膜破碎，同时将DNA与植物中多糖等杂质分开，再用氯仿异丙醇混合液（体积比为241）抽提去除杂质蛋白，得到高纯度的DNA。,参考资料,研磨液中几种药品的作用Tris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）。EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。SDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA分离。,
