质谱分析法ppt课件.ppt

质谱分析法,制作者: 张 中,Exactive LC/MS,ESQUIRE-HCT,ultrafleXtreme,参考书目:1. 谱学导论, 范康年主编,高等教育出版社 (2001).2. 质谱解析, 麦克拉弗蒂著,王光辉等译,化学工业出版社(1987).3. 电喷雾质谱应用技术,帕拉马尼克等主编,蒋宏键等译,化学工业出版社(2005).4.有机质谱解析, 王光辉等编著,化学工业出版社(2005).,1. 质谱分析方法简介2. 常见质谱仪器的选择应用3. 质谱分析过程与样品的制备4. 质谱谱图解析及分析结果的表示,一、质谱分析方法（MS）简介,1. 概述 质谱法(Mass Spectrometry, MS) 是通过将样品转化为运动的气态离子并按质荷比(m/z)大小进行分离并记录其信息的分析方法。 被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。,离子的质量谱,以带电粒子即离子的质荷比为横坐标, 以离子的相对丰度(相对强度）为纵坐标所构成的图谱。,某一蛋白的质谱图,2. 发展简史1910年：Thomson使用MS报道了Ne是由20Ne和22Ne两种同位素组成，同位素分析测定开始发展；40年代：出现了第一台商品质谱仪，质谱进入了工农业生产领域，用于石油工业中烃的分析、人造橡胶生产过程控制；50年代：质谱技术飞速发展，并广泛用于复杂有机混合物的结构分析，与NMR、IR等方法结合成为分子结构分析最有效的手段。80年代：出现了一些新的质谱技术，如快原子轰击电离源，基质辅助激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学电离源，以及随之而来的比较成熟的液相色谱-质谱联用仪，感应耦合等离子体质谱仪，富立叶变换质谱仪等。这些新的电离技术和新的质谱仪使质谱分析又取得了长足进展。,Wolfgang Paul,Hans G. Dehmelt,Joseph J. Thomson,Francis William Aston,1906年诺贝尔物理奖,1922年诺贝尔化学奖,1989年诺贝尔物理奖,离子阱技术,用质谱发现同位素,电荷在气体中运动,2002年诺贝尔化学奖获得者,日本科学家田中耕一(Koichi Tanaka)1959年出生于日本富山县首府富山市，1983年获日本东北大学学士学位，现任职于京都市岛津制作所，为该公司研发工程师，分析测量事业部生命科学商务中心、生命科学研究所主任。他对化学的贡献类似于约翰芬恩，因此也得到了14的奖金。,美国科学家约翰芬恩1917年出生于美国纽约市，1940年获耶鲁大学化学博士学位，1967年到1987年间任该大学教授，1987年起被聘为该大学名誉教授，自1994年起任弗吉尼亚联邦大学教授。他因为“发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法”和“发明了对生物大分子的质谱分析法”而获得今年诺贝尔化学奖14的奖金。,3. 质谱分析的内容（1）同位素质谱分析 天然同位素发现和测定； 同位素地质研究； 研究有机反应机理及生物体； 新陈代谢机理,（2）无机质谱分析 元素的定性、定量分析； ICP（电感应偶合等离子体）-MS联用可准确检测各种元素 固体样品“立体”分析； 表面、微区、逐层分析,（3）有机质谱分析 有机化合物结构和成分分析，为有机物结构分析的“四大谱”之一。 提供有机化合物分子量及碎片离子的结构信息； 高分辨率条件下，具有元素分析功能； 与气相、液相色谱仪连用，使质谱成为天然产物、代谢产物、食品、药品分析的有效工具,4. 质谱仪的组成,进样系统,离子源,真空系统,质量分析器,检测器,数据处理 系统,离子源,质量分析器,（1）离子源 离子源的作用是将欲分析样品电离，得到带有样品信息的离子。,不同分子离子化所需要的能量差异很大，应选择不同的离解方法,软电离方法 能量的较低电离方法 适用于易破裂或易电离样品,硬电离方法 能量较高的电离方法,各种离子源的基本特征,电子电离源(Electron Ionization EI) 电子电离源又称EI源，是应用最为广泛的离子源，它主要用于挥发性样品的电离。,注：谱图中可见分子离子，但碎片离子更常见,M+e-(高速) M+ +2e（低速）,优点： (1) 应用最广，标准质谱图基本都是采用EI源得到的； (2) 质谱图再现性好，便于计算机检索及比较； (3) 结构简单，操作方便。 缺点： (1) 质谱图中分子离子峰很弱或不出现（由于电子的能量高，分子离子进一步离解成碎片离子）; (2) 样品必须易于气化,不适合极性大、热不稳定化合物。,EI源：可变的离子化能量 (10-240eV),对于易电离的物质降低电子能量，而对于难电离的物质则加大电子能量（ 常用70eV ）。,电子能量,电子能量,分子离子增加,碎片离子增加,电子能量,电子能量,产生的分子离子种类 M+ 或M- ,化学电离源(Chemical Ionization , CI ),化合物稳定性差，用EI方式不易得到分子离子,因而也就得不到分子量。为了得到分子量可以采用CI电离方式。 用高能电子（100240eV）轰击离子室内的反应气（甲烷；10100Pa） ，电离产生CH5+和C2H5+，后者再与样品分子碰撞，产生准分子离子。,注：谱图中常见准分子离子,优点：1）准分子离子峰强度高，便于推算分子量2）色质联用仪器，载气不必除去3）反映异构体的差别较EI谱要好些。缺点：碎片离子峰少，强度低。,化学电离是通过离子-分子反应来完成的。反应气体一般是甲烷、异丁烷等。,产生的分子离子或准分子离子种类不同类型的分子能被特定的正或负反应离子有选择地电离。例如，胺和醚等含杂原子的分子通常产生大量的M+H+,而饱和烃则常产生M-H+等。,脯氨酸的EI和CI源的质谱图,采用EI源时脯氨酸的分子离子峰(m/z=115)未出现,但碎片离子多，从中可获得许多有用的结构信息；采用CI源时准分子离子峰(M+1)很强，从而获得相对分子质量的信息。,电喷雾电离源（Electrospray Ionization，ESI）,它的主要部件是一个多层套管组成的电喷雾喷咀。电场作用下使喷出的液体易分散成微滴。另外，在喷嘴的斜前方还有一个补助气喷咀，补助气的作用是使微滴的溶剂快速蒸发。在微滴蒸发过程中表面电荷密度逐渐增大，当增大到某个临界值时，离子就可以从表面蒸发出来。,适合于分析不稳定的极性化合物和生物大分子注：质谱图中常见准分子离子,形成带电小液滴,溶剂蒸发和小液滴碎裂,形成气相离子,加到喷嘴上的电压可以是正，也可以是负。通过调节极性，可以得到正或负离子的质谱。 软电离方式，分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它用于分析极性强的大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。这样，一个分子量为10000Da的分子若带有10个电荷，则其质荷比只有1000Da，进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点，目前采用电喷雾电离，可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质。,产生的准分子离子种类低分子量化合物: 正离子: (M+H)+ (M+NH4)+ (M+Na)+ (M+K)+ 负离子: (M-H)- (M+Cl)- (M+Br)- (M+Ac)-生物大分子与聚合物： 正负多电荷离子 (M+nH)n+ 或 (M-nH)n- 正负簇合物离子的(nM+H)+ 或 (nM-H)-,大气压化学电离源(Atmospheric pressure chemical Ionization, APCI) 结构与电喷雾源大致相同，不同之处在于APCI喷咀的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+ 和O+ 等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化，这些反应过程包括由质子转移和电荷交换产生正离子，质子脱离和电子捕获产生负离子等。,适合于分析中性与极性较小的化合物,尤其是挥发性化合物注：质谱图中常见准分子离子,产生的准分子离子种类 正离子: (M+H)+ (M+NH4)+ (M+Na)+ (M+K)+ 负离子: (M-H)- (M+Cl)- (M+Br)- (M+Ac)- 离子种类更多,基质辅助激光解吸源（Matrix-Assisted Laser Description Ionization ，MALDI） 激光解吸源是利用一定波长的脉冲式激光照射样品使样品电离的一种电离方式。被分析的样品置于涂有基质的样品靶上,激光照射到样品靶上,基质分子吸收激光能量，与样品分子一起蒸发到气相并使样品分子电离。可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。,适合于分析生物大分子，分子量可达数十万至百万质量数。如肽、蛋白质、核酸等，需要选择合适的有机酸或甘油作为基质。注：质谱图中常见分子离子或准分子离子,优点： 可用于难于电离的样品，无明显的碎裂； 允许样品中含非挥发性组分； 特别适用于与飞行时间质谱相配 （MALDI-TOF MS）。缺点： 基质的选择烦琐； 制样过程要求高。,产生的分子离子或准分子离子种类(M+H)+ 或 (M-H)- （类似于FAB法中由质子转移反应得到的离子）(M+Na)+ ， (M+K)+ 等,（2）质量分析器 将离子源中生成的各种离子按质荷比mz分离。不同类型质谱仪区别主要在于此。质量分析器的主要类型有： 磁分析器、飞行时间分析器、四极滤质器、离子捕获分析器、离子回旋共振分析器。,四极滤质器 (Quadrupole Mass Filter),通过加在四极杆上的交变电压，改变电压和频率进行扫描。从而允许一定质量的离子通过四极场到达接受器（是电场扫描）。 m/z=2E/v2 其中：E=电压（离子动能），v =离子速度,利用相同能量的带电离子，由于质量的差异而具有不同速度的原理，实现不同质量的离子以不同时间通过相同的漂移距离（领域）到达接受器。 m/z=2E/v2, v=d/t 代入左式得到 m/z=Kt2 (k =2E/d2) (d：飞行距离；t：飞行时间 ),m/z小的离子，漂移运动的速度快，最先通过漂移管，到达检测器。,m/z大的离子，漂移运动的速度慢，最后通过漂移管，到达检测器。,离子阱质量分析器（Ion Trap Mass Analyzer）,通过电场或磁场将气相离子控制并贮存一段时间的装置。特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器；结构简单、成本低且易于操作，已用于GCMS联用装置用于m/z 2002000的分子分析。,静电轨道阱(Orbitrap Mass Analyzer),两个电极之间形成静电场。当高速运动带电离子进入Orbitrap内，在静电作用下围绕中心电极做圆周轨道运动，不同的离子在z方向形成不同频率z与（m/z）1/2 成正比。检测器检测离子运动形成的电势，经过信号放大和快速傅立叶变换后形成频谱，经过处理最后形成质谱。,5. 质谱仪的性能指标 （1）质量测定范围 质谱仪所能够进行分析的样品的相对原子质量（或相对分子质量）范围，通常采用原子质量单位u(Da)度量。 有机质谱仪一般可达几千。现代质谱仪甚至可以研究相对分子质量达几十万的生化样品。ESI-MS质谱的测定范围可达到3000, 扩展模式下可达到6000.,（2） 分辨率 指质谱仪分辨相邻质量数离子的能力。 定义为：两个相等强度的相邻峰(质量分别为m1和m2)间的峰谷不大于峰高的10%时，则可认为两峰已分开，其分辨率R为： 其中m1、m2为质量数(m1m2),两峰质量数较小时，要求仪器分辨率越大。可见在质量数小时，分辨率亦较小。 实际工作中，很难找到相邻的峰高相等、峰谷又为峰高的10的两个峰。可任选一单峰，测其峰高50处的峰宽FWHM当作m，此时 R = m/ m 质谱仪的分辨本领与离子通道半径r、加速器和收集器狭缝宽度、离子源的性质和质量等因素有关。,（3）灵敏度 仪器对样品在量的方面的检测能力（检出限）。 绝对灵敏度：在记录设备上得到可检测信号所需要的样品量； ESI: f mol-p mol 相对灵敏度：可检测到的微量杂质的最小相对浓度。,（）峰形（）精密度和准确度,二、常见质谱分析方法的选择 根据研究特点以及所需获取的信息选择合理的质谱仪器进行样品分析,1. 高分辨质谱仪（HRMS） 有机化合物元素组成以及精确相对分子质量的测定 高分辨一般要求测定的质量数达到小数点后4位，测量值和计算值之差除以分子量结果小于5ppm 如FT-ICR MS（傅立叶变化离子回旋共振） Orbitrap (静电场傅立叶变换质谱) 可用于确定化合物分子的元素组成，代替元素分析,静电轨道阱质谱（Orbitrap）,2. 电子轰击电离源质谱（EI-MS）或串联质谱（MS/MS）获取碎片离子，对小分子有机化合物进行结构分析，判断其所含官能团EI源质谱的分析中分子离子的碎裂有确定的机理，能合理推断出化合物的结构；目前得到的大部分已知有机化合物的标准质谱图均由EI源质谱获得，可将所获得的质谱与标准谱图进行对比，确证其是否是目标产物,22900小分子有机化合物的标准EI-MS图谱http:/www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/direct_frame_top.cgi?lang=eng,利用ESI-MS的串联质谱功能（MS/MS） ，也可以获得化合物的碎片离子，进行结构分析 优点：可将任意一个母离子隔离出来打碎获得碎片离子，以获取其结构信息；具有多级串联功能 缺点：无成熟确定的断裂机理；无标准谱图进行比照,3. 感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS） 无机物的元素分析、同位素示踪、环境样 品的分析 ICP作为质谱的高温离子源（7000K），样品在通道中进行蒸发、解离、原子化、电离等过程。,4. 气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)和高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS) 复杂有机物（如天然产物）的分离纯化与定性、定量及结构分析 色谱用于分离纯化与定量分析；质谱用于定性及结构分析（依据碎片离子的种类和分子离子的断裂方式） GC: 300以下汽化样品 HPLC: 300以上汽化样品,5. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS) 检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物 软电离新型有机质谱，通过引入基质分子，使待测分子不产生碎片，解决了非挥发性和热不稳定性生物大分子解吸离子化的问题，是分析难挥发的有机物质的重要手段之一 ,可测定生物大分子的分子量高达600KDa,三. 质谱分析过程与样品的制备,ESI-MS质谱分析过程,调节氦气、氮气压力,打开仪器电源，开启电脑工作站,打开仪器操作软件，调节氦气、氮气流量,进入工作状态，检查真空度，调节工作参数,进样,采集谱图,抽真空过夜,保存谱图,制样： 将纯化好的微量固、液体样品溶于100-200ul基质液（纯H2O、甲醇、乙腈或50%H2O，50%乙腈，按0.1%加甲酸）； 组成基质液的有机试剂应达到级，H2O应为超纯水（18.2Mcm ）； 样品中不能含有固体颗粒，否则需通过微孔滤膜过滤除去。 注：未经测试人员允许，不得使用DMF、DMSO等强极性溶剂以及强酸性、强碱性介质溶解样品,四. 电喷雾质谱谱图解析及分析结果的表示,(1)常用术语 基峰: 质谱图上最强的离子峰,相对丰度定为100。 质荷比: 离子的质量数与所带的电荷之比。 精确质量: 基于天然丰度最大的同位素的精确原子 量计算得到的离子的质量数。 相对丰度：原始质谱图上最强的离子峰为基峰， 100%。其它离子峰与此基峰的相对百 分值表示。,分子离子: 样品分子丢失一个外层价电子而形成的 带正电荷的离子，称为分子离子,记为M.+。准分子离子: 通常指分子获得一个质子或失去一 个质子产生的离子，如(M+H)+、(M-H)-。碎片离子: 分子离子的化学键断裂失去一个自由基或 中性分子产生的离子。重排离子: 分子离子裂解过程中伴随着分子内原子或 基团的重排所形成的特殊碎片离子。同位素离子: 元素具有非单一的同位素组成时，由同 位素所组成的离子蜂。多电荷离子: 样品分子丢失两个或两个以上的电子而 形成的的离子。,分子离子峰,基峰,碎片离子峰,分子离子峰的识别 在质谱图中，分子离子峰应是最高质荷比的离子峰。 （同位素离子及准分子离子峰除外）。 分子离子峰是奇电子离子峰。 分子离子能合理地丢失碎片（自由基或中性分子）。 符合氮律： 当化合物不含氮或含偶数个氮时，分子量为偶数； 当化合物含奇数个氮时，该化合物分子量为奇数。,离子流强度有两种不同的表示方法: （1）绝对强度 是将所有离子峰的离子流强度相加作为总离子流，用各离子峰的离子强度除以总离子流，得出各离子流占总离子流的百分数（2）相对强度 以质谱峰中最强峰作为100，称为基峰（该离子的丰度最大、最稳定），然后用各种峰的离子流强度除以基峰的离子流强度，所得的百分数就是相对强度。,m/z14 (4.0) m/z 28 (100) m/z 33 (0.02) 16 (0.8) 29 (0.76) 34 (0.99) 20 (0.8) 32 (23) 40 (2.0) 44 (0.10)括弧中的数字即峰的相对强度，表示100者是基峰，N2在空气中含量最高而且也最稳定。（32）是O2，在空气中占1/5，N2占4/5，N2的峰高为100，O2就占N2的23。,（2）同位素离子峰 除少数元素外,大多数元素具有天然存在的稳定同位素，所以在质谱图上出现一些M+1，M+2的峰，由这些同位素形成的离子峰称为同位素离子峰。,一些同位素的自然丰度,A元素A+1元素A+2元素,同位素离子峰的强度 由于各种元素同位素的天然丰度不同，它们形成的同位素峰的强度也不相同;此外同位素峰的强度不仅与重同位素天然丰度有关，还与分子所含元素的数目有关。同位素离子峰簇 分子离子峰M与由重同位素贡献的M+1、M+2峰构成同位素离子峰簇。同理,准分子离子以及碎片离子也存在同位素离子峰簇。,1）只含C、H、O、N化合物: 只含C、H、O、N元素的化合物中，它们的重同位素的丰度都较小，同位素峰很弱。,2）含Cl、Br和S化合物: A+2元素,同位素丰度大,M+2峰明显 35Cl37Cl=10032.5； 79Br81Br=10098； 32S34S=1004.42,（4）ESI-MS谱图的解析 A. 判断高m/z区域的质谱峰是否为准分子离子 峰。若为准分子离子，则可由对应的m/z值 推算化合物的相对分子质量 由预期合成的化合物的相对分子质量推测,小分子有机化合物: ESI(+): 可形成(M+H)+、(M+NH4)+、 (M+Na)+、(M+K)+型准分子离子 ESI(-): 可形成(M-H)-、(M+Cl)-、(M+Br)-、 (M+Ac)- 与化合物的合成条件以及所含有的基团有关 如ESI(+)出现(M+H)+谱峰,则可由m/z-1.01 计算出化合物的相对分子质量,167.0,MW = 107.0-1.0 = 106.0,(M+H)+,有机聚合物以及生物大分子 ESI谱图中一般出现正负多电荷离子 (M+nH)n+或 (M-nH)n-的质谱蜂 可利用三种方法求算大分子化合物的相对 分子质量： 联立方程求算法； 分辨同位素峰法； 数据转换法（去卷积拆分）法,MW = 857.4710 -10.1 = 8564.6,(M+10H)10+,单核或多核配合物 若含有抗衡阴离子X- ESI(+): 有可能形成(M-X)+型离子 若含有L-阴离子配体 ESI(+): 有可能形成(M-L)+型离子 ESI(-): 有可能形成(M+L)-型离子 多核配合物也可能形成多电荷离子 可由同位素峰簇中相邻谱峰m/z差值判断： m/z值相差约时，其为一价离子； m/z值相差约.时，其为二价离子； m/z值相差约.时，其为三价离子注：尽管不一定能够得到配合物的准确分子质量，但仍可判断配位主体（内界）是否形成,单核配合物ZnL(ClO4)2,m/z 182.2 M-2(ClO4)2+ m/z 463.0 M-(ClO4)+,配位聚合物 从ESI谱图中只能找出碎片离子峰 注：可由碎片离子组合成完整的聚合物分子注意： 高m/z区域也可能出现对应于(nM+H)+或(nM-H)-的加和物或簇合物离子峰 （可由预期合成的小分子化合物的分子量判断，一般为分子量的倍数+1或-1）,利用高分辨质谱仪给出精确分子量，以推出分子式,B. 推断小分子有机化合物的元素组成,表示:Negative ion ESI-MS: m/z 291.0 M-H- m/z 313.0 M-2H+Na- m/z 144.6 M-2H2-,EDTA,（4）ESI-MS谱图分析结果的表示,单核配合物ZnL(ClO4)2,L的相对分子质量=300.2,表示:Positive ion ESI-MS: m/z 182.2 M-2(ClO4)2+ m/z 463.0 M-(ClO4)+,b:测定同位素峰簇c:拟合同位素峰簇,注意:同位素峰簇中相邻谱峰的质荷比相差0.5,可推断该同位素峰簇对应的离子为二价离子,某一蛋白的质谱图表示:Positive ion ESI-MS: m/z 857.47 M+10H10+,HRMS Anal. Calcd for C18H25ClN5O3 (MH+): 394.1646. Found: 394.1644.,8f,HRMS谱图分析结果的表示,ESI-MS(methanol) m/z: 987.6 12NO32+, 637.7 1NO33+, and 462.8 14+.,人血清白蛋白,MALDI-TOF-MS m/z:66645.7 M+H+,