蛋白质印迹技术原理与操作流程Westernblotppt课件.pptx
Western blot 蛋白质印迹,实验原理与操作,Western blot这个名称的由来很有意思。最开始做印迹工作的是一个叫做Edwin Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot后来类似的出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个针对蛋白质，人们分别把这两种技术称为northern blot和Western blot，这两个技术的命名与发明人的名字没有关系了。,名称由来,蛋白质印迹是一种综合性的免疫学检测技术。电泳：它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量大小在凝胶上分离开转膜：然后利用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上抗体孵育：以固相膜上的蛋白质作为抗原，与对应抗体结合显影：经过底物显色或荧光成像等方法以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质。,概念,PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis):聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。此电泳有两种形式：SDS-PAGE：具有较高的灵敏度，根据蛋白质亚基分子量的不同即 可分离蛋白质，可以检测不到微克级别的蛋白质。Native-PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）：分析蛋白质结构，保 持其活性，使蛋白质在电泳过程中能够保持完整的状态。SDS: 阴离子型去垢剂，改变蛋白质构象，使蛋白质解体变性。 消除电荷因素，使电泳速率只与分子量大小有关。,SDS-PAGE,SDS：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于 它所带净电荷以及分子量。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子量，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。而阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别,一抗：能和抗原特异性结合的蛋白。 种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。二抗：能和抗体（一抗）结合，即抗体的抗体，并带有可以 被检测出的标记(如HRP辣根过氧化物酶）其主要作用是 检测抗体的存在，放大一抗的信号。,抗体,Electro-Chemi-Luminescence（ECL） 简称电化学发光。ECL试剂中含有反应底物过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP， 即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。,物品配制,配胶（分离胶，浓缩胶）配电泳液配转膜液配TBST,以10%分离胶为例：H2O 4.0ml30%AcrBis（29:1） 3.3ml1.5mol/L TrisHCL(PH=8.8) 2.5ml10%SDS 100ul10%AP 100ulTEMED 4ul总体积 10ml(2块胶的量，每块4.8ml),分离胶,H2O 2.0ml30%AcrBis（29:1） 0.5ml1.0mol/L TrisHCL(PH=6.8) 0.5ml10%SDS 40ul10%AP 30ulTEMED 4ul总体积 3ml(2块胶的量，每块1.2ml),5%浓缩胶,AcrBis: Acr是单丙烯酰胺，Bis是双丙烯酰胺。PAG是由Acr 和Bis在催化作用下交联形成的。TrisHCL:浓缩胶pH6.8，弱酸性，甘氨酸解离很少 。 分离胶pH8.8，呈碱性，甘氨酸大量解离。SDS: 阴离子型去垢剂，去多肽折叠，使蛋白质解体变性。 消除电荷因素，使电泳速率只与分子量大小有关。AP：催化剂，催化单丙和双丙烯酰胺聚合成聚丙烯酰胺。TEMED：四甲基乙二胺，有腥臭味，催凝剂，加速AP催化 作用（易挥发，强神经毒性）,成分解释,H20 400mlTrisHCL 1.2gGlycine(甘氨酸) 5.8gSDS 0.4gTrisHCL与Glycine构成电泳缓冲体系，稳定电泳过程的PH,电泳液,H20 400mlTrisHCl 1.5gGlycine(甘氨酸) 7.2g甲醇 100ml甲醇的作用：除去与蛋白质结合的SDS，防止蛋白不能转出来 降低电导，防止溶液过热,转膜液,H20 500mlNaCI 4.39gTrisHCl 1.21gTween 500ul纯HCl 500ul（通风橱操作）TBST= Tris-buffer saline(Tris缓冲盐溶液)+Tween 20Tween 20:能够将非特异结合的抗体洗掉，防止曝光时背景太高,TBST,操作步骤,电泳前准备-制胶,玻璃板对齐后放入架子中，两侧的夹子卡紧Tip:玻璃板下方可用封口膜封住，防止漏胶,电泳前准备-制胶,然后垂直卡在架子中，准备灌胶,电泳前准备-制胶,配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。用1ml枪头吸取5ml胶（1ml枪头上有200ul的刻度，最后一毫升剩200ul，即灌4.8ml胶）然后胶上加满水压平，液封后胶凝得更快（加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）,电泳前准备-制胶,当水和胶之间有一条线时（15min左右），说明胶已经凝固了。等待3min，使其充分凝固后将胶上层水倒去，并用吸水纸吸干。配5%浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。用1ml枪头灌胶加满。加满浓缩胶后立刻将梳子插入胶内,电泳前准备-制胶,均匀插入梳子，避免产生气泡,电泳前准备-制胶,大约10min，浓缩胶干后，用手拿住梳子的两边，均匀用力，拔起梳子,电泳前准备-放入电泳槽,将玻璃板从夹子上取下,电泳前准备-放入电泳槽,将玻璃板放入电泳槽夹子中。小玻璃板向内，大玻璃板向外注意：小玻璃板两侧上部与夹子两侧凸起部分紧密接触，防止漏液,电泳前准备-放入电泳槽,另一边也插入玻璃板，也是小玻璃板面向内，大玻璃板面向外若只跑一块胶，则槽另一边要垫一块塑料板，且有字的一面面向外,电泳前准备-放入电泳槽,放入电泳槽中,电泳前准备-加电泳液,向内槽中加电泳液，如果不漏，再向外槽中加电泳液；如果漏液，则要重新把玻板插好，使内外不交通。电泳液至少要漫过内侧的小玻璃板，继续加把气泡冲走。,电泳前准备-上样,从-20冰箱取出蛋白样品（加入5上样缓冲液和5min沸水处理后），室温融化，上样前涡旋均匀，通过计算好的蛋白上样量进行上样（提取蛋白时测浓度，计算上样体积），上样体积一般不超过15ul（上样不能太快，否则样品会冲出加样孔），每加一次样更换一次枪头。Marker每孔加2-5ul,电泳前准备-上样,电泳,恒压： 浓缩胶电泳：80V 30min 分离胶电泳：120V 70min,电泳,转膜前准备-配转膜液,配制转膜液，先不加甲醇，待转膜接电源前加入（甲醇易挥发）将转膜液倒入一部分于搪瓷盘中，准备切胶（保持胶湿润）,转膜前准备-剪膜,PVDF膜：蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物，分子量大于20000的蛋白选 用0.45um的膜，小于20000的蛋白选用0.2um的膜。使用前需用甲醇 浸润片刻，目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白 结合。宽：1.5cm 长：根据孔数来测量,转膜前准备-切胶,转膜前准备-切胶,转膜前准备-切胶,湿式转膜“三明治”,白夹子接正极，黑夹子接负极（黑胶白膜）,转膜,确保黑白板子对齐，合起夹子,转膜,把夹子放入转膜槽中，确保夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面,转膜,转膜时会大量产热，放入冰盒用以降温；加入转膜液，并把甲醇倒入,转膜,盖上盖子，放入水桶或盆中，加满冰恒流：275mA 80min,转膜,转膜,打开夹子，取出膜，可见Marker已经转移到膜上,封闭,用TBST配制5%脱脂牛奶，将膜置于其中，于摇床上封闭1h。封闭剂：封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白，减少非特异染色和背景,抗体孵育-一抗,把从脱脂牛奶中拿出的膜用TBST清洗一遍，5%BSA配制一抗（按照稀释比例，如1：1000），置于装满冰的泡沫盒上，泡沫盒置于摇床上，孵育过夜或者37 3h,抗体孵育-二抗,第二天，TBST清洗10min3次，回收一抗5%脱脂牛奶配制二抗（按比例稀释，如1:5000），常温孵育1hTBST清洗10min3次,显影,最常用的显影方法：底物化学发光发法（ECL）显色原理：在ECL底物中没含有H2O2和鲁米诺，在HRP （辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光。操作过程： A液：B液=1：1 培养皿避光滴入200ul/AB混合液，将PVDF膜 放入培养皿充分浸润后，放入曝光机进行曝光。,结果,THANKS,
