蛋白质的定性定量分析及保存ppt课件.ppt

5 蛋白质定性定量分析及保存,蛋白质定性分析 (qualitative analysis),确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质,蛋白质定量分析 (quantitative analysis),确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量,蛋白质含量的测定方法,蛋白质相对分子量测定,纯化蛋白质的浓缩、干燥和保存,蛋白质的免疫印迹分析 (western blotting),蛋白质组学定量研究常见方法,第一节 蛋白质的含量测定,目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样品的总蛋白含量；目前没有任何方法能直接分析样品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是比色法，包括Bradford（考马斯亮蓝）、BCA法、紫外分光光度法等。,蛋白质的比色法含量测定,基于蛋白质的元素组成特点,基于蛋白质的化学显色反应,基于蛋白质的光吸收特性,一、基于蛋白质元素组成的特点 -凯氏定氮法,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.25100,1/16,凯氏定氮法,1883年，丹麦化学家Kjeldahl建立，基于蛋白质的含氮量在16%左右。蛋白质+硫酸CO2+H2O+NH3硫酸铵+强碱氨优点：适用样品广泛，结果可靠缺点：样品中非蛋白态氨影响测定值；蛋白质氨基酸有偏差时（大量碱性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）误差较大；操作繁琐。,二、基于蛋白质的光吸收特性 -紫外光谱 (A280)吸收法,这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰。,原 理,芳香族氨基酸的紫外吸收,蛋白质中的Trp、Tyr在280nm有特征性吸收；肽键在215nm附近有特异吸收。可通过测定该波长的光吸收度，计算蛋白质浓度。CA/KL，其中A为吸光度，K为摩尔消光系数，L为光程。K值可通过各种方法得到（包括软件分析等）。,所需时间,几分钟,优 点,快速,缺 点,核酸可引起强干扰作用,灵 敏 度,0.2 mg/ml2 mg/ml,对蛋白质无破坏性,不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液,计算方法,标准曲线法,蛋白质浓度 (mg/ml) =1.45A280-0.74A260,注意事项,石英比色杯,调零所用溶液,配制标准蛋白所用溶液,光密度范围,二、Bradford检测法,由Bradford等人于1976年建立 这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法目前绝大多数公司都提供基于此原理的蛋白质定量试剂盒,基于蛋白质的化学显色反应,原 理,该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光吸收值大小计算蛋白的含量,所需时间,10 min,优 点,快速（反应时间仅需2 min）,敏感，几乎没有蛋白质损失,缺 点,用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性,灵 敏 度,25 ug/ml200 ug/ml,对各种纯化蛋白质反应不同,计算方法,标准曲线法,注意事项,标准曲线在2.5 ug15 ug BSA浓度 范围内保持线性关系,反应1015 min后开始出现沉淀， 尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀,若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确,三、Lowry检测法,1951年Lowry在Folin酚试剂法和双缩脲法的基础上建立这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用，在检测之前可通过蛋白质沉淀将干扰物质去除,基于蛋白质的化学显色反应,原 理,首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745 750 nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量,所需时间,40 min,优 点,一种可靠的蛋白质定量方法,不同蛋白质之间差别很小,缺 点,某些试剂不稳定,灵 敏 度,5 ug/ml100 ug/ml,干扰物质多,反应速度慢,使蛋白质发生不可逆变性,计算方法,标准曲线法,注意事项,在加入试剂30 min后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱,许多干扰物质降低颜色反应,高盐浓度可引起沉淀,四、BCA (二喹啉甲酸)检测法,这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质的影响，有试剂盒出售。,基于蛋白质的化学显色反应,原 理,在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2生成络合物，同时将Cu2还原成Cu。而BCA试剂可敏感特异地与Cu结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。,优 点,与Lowry法相比几乎没有干扰物质的 影响,缺 点,蛋白质发生不可逆的变性,灵 敏 度,标准检测： 10 1200 ug/ml,单一试剂,终产物稳定,反应时间长,微量检测： 0.5 10 ug/ml,计算方法,标准曲线法,注意事项,与Lowry相比，采用BCA法时， 如果样品中含有脂类物质将明显 提高光吸收值,为促进BCA法的反应进程，可将 样品适当加热,其它蛋白质的定性定量方法,1. 蛋白质的染色定量,2. ELISA测定,3. 放射免疫测定,第二节 蛋白质相对分子量测定,分子量测定 (molecular weight, MW),排阻层析,沉降平衡超速离心,动态弹性光散射,孔径梯度电泳,质谱 (ESI-MS),1. SDS-PAGE测定分子量,基本原理：SDS可以破坏蛋白质中的疏水键和氢键，并按一定比例（1g蛋白质结合1.4g SDS）和蛋白质组成复合物，使蛋白质带的负电荷的量远远超过其本身的电荷量，并与蛋白质的分子量成正比。2-巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭圆棒形，其轴长与分子量成正比。q/fq/6r，所有蛋白质的迁移率都相同。,在SDS-PAGE中迁移的蛋白质的分子量与电泳迁移率的关系符合下述公式：lg MrlgKbmK1bm其中Mr为蛋白质相对分子量，K、K1为常数，b为斜率，m为迁移率。注意：此公式也适用于核酸在琼脂糖凝胶中的迁移,在半对数坐标纸上做出标准曲线,注意：标准曲线的斜率会根据所用凝胶浓度而发生微小的改变。,2. 凝胶过滤层析法测定分子量,蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其分子量的关系如下式所示： lg MrK1K2 Ve在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的Ve，并以它们的lg Mr对Ve作图得一直线，再测出样品的Ve，即可从图中得到样品的分子量。,SDS-PAGE与凝胶过滤法是互补的,凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话）的分子量；SDS-PAGE测得的是蛋白质亚基的分子量；在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS-PAGE可测得蛋白质每条多肽链的分子量。综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信息。,例如： 凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：180kD SDS-PAGE（不加还原剂）结果：45kD SDS-PAGE（加还原剂）结果：两条蛋白带（15kD和30kD）则结论是： 该蛋白质由4个相同的亚基组成，每个亚基由两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链的分子量分别为15kD和30kD。,3. 质谱法是最精确的分子量测定方法,质谱（ Mass Spectrometry，MS）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的大小顺序排列的图谱。由于ESI和MALDI两大电离技术的出现，质谱技术已广泛应用于蛋白质研究领域，包括蛋白质分子量测定。精确度0.010.1。,第三节 纯化蛋白质的浓缩、干燥和保存,一、 蛋白质的浓缩,超滤法使用特制薄膜对溶液中的溶质分子进行选择性过滤的技术。常用离心力使蛋白质透过滤膜，而使蛋白质截留在膜内。,冷冻干燥法在冷冻状态下使样品中水分升华而浓缩蛋白质的技术，保持蛋白质构象的最好方法。注意：必须保证蛋白质始终处于冷冻状态（在70冰箱预冷），为提高溶解度可加赋形剂（右旋糖酐、甘露醇等）。,吸收法采用吸水剂直接吸去蛋白质溶液中的水。PEG、蔗糖、凝胶干粉等。沉淀法硫酸铵、PEG、有机溶剂沉淀；免疫沉淀。,5.其它方法,浓缩胶浓缩法离子交换法吸附法蒸发法,二、 蛋白质的干燥,常压吸收干燥真空干燥冷冻干燥喷雾干燥气流干燥,三、 蛋白质的保存,影响蛋白质成品保存的因素： 1）空气 2）湿度 3）水分 4）光线 5）pH值 6）时间,2.蛋白质的保存方法,低温下保存制成干粉或结晶保存在保护剂下保存 a.惰性的生化或有机物 b.中性盐 c.巯基试剂,第四节 蛋白质组学定量研究常见方法,蛋白质组学定量研究常见方法,1：常规双向电泳2：DIGE3：15N等同位素标记4：ICAT5：iTRAQ6：SILAC,1：双向电泳,基于2D-PAGE的经典定量分析方法。 1、样品准备和定量：抽提对照组和各种不同实验组的蛋白质。 2、蛋白质分离：蛋白质经过2D-PAGE分离后染色（银染、考染等）。 3、蛋白质的定性与定量分析：通过与对照组相Image Master 7.0分析出实验组中差异点，质谱鉴定差异点蛋白质,同时应用软件分析出其表达量的变化。,2：DIGE,简介： DIGE 双向荧光差异凝胶电泳，利用荧光染料（Cy2, Cy3, Cy5）能与蛋白质赖氨酸的氨基反应而使蛋白质被标记，标记后蛋白质的等电点和分子量基本不受影响，等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳，蛋白质表达量的变化则通过不同荧光的强度来体现。技术优势： 1：高效性，同一块凝胶上可以电泳两个样品，减轻了工作量； 2：与常规银染相比灵敏度更高； 3：检测动态范围更大； 4：定量精确, 采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差； 5：统计学分析，ImageMaster7.0（DIGE）软件可以得到统计学可信的结果，降低了操作者之间的偏差。,2：DIGE,DIGE荧光定量方法流程图. 1、样品准备：提取对照组和不同实验组的蛋白质,定量,cy3和cy5交叉标记，同时将所有实验组与对照组的样品等量混合后cy2标记，作为内标。 2、蛋白质分离：等量混合三种荧光素标记后的蛋白质，2D-PAGE电泳分离，荧光显色。 3、蛋白质定量分析：Image Master 7.0（DIGE)分析同一蛋白质不同处理后的表达量变化。,3：代谢标记法15N标记法,简介： 在培养基中添加15N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE分离，质谱鉴定和定量。 根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。优点： 高效性：15N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%； 重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； 灵活性：在培养基中添加同位素标记15N ，操作方便。缺点： （1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。 （2）由于使用的15N培养基纯度96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。,4：化学标记法ICAT,A: ICAT试剂结构，包括3个部分，SH反应集团， biotin标签，同位素臂，试剂具有两种形式：重型（含8个氘）和轻型（不含氘）B: ICAT标记定量技术流程，来源不同处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和轻型ICAT试剂标记，标记后等量混合，胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段。,4：化学标记法ICAT,ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生-消除反应使部分标签断裂。,5: 化学标记法iTRAQ,简介： iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱中，信号离子表现为不同质荷比(113-119，121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。iTRAQ 结构,iTRAQ包括三部分：报告部分、肽反应部分、平衡部分。 1、报告部分：有八种，因此iTRAQ可同时标记8组样品。 2、肽反应部分：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共价连接而标记上肽段，几乎可以标记所有蛋白质。 3、平衡部分：保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷比相同。,5: 化学标记法iTRAQ,与传统基于双向电泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技术优势：1：灵敏度高，检测限低，可检测出低丰度蛋白；2：分离能力强,分析范围广,iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。3: 高通量：同时对8个样本进行分析，提高了实验通量，可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析； 4：结果可靠：定性与定量分析结果更加可靠；5：自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。,5: 化学标记法iTRAQ,iTRAQ法。 1：样本经过不同处理后，提取蛋白质; 2：蛋白质经过还原，封闭后胰蛋白酶酶切; 3：肽段混合物分别用不同的iTRAQ标记; 4：等量混合各种iTRAQ试剂标记的肽段; 5：MS/MS质谱检测及分析。,6: SILAC,SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，其基本原理是在细胞培养时，采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，用于SILAC主要的稳定同位素氨基酸是Lys和Arg, 细胞在传代培养过程中同位素氨基酸将被细胞用于合成蛋白质，细胞经传代培养5-6代后，细胞的所有蛋白质将被同位素标记，等量混合标记的蛋白质后经过SDS-PAGE分离和质谱分析，通过比较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进行相对定量，同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。由于SILAC标记技术是体内标记技术，几乎不影响细胞的功能，同时灵敏度高，因此其在蛋白质组学相关领域中得到了广泛的应用，如比较蛋白质组学，蛋白质与蛋白质相互作用，蛋白质与DNA相互作用，蛋白质与RNA相互作用等领域。,6: SILAC,技术优势目前比较蛋白质组学最先进方法 （1）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%； （2）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； （3）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级水平； （4）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记； （5）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸，操作方便。,6：SILAC,SILAC法。 1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”； 2、细胞处理，如药物处理； 3、细胞裂解、提取蛋白质； 4、等量混合对照与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色； 5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。,第五节 蛋白质免疫印迹技术,印迹法的基本原理,印迹（blotting）是生物大分子物质如核酸或蛋白质通过不同途径转移到固相载体上的过程。与凝胶相比，固相载体容易和各种探针发生化学或免疫学反应。转移后的固相载体经过试剂处理后，可与相应探针反应，然后用适当的溶液漂洗，置于含底物或探针的溶液中孵育，即可显示出谱带。,目前常用的印迹法有三种： Southern blot 检测DNA Northern blot 检测RNA Western blot 检测蛋白质,印迹法最常用的固体材料有硝酸纤维素（NC）膜和PVDF膜。为减少非特异性干扰，需对固相载体进行处理，即用一种与待测物不反应的物质如蛋白质、核酸、吐温20等封闭载体上印迹以外的剩余吸附点（该过程称为封闭），使探针仅与印迹物起反应，且不吸附到载体上。,探针是用化学方法将能与待研究蛋白质结合的物质如抗体，与某些标示物如酶、同位素或荧光物质、半抗原等结合形成的复合物。蛋白质印迹最常用的探针是酶联抗体（HRP酶或AP酶）。,Western blotting原理图示,蛋白质印迹的用途,用于检测样品中是否有特定蛋白的存在，并进行半定量分析。,基本操作步骤,样品的制备细胞裂解物的蛋白定量细胞裂解物的SDS-PAGE蛋白质的转移目的蛋白的检测,免疫印迹技术的注意事项,不能绝对定量，只能相对定量各样品的上样量必须相同选择合适的胶浓度正负电极要确认充分封闭驱除气泡注意保护膜，不能干燥,其它常用的蛋白质分析技术,蛋白质纯度的判定：HPLC、SDS-PAGE、质谱蛋白质序列测定技术：Edman测序法、质谱蛋白质的空间结构测定：X射线晶体衍射分析、核磁共振,