DNA提取与鉴定ppt课件.ppt

实验指导老师 刘晓颖 张萍萍 陈彦 王剑峰 李绍飞 2012-02,生物化学大实验,生物化学大实验,实验一：动物基因组的制备及其鉴定1实验二：动物基因组的制备及其鉴定2实验三：动物基因组的制备及其鉴定3实验四：糖类化合物的提取及TLC分析1实验五：糖类化合物的提取及TLC分析2实验六：Sephadex-G50层析法分离蛋白质实验七：SDS-PAGE测定蛋白质分子量实验八：聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点,生物化学大实验,实验一：动物基因组的制备及其鉴定1实验二：动物基因组的制备及其鉴定2实验三：动物基因组的制备及其鉴定3实验四：糖的分离鉴定硅胶G薄层层析实验五：Sephadex-G50层析法分离蛋白质实验六：蛋白质的FPLC分离与定量测定,实验要求,（1）实验前要预习相关的内容，弄懂原理，了解实验的设计思路，找出实验操作的关键步骤，试剂的配制方法及用量，数据处理的方法等。（2）实验过程中，要认真，规范的操作。学会安排实验时间和实验顺序。如实记录实验中出现的现象和数据。（3）使用仪器时要按照说明书去做。发现故障应停止使用。节约试剂。公用试剂用完后，要及时放回原处。（4）实验报告要及时完成。报告上要注明实验日期及温度。在报告的结果讨中，对实验现象，结果和数据等可进行分析；也可对实验中遇到的问题及实验中需要改进的地方进行讨论。（5）一般试剂都应用蒸馏水或无离子水(即离子交换水)配制，有特殊要求的除外。（6）试剂(特别是液体)一经取出，不得放回原瓶，以免因量器或药勺不清洁而沾污整瓶试剂。取固体试剂时，必须使用洁净干燥的药勺。（7）使用易燃、易爆、有腐蚀性甚至有毒的化学药品时应注意安全，必要时应戴手套，带口罩或防毒面罩，并在通风橱中进行。（8）实验纪律：不迟到和缺席。实验室的卫生要轮流值日。,成绩评定,平时成绩：考勤 实验技能测试和实验报告等 70 60% 期末理论考试： 30 40%,动物组织的提取与鉴定,刘晓颖 张萍萍,分离纯化核酸原则与要求,1.应保证核酸一级结构的完整性 完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求) 2.排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度； 无其他核酸分子的污染，例如提取DNA分子时，应去除RNA分子3.减少化学因素对核酸的降解 避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH 410条件下进行,4. 减少物理因素对核酸的降解 强烈振荡、搅拌，将细胞突置于低渗液中，细胞裂解、反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些 。5. 防止核酸的生物降解 细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。DNA酶需要Mg2+，Ca2+的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA酶的活性 RNA酶不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸碱，不易失去活性，所以生物降解是RNA提取过程的主要危害因素。进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮或一70的冰箱中。,DNA在细胞内的分布,核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的染色体DNA、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子；,95的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其他5为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等RNA分子主要存在于细胞质中，约占75，另有10在细胞核中，15在细胞器中。 大多数生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3端带有polyA结构。,DNA的性质,DNA是很惰性的化学物质，双链由氢键紧密相连，其碱基对外侧受磷酸和糖的保护，并由于其内部的碱基堆积力而进一步加强，使DNA在细胞内比其他成分更具化学耐久性。 因此在氯仿等使蛋白质变性的条件下，DNA分子仍然稳定。 真核生物中的染色体DNA与碱性蛋白(组蛋白)结合而成核蛋白(DNP)形式而存在于核内。DNP溶于水和浓盐溶液(1-2mol/L 氯化钠)，但不溶于生理盐溶液中(0.14mol/L 氯化钠)，而RNP此时的溶解度较大，因此可利用这一性质，将DNP与RNP分离。 DNA在乙醇中形成絮状沉淀，使DNA最终得以分离,真核生物基因组DNA分离纯化的基本步骤,真核生物的一切有核细胞(包括培养细胞)都可以用来制备基因组DNA。提取方法包括两步：,1、先温和裂解细胞及溶解DNP，而后使DNP与RNP分离，再使核蛋白解离，释放出DNA. 真核细胞的破碎有各种手段，包括超声波破碎法、匀浆法、液氮破碎法、低渗法等物理方法及蛋白酶K和去污剂温和处理法，为获得大分子质量的DNA，一般多采用后者温和裂解细胞。,高分子质量DNA在物理上仍是易碎的，在溶液中，长而弯曲的DNA分子随机卷曲，并因碱基堆积力和磷酸 基团间的静电排斥力变得粘滞，容易受到吸液、振荡、搅拌等引起的流体剪切力作用而断裂，因此，基因组DNA容易成片断获取，但所需分子质量越大，获得的难度也相应增加，大于150 kb的DNA分子在常规分离方法中多被切断。 去除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提操作对DNA链机械剪切机会较多，因此有人使用80甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可得小于200 kb的DNA片段。,2. 采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其他大分子,猪脾脏DNA提取与鉴定,【实验目的】掌握浓盐法提取与鉴定动物组织DNA的原理和方法。,【实验原理】,核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。在细胞内，RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（RNP），DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（DNP）。在.14 molL的氯化钠溶液中， RNP的溶解度相当大，而DNP的溶解度仅为在水中溶解度的1；当氯化钠的浓度达到1 molL的时候， RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。所以常选用.14 molL的氯化钠溶液提取RNP ，而选用1 molL的氯化钠溶液提取DNP 。,核酸提取液中含有的蛋白质、多糖等可以用沉淀分离法除去。在核酸提取液中加入氯仿-异戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿一水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。,核酸都不溶于有机溶剂，可在核酸提取液中加入亲水有机溶剂（乙醇），使DNA或RNA呈絮状沉淀析出。,【实验材料】,1材料新鲜(冰冻)猪脾脏。2器材高速组织捣碎机，恒温水浴，台式冷冻离心机，锥形瓶，具塞三角瓶，试管3试剂(2人/组)(1) 0.1mol/L NaCI-0.05 mol/L柠檬酸钠混合液：称取0.58g NaCl和1.47g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后稀释至100mL。(2) 10(1.71mol/L)NaCl溶液200ml(3) 氯仿:异戊醇(24:l ,V/V)，现用现配（通风橱中）。 (4) 95乙醇,【实验方法】,1取新鲜(冰冻)猪脾脏20g，剔去结缔组织，用0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸溶液冲洗除去血水，在冰浴上剪成碎末。2加入2倍组织重的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠混合液(40mL)置高速组织捣碎机内破碎细胞膜(慢档，每次5s，间隔30s，共绞3次)，获得组织浆液。静置5min，期间轻轻搅拌以充分释放RNA。3组织浆液于43500r/min离心20min，弃去上层液，收集沉淀(包括细胞核)。4向细胞核沉淀中加入6倍组织重的10(1.71mol/L)NaCl溶液120mL，充分搅匀，置冰箱内过夜。,【实验方法】,5次日将所得到的半透明粘稠状液体连续注入(线状、缓慢倒入) 预冷的11倍体积(1320mL)蒸馏水中，轻轻摇匀，DNP即呈絮状沉淀析出，置冰箱内放置数小时。6上层清液利用虹吸方法吸出，剩余含有沉淀的少量溶液经离心(3500r/min，15min)，收集DNP沉淀。7将DNP沉淀再溶于原组织重约4倍体积(80mL)的10NaCl溶液中，轻轻搅拌加速溶解，转移至带盖的三角瓶中。,8加入l/2体积的氯仿-异戊醇溶液(24:l ,V/V) 40mL，上下剧烈振荡2-5min ，使组蛋白分离，于3500r/min，离心l5min，吸出上面含有DNA和DNP的水层，弃去两层间的变性蛋白凝胶，回收下层有机相。9上层水相再次加入20mL氯仿-异戊醇混合液，继续抽提去除蛋白，多次重复此操作（至少共3次）直至两相之间无明显变性蛋白质凝胶生成。,【实验方法】,10最后吸出上清液并将它连续注入两倍体积预冷至4的95乙醇中。11用玻棒小心捞出纤维状DNA钠盐沉淀，沥干乙醇溶液后，依次用80和95乙醇洗涤，最后用少量无水乙醇洗涤，轻轻压挤沉淀，尽量吸尽乙醇后，铺开在表面皿上。置真空干燥器内干燥，即得白色纤维DNA钠盐。,【实验方法】,【注意事项】,1为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，使其分子断裂，因而不能获得天然的大分子核酸。提取中需要加人柠檬酸钠、EDTA、8-羟基喹啉等抑制核酸酶的活力，并在低温下进行操作，此外提取过程中应避免加热，强酸，强碱和剧烈振荡等。本实验第一步进行组织匀浆时，不宜过于剧烈，时间不能太长，避免部分细胞核被破坏，导致DNA释放而被断裂，这将关系到最后是否能获得纤维状DNA。,2除去蛋白质时，若振荡剧烈可使部分DNA断裂，乙醇沉淀后，除能缠绕粘附在玻棒上的纤维状DNA外，溶液中还会有絮状沉淀，即为断裂的DNA。但若振荡不够，蛋白质不能很好除去，则影响DNA制品的质量。3细胞核沉淀加入浓盐溶液，冰箱放置过夜后，有时可能形成块状凝胶(如以脾脏为材料制备DNA)，应置捣碎机内绞5s，打碎凝胶块，但此时DNA已从核内溶解出来，因此不宜剧烈打碎。,【注意事项】,思考题,1.为什么在低温下进行？2.加柠檬酸钠和EDTA的作用 ?3.加NaCl的作用，为什么要加到1mol/L?4.加入异戊醇有什么作用？5.分离纯化过程中每一步试剂的作用？,实验室： 315室 313室 311室领用仪器： 312室 王剑峰纯水机： 311室制冰机室： 204室离心机： 313室一台，204室一台， 103室一台，101室一台，分光光度计室：206室,DNA的鉴定与分析,二苯胺显色法测定DNA含量紫外吸收法测定DNA纯度琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子大小与完整性,二苯胺显色法测定DNA含量（一）,强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。 其中2脱氧核糖在酸性环境中成为羟基酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400g/ml范围内光密度与DNA浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。 当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。,【实验原理】,1、DNA标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）取标准DNA以0.01mol/L NaOH配成200微克/毫升的标准液。 每组需12.4ml，200ml/班2、待测样品液：准确称取猪脾DNA 5mg,用0.01mol/L的氢氧化钠溶液定容至50ml配成100微克/毫升的溶液。 每组需7ml3、二苯胺试剂：1g二苯胺 （需在70%乙醇试剂中重结晶2次) +100 mL冰乙酸+10 mL过氯酸，混合备用，临用前加入1.0 mL1.6%乙醛。 每组需64ml,1000ml/班4、1.6%乙醛：取47%乙醛3.4ml，加重蒸水定容至100ml（放于冰箱中，一周之内可以使用）。注意：商品用有47%和40%两种,1. DNA标准曲线的制定： 取14支试管，分成2组，依次加入0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2ml。然后各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于沸水浴中加热10min ，冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。,【操作方法】,DNA标准曲线的制定,以1号管为空白对照,2. 制品的测定： 取2支试管，各加2ml待测液（内含DNA应在标准曲线的范围之内）和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。3.根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量，计算出制品中的百分含量。,【操作方法】,DNA纯度： 待测液中测得的核酸微克数 DNA%= 100 待测液中制品的微克数 DNA产率: 测得的DNA的微克数 DNA%= 100 原料的微克数,数据处理,二苯胺试剂仅能与嘌呤核苷酸中的脱氧核糖反应.因此测定的可靠性受到不同来源的DNA中嘌呤与嘧啶核苷酸比例变化的限制，为提高测定准确度，应使用经纯化的其含磷量已知的小牛胸腺DNA作为标准样品进行校正。,【注意事项】,紫外吸收法测定DNA纯度（二）,核酸在260nm波长处具有紫外吸收特性(最大吸收峰)。此法快速、简便，且不破坏样品，是定量测定浓度较高的纯DNA和RNA溶液的首选方法。高纯度DNA制品的260nm与280nm的吸光值在1.8左右，当比值偏高时表明制品中混杂有RNA,而比值偏低时则表明制品中可能有蛋白质或酚的污染。因此，可利用A260/A280比值的测定来鉴定DNA制品的纯度。,【实验原理】,1吸取2.5mlDNA样品，转入石英比色杯中(若样品很少，可用0.5mL的比色杯，上述体积均减一半)。2用2.5mL 0.01mol/L NaOH校正紫外分光光度计的零点。3在260nm，280nm处分别读出吸光度值(A)。定量分析：DNA的浓度=A260核酸稀释倍数501000 =A2601501000 =20A260(g/l) RNA的浓度=A260核酸稀释倍数401000 (g/l),【实验步骤】,分光光度换算： 1A260双链DNA=50g/ml 1A260单链DNA=30g/ml 1A260单链RNA=40g/ml,注意,将DNA样品稀释到A280在0.2-0.8（0.1-1.0）之间再测A260、A280及计算A260/A280比值，因为只有在此范围内才有线性关系，可先用原液测定，再估算稀释比例。,4纯度分析：若为DNA纯品，则A260A280=1.8 若为RNA纯品，则A260A280=2.0 若DNA样品A260A2801.8，说明仍有RNA，可用RNA酶处理样品；若A260A280l.7，说明样品中存在蛋白质，应再用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化DNA。 若为RNA样品A260A2802.0，也应考虑再用酚/氯仿抽提。 若核酸样品A260A2302.0，考虑有盐未除尽。用A260A280比值估计核酸纯度仅在制备物中没有酚时才准确，因水饱和酚在270nm波长处有特征性吸收峰，其A260A280比值也为2.0。无酚的核酸制品A260A270比值约为1.2。,【实验步骤】,琼脂糖凝胶电泳检测DNA （三）,DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。电泳时加溴化乙锭(EB)，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254365nm紫外线照射下可产生橘红色的荧光，可用于检测DNA。,【实验原理】,1实验器材电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像系统2试剂(1) 5TBE缓冲液(pH 8.3)：54g Tris碱，27.5g硼酸，20mL 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，加水至1L。(2) 0.5TBE缓冲液(pH 8.3)。(3) 溴化乙锭(EB)(10mg/mL)。(4) 0.8琼脂糖凝胶：琼脂糖0.8g加至100mL 0.5TBE缓冲液，加热熔解备用。(5) 6凝胶上样缓冲液：0.25溴酚蓝，0.25二甲苯青FF，30甘油溶于水中，于4保存。(6) DNA分子量标准Marker。,【实验材料】,常用的电泳缓冲液,凝胶加样缓冲液,使用凝胶上样缓冲液的目的,增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。,1琼脂糖凝胶板的制备：将0.8琼脂糖凝胶加热熔化均匀，冷却到6070加EB至终浓度0.5g/mL，倒入封好的凝胶槽，厚度约35mm，在距底板0.51mm的位置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板，放人水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶12mm为止。,【实验步骤】,【实验步骤】,2加样：样品中加1/5体积的6凝胶上样缓冲液，混匀，取1015l加入凝胶点样孔中。同时要设立合适的DNA分子量标准物。,Marker 样品DNA1 样品DNA2,加样量ul,6 10 10,6Loading Buffer,0 2 2,3电泳：电压210 V/cm胶，待溴酚蓝移至凝胶的2/3距离时，关闭电源。4观测：取出凝胶块，置凝胶成像分析仪上观察，即可见橘红色的DNA区带。,【实验步骤】,溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关;以0.5TBE作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同;在琼脂糖浓度为0.5%1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。,5.结果:不同方法提取的基因组DNA电泳图谱,12000bp,DNA Marker,常用DNA分子量标准参照物,1加样时勿破坏样品孔，否则DNA带型不整齐。大多情况下，加样时不必更换枪头，可在电泳槽正极端反复吸打电泳缓冲液清洗。但对Southern印迹转移和需回收DNA时，每个样品应使用新的枪头，以避免交叉污染。2上样缓冲液中适量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400可增加样品密度，使样品均匀沉到样孔底，而溴酚蓝、二甲苯青可使样品带色，便于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。3EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB的溶液用后应妥善净化处理。,【注意事项】,4电泳过程中，EB向阴极移动(与DNA相反)，延长电泳时间，EB会从凝胶中迁移出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在0.5g/mL EB溶液中重新染色后检测。5加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.10.5g即可有良好的观察效果。如样品为酶切产物(由大小不同的DNA片段组成)，则每孔加2030g DNA也不致明显影响分辨率。6小的凝胶微型凝胶和中型凝胶的电泳一般比大的凝胶要快，常常用于快速分析。当选择微型或中型凝胶装置时要考虑电泳槽盛装缓冲液的体积，小胶通常要在高电压下电泳(10V/cm)，所以选择一个有相对较大的缓冲槽比较有利。,【注意事项】,