DNA测序技术分析ppt课件.ppt

DNA测序技术的发展,一、DNA序列测定的意义,二、测序技术的建立,三、DNA测序技术的发展,四、DNA测序技术的展望,五、DNA测序技术的应用,DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的详细了解。,一、DNA序列测定的意义,人类基因组计划（Human Genome ProjectHGP）于1990年正式启动，其主要目标有：识别人类DNA中所有基因（超过10万个）；测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。已于2003年完成。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。,造福人类的HGP,1949年, Frederick Sanger开发了测定胰岛素两条肽链氨基末端序列的技术,1953年测定了胰岛素的氨基酸序列。1950年，Edman提出了蛋白质的N端测序技术,后来在此基础上发展出了蛋白质自动测序技术。1965年，Sanger等发明了RNA的小片段序列测定法,并完成了大肠杆菌5S rRNA的120个核苷酸的测定。同一时期,Holley完成了酵母丙氨酸转运tRNA的序列测定。,蛋白质和RNA的测序技术,二、测序技术的建立,1975年，Sanger和Coulson发明了“加减法”测定DNA序列。1977年， Sanger在引入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了双脱氧链终止法,使得DNA序列测定的效率和准确性大大提高。1977年，Maxam和Gilbert报道了化学降解法测定DNA的序列。,DNA测序技术的建立,DNA序列测定技术出现后,迅速超越了蛋白质和RNA测序技术,成为现代分子生物学中最重要的技术。,三、DNA测序技术的发展,第一代DNA测序技术第二代DNA测序技术第三代DNA测序技术,1、第一代DNA测序技术,第一代DNA测序技术： 传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术。,第一代DNA测序技术包括：化学降解法、双脱氧链终止法、荧光自动测序技术和杂交测序技术。,1.1 化学降解法,基本原理: 利用特异的选择性试剂，专一性的随机断裂DNA成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带位置，判断DNA片段末端核苷酸的种类，从而测出DNA的序列。,将双链DNA样品变为单链 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 电泳,读取DNA的核苷酸顺序,技术路线,Maxam-Gilbert 法所用的化学技术,化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。而且化学降解较之链终止法具有一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。但化学降解法操作过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的Sanger法所代替。,1.2 双脱氧链终止法,又称为Sanger法。该法的原理是：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribo nucleoside triphos phate，ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按53方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列 。,双脱氧链末端终止法测序原理示意图,Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。,1.3 荧光自动测序技术,荧光自动测序技术基于Sanger原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。,目前，应用最广泛的应用生物系统公司(applied biosystems ，ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。如ABI3730XL测序仪拥有96道毛细管，4种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记，在通过毛细管时不同长度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被CCD检测系统识别，并直接翻译成DNA序列。,目前所用自动测序技术的改进,3730全自动测序仪,1.4杂交测序技术,该方法不同于化学降解法和Sanger法，是利用DNA杂交原理，将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上，把待测的DNA样品片段变性后与其杂交，根据杂交情况排列出样品的序列信息。 杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大，且不能重复测定。,通过几十年的逐步改进, 第1 代测序仪的读长可以超过1000 bp, 原始数据的准确率可以高达99.999%, 测定每千碱基序列的成本是0.5 美元, 每天的数据通量可以达到600000 碱基。,第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(human genome project,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。,随着人类基因组计划的完成,人们进入了后基因组时代,即功能基因组时代,传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求,这促使了新一代DNA测序技术的诞生。新一代测序技术即第二代测序技术。,2、第二代DNA测序技术,第二代测序技术，主要包括罗氏454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台。,第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。,第二代测序技术将片段化的基因组DNA两侧连上接头,随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。然后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都在同一平面上,这些反应就能够大规模平行进行,每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行,从而获得测序数据。DNA序列延伸和成像检测不断重复,最后经过计算机分析就可以获得完整的DNA序列信息。 第二代测序技术包括：454测序技术、Solexa测序技术和SOLiD测序技术。,2.1 454测序技术,原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。,454生命科学公司在2005年最早推出了第二代测序平台Genome Sequencer 20，并测序了支原体Mycoplasma genitalium的基因组。 并在2007年推出性能更优的第二代基因组测序系统一Genome Sequencer FLX System(GS FLX)。罗氏在2005年便与454公司洽谈并购事宜，2007年完成并购，紧接着公布了DNA双螺旋的发现者之一沃森(Jim Watson)的个人基因组，测序总花费不到一百万美元。,2.2 Solexa测序技术,核心技术：“DNA簇”和“可逆性末端终止” 。,原理：将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。,Illumina公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发，利用合成测序(Sequencingby Synthesis)的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。,Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到250 bp，每次运行后可获得超过20 GB的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。,SOLID通过连接反应进行测序。其基本原理是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括：,文库准备,扩增,微珠与玻片连接,连接测序,超高通量是SOLID系统最突出的特点，目前SOLID 3单次运行可产生50 GB的序列数据，相当于17倍人类基凶组覆盖度。,2.3 SOLiD测序技术,3、第三代DNA测序技术,第三代测序技术是以单分子测序为特点的测序技术。如生物科学公司(BioScience Corporation)的HeliScope单分子测序仪(HeliScope SingleMolecular Sequencer)以及正在研制的太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)的单分子实时DNA测序技术SingleMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing technology和牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore TechnologiesLtd)的纳米孔单分子测序技术等。,目前,我国也启动了第三代测序技术的研究。2009年12月,中科院北京基因组研究所与浪潮成立“中科院北京基因组研究所浪潮基因组科学联合实验室”,利用各自的优势联合研发国产第三代测序仪,第一台样机预计2013年问世,届时有望缓解测序仪核心技术受制于国外公司的现状。,第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和应用, 但是由于其测序速度、成本、准确度等关键问题的解决仍存在困难,研究者们很快将目光转向了更高更新的测序解决方案。 单分子测序也就应运而生。,第三代测序技术非常惊人！1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。 二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条件。3、它的精度非常高，达到99.9999%。4、可直接测RNA序列。5、可直接测甲基化的DNA序列。,2008年4月，Helico BioScience公司的Timothy等人在Science上报道了他们开发的真正的单分子测序技术,并利用该技术对一个M13病毒基因组进行重测序。 这项技术之所以被称为真正的单分子测序,是因为它完全跨过了前述3种高通量测序依赖的基于PCR扩增的信号放大过程,真正达到了读取单个荧光分子的能力。,斯坦福大学的科学家最近利用Heliscope单分子测序仪,用了48 000美元的试剂和4个星期的时间,对一名白人男子的基因组进行了测序。测序的覆盖度达28倍,覆盖了90%的人类参考基因组。序列读长24-70 bp,平均读长为32 bp,并鉴定出280万个SNP位点和752个拷贝数变异。,3.1 HeliScope单分子测序仪,Pacific bioscience 在Science上报道了他们的基于SMART技术的单分子测序技术,该技术利用单分子技术和DNA聚合酶,在聚合反应的同时就可以读取测序产物,目前一期的读取速度为3bp / s,但他们声称在2013 前实现三分钟读完人类基因组。Pacific技术目前在研究大肠杆菌基因组时的评价读长为586个碱基,有些能达到2805碱基,新仪器的单个读长已达10351个碱基,而且有望实现更大的读长,而且准确率99.9999%。,3.2 单分子实时DNA测序技术,英国牛津纳米公司成功研制出了基于纳米孔的单分子测序技术,该技术读取数据的速度更快,而且成本会大大降低 。 在该测序技术平台中,DNA分子以一次一个碱基的速度依次通过纳米小孔,利用核酸外切酶的特性来识别出不同的DNA碱基,同时还能检测出碱基是否被甲基化等相关的重要信息。,3.3 纳米孔单分子测序技术,据2010 年7 月30 日Xiao Yan（Nano Lett，July 30，2010）报道，美国宾夕法尼亚大学的研究人员开发出一个纳米级的碳基平台，可用于电子探测单个DNA 分子。该技术最终有望在快速DNA 电子测序方面发挥“用武之地”。这个纳米平台由石墨烯制成。研究小组利用电子束技术，在石墨烯膜上烧灼出纳米大小的小孔，在电场的作用下，微小的DNA链就可以穿过这些孔洞。通过电子测量手段检测DNA 的易位，再根据DNA 的4 个碱基各自独特的“电子签名”，就可以快速完成DNA 测序。,探测单个DNA 分子技术开启高通量DNA 电子测序之门,四、DNA测序技术的展望,DNA测序技术经过30多年的发展,目前已经到了第三代,三代测序技术有各自的优势。 第一代测序技术虽然成本高,速度慢,但是对于少量的序列来说,仍是最好的选择,所以在以后的一段时间内仍将存在; 第二代测序技术刚刚商用不久,正在逐渐走向成熟; 第三代测序技术有的刚刚出现,有的则正在研制,相信很快便可进行商业化运作。 可以预见,在未来的几年里会出现三代测序技术共存的局面。,随着新的测序技术的出现,大规模测序的成本迅速下降,花费1 000美元测一个人的基因组的目标相信很快就可以实现。届时,对于遗传病的诊治将变得简单、快速,并能从基因组水平上指导个人的医疗和保健,从而进入个人化医疗的时代。同时,生物学研究的进展将会更多地依赖于测序技术的进步,不同领域的科学家花很少的钱就可以对自己熟悉的物种基因组进行测序,从而更好地指导试验设计,取得更多新的发现。,五、DNA 测序技术的应用,基因组项目 (全程测序)人，鼠，酵母，病原微生物，水稻，玉米等cDNA 测序 (EST 或全长测序) 比较测序或杂合子测序 单核苷酸多态性（SNP）的发现与验证 突变检测BRCA, MSH2/MLH1, p53依据于测序的分型试剂盒应用于器官移植等的HLA 配型试剂盒应用于法医的线粒体测序指导临床治疗的HIV基因型检测试剂盒针对16S rRNA 的细菌鉴定试剂盒 针对D2 rDNA 的真菌鉴定试剂盒,THE END,Thank you ！,