蛋白质测序ppt课件.ppt

蛋白质N-末端氨基酸序列分析1概述2蛋白质N-末端氨基酸序列分析的基本原理3 蛋白质N-末端氨基酸测定序列仪4影响序列测定的因素5蛋白质C-末端氨基酸测定序列仪,1 概述1.1蛋白质序列分析的发展过程蛋白质N-末端氨基酸序列测定( Protein N-Terminal Sequences ),也称为氨基酸序列分析。由于蛋白质和肽的一级结构是以氨基酸以肽键的形式连接而成的生物大分子。测定蛋白质序列是通过测定蛋白质分子中氨基酸排列顺序的一种分析方法，所以也称为蛋白质的一级结构测定。,随着生物化学和分子生物学学科的发展及高新技术在生物学中的应用, 蛋白质序列测定技术发展非常快。开始是手工测定，这种方法既费时又费样品。后来研制出了蛋白质测序仪，通过蛋白质序列仪进行测定。蛋白质测序仪的出现使得蛋白质测序工作有了很大的发展。它不仅能大大缩短测定周期, 还能减少样品的用量，提高了分析精度和准确性，是一种最佳最常用的蛋白质超微分析方法。1950年，Sanger采用2,4-二硝基氟苯(DFNB)法，花费十年的时间，消耗100多克胰岛素样品，通过手工测定，完成了胰岛素51个氨基酸序列的测定。这是人们首次完成的蛋白质一级结构测定。,1967年, Pehr Edman和Begg设计了第一台蛋白质自动测序仪，从此开始了用仪器测定蛋白质序列的新纪元。1970年测定一个蛋白样品需要耗时一年左右, 耗蛋白样品大约1g。1980年测定一个蛋白样品需要耗时一周左右, 耗蛋白样品大约1mg。1985年通过蛋白质序列仪已经测定出两千多个蛋白样的氨基酸序列。1995年测定一个蛋白样品质需要用几小时到十几小时, 样品用量降至g-ng级水平。,1.2蛋白质序列测定的重要意义 蛋白质序列测定主要可以提供以下几种参数:(1) 为DNA 序列分析找出探针，(2) 作为蛋白质和肽类纯度鉴定(3) 研究蛋白质的结构及功能之间的关系及蛋白质结构的同源性。(4) 确定蛋白质生物活性部位，酶与底物结合及催化位点(5) 确定核酸密码中与蛋白质序列的起始位点及结束位点(5) 可以科学的解释蛋白质晶体结构, 蛋白质分子进化的分支点, 分子遗传疾病发病机理，分子免疫的机理。,1.3 N末端氨基酸测序的优点:(1)氨基酸测序测定自动化程度高，省时、省力、准确性高(2)灵敏度高，样品用量可达pmol水平(3)测定的肽链较长，可以连续测定30-50个残基(产率90-98%)(4)测定速度快，测定周期短, 一天可以测1-2种样品,2基本原理2.1. Edman 降解法蛋白质N末端氨基酸序列测定核心是Edman 降解法。它是将蛋白质一级结构中氨基酸从蛋白质的N末端逐个地降解下来, 并把它转化成为性质比较稳定的PTH氨基酸。从蛋白质N末端氨基酸降解下来到获得稳定的PTH氨基酸的过程，称为Edman 降解。,Edman 降解法的基本原理是异硫氰酸苯酯能在较温和的条件下与具有自由氨基的多肽或蛋白质发生偶联反应, 生成苯氨基甲硫酰衍生物, 后者经过环化，并从肽链上断裂下来，然后转变为PTH氨基酸，完成一次Edman 降解。去掉一个氨基酸的肽链或蛋白质有重新与异硫氰酸苯酯发生偶联反应，再重复上面的步骤。Edman 降解如此反复进行。每一次切下来的PTH-氨基酸通过内置的高效液相层析分离系统，分析鉴定每一个氨基。按每次切下来单个氨基酸先后顺序拼接起来就可以获得整个蛋白质或肽的一级结构。测序过程中Edman 降解反应，主要分为三个步骤。,2.1.1偶联反应在三甲胺维持的碱性条件下, 待测蛋白质或肽分子的氨基与异硫氰酸苯酯(PITC)发生偶联反应, 生成苯氨基甲酰蛋白质（亦称苯乙内酰硫脲蛋白质, PITC蛋白质），反应式如下：,PITC与蛋白质偶联反应的过程,2.1.2断裂获得的PTC蛋白质在无水三氟乙酸(TFA)的作用下, 水解断裂下一个苯氨基噻唑啉酮氨基酸(称ATZ氨基酸), 反应式如下:,PTC-蛋白质复合物裂解反应过程,2.1.3转化获得的ATZ氨基酸非常不稳定，在10%三氟乙酸水溶液中转化为较稳定的PTH-氨基酸，反应式如下:,ATZ-氨基酸转化成PTH-氨基酸的反应过程,在Edman 降解过程中，虽然在断裂和转化反应过程中都是在TFA的条件下进行化学反应, 但这两步反应必须分别进行。因为断裂反应是在无水三氟乙酸下进行的, 而转化反应是在10%三氟乙酸水溶液中进行的。若两步合为一步反应，使用无水三氟乙酸的反应条件，ATZ-氨基酸不会转化为PTH-氨基酸，采用10%三氟乙酸水溶液的反应条件会使蛋白质的部分肽键分解。所以反应的条件不一样得到的反应产物不同。,2.2 PTH-氨基酸的鉴定:经转化的PTH-氨基酸, 经过序列仪中内置的高效液相层析或高效薄层层析系统分离鉴定，由于每一种氨基酸在高效液相层析中的保留值不同。将每次得到的PTH-氨基酸在高效液相层析中测得的保留值与标准PTH氨基酸的保留值进行比较，便可确定是何种氨基酸。在测序之前要制作一个标准PTH氨基酸图谱。,(1) 高效薄层层析分析法:将PTH-氨基酸, 通过高效薄层层析(如聚酰胺薄膜层析)分离, 每一种PTH氨基酸在一定的展层剂的条件下，其迁移率是一定的，在薄膜上的坐标的位置就可以确定。然后与标准的PTH氨基酸在薄膜上的坐标的位置比较, 便可知蛋白质N末端切下来的氨基酸。PTH氨基酸在268nm处有较强的吸收. 用紫外光照射, 即可在荧光屏上看到, 通过电脑自动识别相对位置, 即可确定。,(2) 高效液相层析法将PTH-氨基酸通过高效液相层析C18柱进行分离, 每一种PTH氨基酸的疏水性有差异，它们在高效液相层析时的保留值不同，根据每次得到的单个PTH氨基酸在高效液相层析的保留值与标准PTH氨基酸的保留值比较，便可确定是哪一种氨基酸。,图3肌红蛋白部分肽链的氨基酸图谱,3 蛋白质N-末端氨基酸测定序列仪蛋白质N-末端氨基酸测定序列仪，简称蛋白质序列仪。仪器的结构是非常复杂的，主要分三大部分，即供气系统、主机和计算机。供气系统包括惰性气体储气瓶，电磁阀，气路管等，主机包括自动进样系统，化学反应系统，氨基酸自动分析系统，计算机主要控制测序过程和报告结果。基本结果如图4所示。,目前能够生产蛋白质序列仪的公司很多, 如:Beckman，Perkin Elmer，Shimadzu(岛津)，Waters，Socosi，Illitron，Pharmacia，ABI等等。每个公司有自己的特点，仪器的技术指标略有差异。但是测定的基本原理是相似的。根据仪器的基本结构和分析方法，蛋白质序列仪大致可以分为四类。液相蛋白质序列仪固相蛋白质序列仪气相蛋白质序列仪脉冲式液相蛋白质序列仪各类以从最初推出的型号到现在都做了不同程度的改进。每次改进使仪器的灵敏度都有一定的提高，测定需要的样品量有所下降，连续测定蛋白质链的长度有所增加，每测定一个氨基酸所用的时间有所缩短。现将这几种仪器的基本构造和测定方法简单介绍一下：,3.1 液相蛋白质序列仪 液相蛋白质序列仪根据Edman降解原理自动旋转杯式测定法而建立的，所以也称之为旋转杯蛋白质序列仪。如 Beckman公司在1969年生产的890型蛋白质序列仪, 是最早推出的一种型号。随后又先后推出了890C, 890M.型.,每次测定的样品用量从最初的250nmol到二十世纪九十年代只需几十pmol左右。仪器工作的基本原理主要经过以下几步：(1) 将待测的蛋白质加入到仪器的旋转杯中。(2) 在一定的条件下进行Edman降解, 经偶联裂解获得ATZ氨基酸。(3) 旋转杯一边旋转，一边抽真空，除去Edman降解时残留的溶剂后, 降解的蛋白质和从蛋白质N末端断裂下来的ATZ氨基酸形成薄膜, 贴在旋转杯内壁上。(4) 从蛋白质N末端断裂下来的ATZ氨基酸经氯丁烷抽提出来。,(5) 高效液相层析分离鉴定。除去氯丁烷，将ATZ氨基酸转化成PTH氨基，通过高效液相层析进行分析(6) N末端氨基酸确定：将从蛋白质N末端断裂下来的PTH氨基在高效液相层析的保留值与标准氨基酸的保留值比较，便可确定是什麽氨基酸。该氨基酸就是蛋白质的N末端氨基酸。优点：操作简单，每一个氨基酸残基需要60分钟。 缺点：对小分子肽及疏水性较强的肽容易在氯丁烷抽提过程中损失。,3.2固相蛋白质序列仪 固相蛋白质序列仪是在1971年由Laursen首先设计出来的仪器，这类仪器主要有Socosi PS-300型，Pharmacia-LKB 4020型, Sequemat 12型等等。,仪器工作的基本原理主要是用聚乙烯等固相支持物将待测蛋白质羧基端(C-端)偶联在层析柱上, 然后进行Edman降解和PTH-氨基酸的鉴定。仪器工作的基本原理主要经过以下几步(1) 待测蛋白固定：通过化学方法将蛋白质C端羧基偶联固定在层析柱上(2) Edman降解：经过偶联裂解获得ATZ氨基酸(3) 洗脱：将经Edman降解获得ATZ氨基酸用有机溶剂(如氯丁烷等)从柱上洗脱下来(4) 蒸发：含有ATZ-氨基酸有机溶剂蒸发除去，得到ATZ-氨基酸,(5) 高效薄层层析分离鉴定：将ATZ氨基酸转化成PTH氨基酸, 通过薄层层析分离(6) N末端氨基酸确定：将从蛋白质N末端断裂下来的PT氨基在高效薄层层析的图谱与标准氨基酸的图谱比较，便可确定是什麽氨基酸。该氨基酸就是蛋白质的N末端氨基酸。优点：防止小分子肽或疏水性较强的肽在有机溶剂萃取过程中丢失，使用试剂的纯度要求相对不十分高。缺点：蛋白质中的Glu, 因- 羧基结合在载体上, 使之无法检测到, Asp 也会妨碍进一步降解反应,3.3气相蛋白质序列仪 气相蛋白质序列仪是在1978年由Hunkapiller M.W.和Hood L.E.等人设计的一种仪器, 利用polybrene 作为蛋白质的载体,高效液相层析为分离系统。1980年由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems, ABI)推出了470A型气相蛋白质序列仪。,该仪器的基本工作原理是通过高纯的三氯乙酸气体, 在反应器滤膜上进行降解, 然后检测PTH-氨基酸。主要分以下几步完成。(1) 加样：将待测蛋白溶液加在反应器滤膜上, 该反应器是由两个光滑玻璃柱空隙组成, 体积为160l(2) Edman降解：蛋白质与PITC反应后, 由纯的TFA气体降解获得ATZ氨基酸(3) 抽提：切下的氨基酸残基经氯丁烷抽提, 转移至容积为1ml的转化器中(4) 转化：ATZ氨基在TFA的作用下转化为PTH-氨基酸,(5) 高效液相层析分离鉴定：PTH氨基酸被输送到氨基酸分析仪中, 采用HPLC 反相层析法分离(6) N末端氨基酸确定：将从蛋白质N末端断裂下来的PTH氨基在高效液相层析的保留值与标准氨基酸的保留值比较，便可确定是什麽氨基酸。该氨基酸就是蛋白质的N末端氨基酸。优点：试剂与溶剂都是通过氩气输送, 由阀门自动控制，可以避免试剂之间的相互污染；反应在恒温器中进行, 保证了最佳反应条件, 重复性好；反应步骤分别在反应器或转化器中进行, 提高了反应效率；样品用量少，回收率高缺点：试剂纯度要求很高,3.4脉冲式液相蛋白质序列仪 脉冲式液相蛋白质序列仪是美国应用生物系统公司在1986年推出的一种蛋白质序列仪, 该仪器吸取了气相蛋白质序列以的优点，克服了其不足。仪器的基本结构与气相蛋白质序列仪相似，主要分为反应器、转化器和高效液相分离系统等及部分。主要分以下几步完成。(1)加样：将待测蛋白溶液加在反应器滤膜上, 该反应器是由两个光滑玻璃柱空隙组成, 体积为160l(2)Edman降解：蛋白质与PITC反应后, 通过高纯的液态TFA降解，获得ATZ氨基酸(3)氯丁烷抽提：降解下来下的氨基酸残基经氯丁烷抽提, 转移至容积为1ml的转化器中,(4)转化：ATZ氨基在10%TFA的作用下转化为PTH氨基酸(5)高效液相层析分离鉴定：PTH氨基酸被输送到氨基酸分析仪中, 采用HPLC 反相层析法分离(6)N末端氨基酸确定：将从蛋白质N末端断裂下来的PTH氨基在高效液相层析的保留值与标准氨基酸的保留值比较，便可确定是什麽氨基酸。该氨基酸就是蛋白质的N末端氨基酸。,脉冲式液相蛋白质序列仪与气相蛋白质序列仪的区别有以下几点：(1)通过液相输送TFA及三甲胺，使供应试剂更为精确，更容易控制。(2)在测定过程中可以随时改变反应器和转化器的温度程序及改变蛋白质序列测定的程序，在测定过程中有更大的机动性。(3)设有记忆程序功能，在临时停电时, 可以记忆停电前的操作程序, 恢复供电后可以继续进行测定。,(4)阀门及管道清洗快速方便，减少了残留在阀门和管道内样品对测定污染。(5)通过电脑自动读出蛋白质序列, 计算产率, 显示层析时间, 打印层析图谱上述几种测序仪，各有所长，但是目前用的比较多的是后两种。但是随着科学技术的发展，蛋白质序列仪会不断推陈出新，必定又会有新型的仪器出现。的ATZ氨基酸用氯丁烷将其抽提出来, 然后转移至转化器,4影响序列测定的因素 蛋白质测序属于超微量分析方法。因此，它对仪器、试剂、样品和测试环境等方面要求比较高。在ATZ氨基酸转化成PTH氨基酸时, 有时某一个氨基酸残基会产生一个以上的洗脱峰, 其原因是在转化过中有些氨基酸不稳定，会形成少量的衍生物和副产物，下面简单介绍一下。,(1) Asn或Gln在反应时常常含有10%的氨基酸残基脱氨,生成相应的PTH-Asp和PTH-Glu, 结果会在Asn和Gln峰附近有Asp和Glu峰.(2) Glu在用TFA-水系统转化时, 有另一个副产物, 在苯丙氨酸附近; Asp用TFA-水系统转化时, 有另一个副产物, 在Vla 之后(3) Ser与还原剂DTT反应后产生DTT-PTH-Ser, 在Ala附近有一个洗脱峰(4)Thr与DTT产生多个PTH-Thr衍生物, 出现在PTH-Tyr峰的前后, 大约有五个小峰,(5) Cys需要经过羧甲基化或其它方式修饰后, 才会有洗脱峰出现; 若未经修饰或已被糖基化, 则检测不到相应的PTH-Cys洗脱峰.(6)从层析图谱中还可以看到一些非PTH-氨基酸的洗脱峰, 它们都是Edman降解反应的副产物, 最常见的有DPTU（二苯基硫脲）、DMPTU（二甲基硫脲）、DPU（二苯基脲）。 反应式如下:,(1)产生二苯基硫脲(DPTU),反应式如下:,(异硫氰酸苯酯) (苯胺) (异硫氰酸苯酯) （二苯基硫脲）当试剂中含有水分或输送氩气中含有水分时, PITC形成二聚体, 就会使DPTU,(2)产生二甲基硫脲(DMPTU), 反应式如下:,(异硫氰酸苯酯) (二甲胺) （二甲基硫脲）,(3)产生二苯基脲(DPU),反应式如下:,（二苯基硫脲） （二苯基脲） 当氩气中含有氧或漏气时, 都会使DPU升高,5蛋白质序列测定应注意的问题 由于蛋白质序列测定需要贵重的精密仪器和昂贵的高纯试剂, 测试费用较高。为了避免经济损失，提高测定的成功率, 减少不必要的失误, 通常在测定序列之前, 对样品进行必要的纯化和理化性质的分析，提供测序时参考，以提高测定的准确性和成功率。,5.1样品纯度要求 待测蛋白质样品的纯度一般要都达到95%以上, 经SDS-PAGE鉴定为一条带；HPLC分析为一个峰；生物活性保持稳定，不再随纯化方法的改变而提高,；分子量大小一致；氨基酸组成无变化；不含无机盐和其它小分子。如果样含有少量的杂蛋白，用常规方法难以出去，可以采用SDS-PAGE电泳分离，然后将要测序的蛋白质条带转移到PDF膜上，在进行测定。,5.2样品提供必要的参数(1) 提供蛋白质的分子量测定结果，以便确定蛋白质测序的长度。(2) 提供蛋白质亚基组成或相关的辅基。(3) 氨基酸组成分析结果，可以确定蛋白质测序的操作程序, 以便提高PTH-氨基酸的回收率,5.3特殊样品的处理(1)多亚基组成的蛋白质的处理：若蛋白质中含有两个或多个亚单位或肽链, 在测定之前必须将其分开成单个亚基链，每一条肽链作为一个样品单独测定, 不能将多个亚基链混合在一起测定。(2) 对二硫键的处理：蛋白质分子中半胱氨酸形成的二硫键最好先经羧甲基化或过甲酸氧化处理，使二硫键还原成半胱氨酸；分子中游离的巯基要特殊进行保护, 以防止在反应过程中被氧化形成二硫键，从而影响测定，使对测定结果的正确分析带来困难。(3)对封闭基团的处理：蛋白质N末端被封闭, 如N-甲酰化， N-乙酰化，环化肽等都要进行修饰或处理才能进行测定,5.4特殊蛋白修饰的方法5.4.1巯基的修饰方法(1)丙烯酰胺修饰法：丙烯酰胺修饰法主要分还原、烷基化和脱盐三步完成。还原: 蛋白质溶解与10-15l 0.2 mol/L Tris, pH 8.4，内含100mmol/L DTT缓冲液中，加入SDS至最终浓度为1%，将样品于70水浴保温20-30分钟，然后用4倍体积的重蒸水稀释。烷基化: 加入6mol/L 丙烯酰胺高浓度溶液至最终浓度为2mol/L，通入氩气(或高浓度氮气)后于37避光保温30-60分钟。,(2)4-乙烯吡啶修饰法：4-乙烯吡啶修饰法与丙烯酰胺修饰相似，也分三步完成。还原: 蛋白质溶于40l 100mmol/L,pH8.4 Tris, 内含6mol/L 盐酸胍缓冲液中, 加入1mol/L DTT至终浓度为20mmol/L, 充氩气后室温放置1-2小时.烷基化: 加入2l 4-乙烯吡啶后充分混合, 同上保温1-2hr脱盐: 加入重蒸水1:1稀释蛋白质溶液后, 再脱盐，方法与丙烯酰胺修饰相同。,5.4.2去除N端封闭基团的方法如果怀疑蛋白质或多肽的N端被封闭, 可用下述方法除去一些N端封闭的基团.(1) 去除N-乙酰丝氨酸和N-乙酰苏氨酸残基：将蛋白质吸附在PVDF膜上, 经蛋白质N端序列仪测定几个循环后, 在高校液相层析柱上为未能检测出N端氨基酸残基。然后将膜条置于1.5ml的小离心管中。加入50l TFA溶液后密封管口并在40保温1小时，打开管盖，在通风橱中让TFA挥发干净。然后将此膜条放回序列仪中重新进行分析。,(2)去除N-端甲酰甲硫氨酸中的甲酰基：将蛋白质吸附在PVDF膜上，并置于1.5ml离心管中，加入30l 0.6mol/L HCl，密封管口并于25保温24小时。打开管盖, 吸去HCl溶液, 再将膜条真空干燥或氮气吹干。然后将此膜条放回序列仪中进行分析.,（3） 除N-端焦谷氨酸:将吸附了蛋白质的PVDF膜条置于1.5ml离心管中, 加入1.2ml 0.5% (w/v) PVP-40封闭膜条, 使其不再吸附其他蛋白质(PVP溶于100mmol/L冰乙酸中), 37保温30分钟, 然后用超纯水清洗膜条至少5遍, 接着再用0.5mL酶解液漂洗一遍.加入100l左右焦谷氨酸水解酶5g酶溶于100l 50mmol/L pH7.0磷酸缓冲液(内含10mmol/L DTT), 37保温5-10小时，用超纯水漂洗膜条, 自然吹干。然后将此膜条放回序列仪中进行分析。,(1) 去除N-乙酰基封闭的氨基酸残基将吸附了蛋白质的PVDF膜条置于1.5ml离心管中，用0.5%PVP-40封闭膜条, 防止其吸附蛋白酶(PVP溶于100mmol/L冰乙酸)，将膜用超纯水充分清洗后，加入5-10g胰蛋白酶(溶于100L 0.1mol/L碳酸氢铵,pH8.0, 内含10%乙腈), 37酶解24小时，离心管中的溶液移至另一个干净的离心管中, 用100l超纯水清洗膜条后，将此清洗溶液与酶解后的溶液合并, 然后将此含有酶解多肽的溶液冷冻干燥。加入100l 50%吡啶及10L异硫氰酸苯酯(PITC), 通入氮气20秒, 于60保温1小时。,此步骤中PITC可以和酶解后各多肽的N端氨基反应(除去N端被乙酰基封闭的多肽)，加入50l苯/乙酸乙酯(1:1 v/v, 混合溶剂, 充分振荡后于3000g离心1分钟。吸去上层溶液(内含第六步中的过量试剂及反应副产物). 再按第六步对下层溶液抽提三次, 然后真空抽干下层液，加入100l过甲酸(按甲酸:过氧化氢=9：1比例混合，室温放置1小时), 于0保温1小时, 以封闭经过上述几步反应的多肽的N端。,5蛋白质C-末端序列测定51蛋白质N-末端序列测定的优点Edman降解是蛋白质与多肽序列分析的最佳选择, 此方法的使用使N端分析获得了巨大进步, 有如下优点:(1). 高度自动化(2). 灵敏度达pmol(3) 可以连续测定30-50个残基(产率90-98%)(4). 一次循环时间为30-60分钟, 每天可以测1-2种样品.,52. C-末端序列的意义(1). C-末端顺序是蛋白质完整一级结构的必需信息(2). 当蛋白质N-末端被甲酰基, 乙酰基, 焦谷氨基所封闭, 或在Edman降解过程中因副反应而封闭, 则不能在使用Edman方法(3). 是对N-末端测序的补充, 蛋白质两末端的精确测定, 是研究其化学性质的一把钥匙. 一些蛋白质C端与其生物活性密切相关,(4). DNA测序技术的快速发展, 需运用N端, C端信息来确定正确的起始密码子和阅读框架. 虽然大量的基因组DNA已被测序, 但蛋白质编码区的碱基序列是不连续的, 含有大量的内含子, 且存在着翻译后修饰.(5). 对确定新的蛋白质尤为重要.cDNA起始于3末端, 正好是蛋白质的C末端. 所以了解C末端结构对于DNA克隆有指导意义(6). 对预测的C末端进行确认,5.3测定方法 (1) 羧肽酶 最常用的方法是羧肽酶消化后, 定量分析所释放的氨基酸. 然而由于羧肽酶特异性复杂, 此法对于C末端测定模棱两可. 需要进行动力学分析, 因不同的水解速率而受到限制, 连续测定不超过3-5个氨基酸 (2) 化学法 N-TFA-肽/蛋白质与乙酸酐,吡啶反应, 得到互变异构体的混合物，水解后得到C末端氨基酸外消旋的多肽/蛋白质, 酶解为肽段混合物 (3) 仪器法 质谱(MS)与核磁共振(NMR)对于小肽适用.近年发展的(FAB-MS)法灵敏度很高, 达1-10nmol, 但是仪器昂贵. NMR需样量很大, mmol级.,