第十二章实验动物胚胎工程技术ppt课件.ppt

第十二章 实验动物胚胎工程技术,第一节 概 述,胚胎工程又称胚胎技术，是指利用生物工程学的原理对动物的胚胎进行某种技术操作或改造，使之获得人们所需要动物的一系列生物技术的总称。胚胎工程主要分为四大体系：第一类：胚胎操作基本技术，包括超数排卵、精子和卵母细胞的采集、体外受精、胚胎培养、胚胎的冷冻保存、胚胎性别鉴定和胚胎移植技术；第二类：动物克隆技术，包括胚胎分割、细胞核移植技术； 第三类：胚胎干细胞技术；第四类：转基因技术。,胚胎工程是生物工程的一个分支，是动物细胞工程的拓展与延伸，胚胎工程技术除了作为研究胚胎的分化和发育的方法和手段外，当前更多地作为一种先进技术应用于以下几个方面：1.在畜牧业方面 通过建立超数排卵、受精卵/卵母细胞的采集、体外受精、胚胎切割、胚胎性别控制、体细胞克隆以及胚胎移植技术，加快良种家畜的繁殖和家畜品种的改良。2.在医学方面 通过建立卵母细胞的采集、体外受精、显微受精以及胚胎移植技术，用于不孕症的治疗；通过对胚胎培养和检测，剔除具有遗传性疾病的胚胎，达到优生优育目的。,3.在生命科学研究方面 阐明哺乳动物早期胚胎发生及其发育机制等基础理论。4.在生物制药方面 通过转基因技术将具有药用价值的生物活性蛋白的基因整合到宿主的染色体上，使其在乳汁、血液、尿液等体液中表达。通过收集、纯化这些体液中的生物活性蛋白，用于预防和治疗某些人类的疾病。5.在拯救濒危野生动物方面 通过野生动物生殖细胞和组织的冷冻保存、体细胞克隆和胚胎移植技术，扩大野生动物的种群。,6,第二节 胚胎操作基本技术,胚胎操作基本技术：一、精子、卵母细胞、早期胚胎的采集和超数排卵二、体外受精三、胚胎性别控制四、胚胎培养五、胚胎移植 六、胚胎冷冻保存,一、精子、卵母细胞、早期胚胎的采集和超数排卵 是胚胎工程最基本的技术。胚胎工程的其他技术均需从卵母细胞和受精卵的采集技术开始。1.精子的采集 啮齿类小动物，如大、小鼠，可将动物处死后，分离附睾尾部，用眼科剪子在顶端剪一小口，用手指轻柔挤出浓稠的液滴，置培养液中培养。 大动物，如犬的精液采集可采用生物电刺激方法促进雄性射精，收集精液。,解剖取附睾尾部,精子的获取和培养,10,2.卵母细胞的采集 从哺乳动物获得成熟的卵母细胞，主要途径有两条：获取体内成熟并排到输卵管中的卵母细胞，需处死动物或通过外科手术；如果已交配，获取的是受精卵或早期胚胎。从刚死亡的雌性动物卵巢中分离卵母细胞，体外培养。,小鼠解剖取输卵管,从输卵管壶腹部取卵母细胞/受精卵的方法,11,3.超数排卵： 在正常情况下，哺乳动物一次排卵数极其有限，单胎动物一次排卵一枚，多胎动物如小鼠一次平均排卵810枚，家兔一次平均排卵9枚。为了获得大量的胚胎，可通过注射激素刺激卵巢大量排卵，常用激素有促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和孕马血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素（PG）等，最常用的是前三种。 经超数排卵处理，动物卵巢大量的卵泡同时成熟并排出，排卵数可增加几倍至十几倍，一次可获得大量的卵细胞、受精卵或早期胚胎。,以小鼠的超数排卵为例，成熟雌性小鼠，中午1213时用孕马妊娠血清（PMSG）腹腔注射5单位/只。48小时后用人绒毛膜促性腺激素（hCG）腹腔注射5单位/只，进行超数排卵。,二、体外受精 体外受精是指成熟的精子与卵母细胞在体外环境下完成受精的过程。以小鼠为例：1）进行超数排卵：PMSG和hCG注射 2）处死，取出输卵管壶腹部采集卵母细胞。将新鲜采集的精子在培养液中培养1小时后，以适当的浓度移入有卵母细胞的培养液滴中。如受精，45小时后受精卵中可见明显的雄性原核，第二天受精卵发育成二细胞胚胎。,体外受精不仅是研究受精及早期胚胎发生的重要手段，而且广泛应用于人类生殖障碍、家畜品种改良等方面。试管婴儿：若夫妇两人，生殖细胞能正常产生，但就是生不出孩子怎么办？ 把卵子和精子都拿到体外来，让它们在体外人工控制的环境中完成受精过程，然后把受精卵移植到女性的子宫中，在子宫中孕育成为胚胎。,世界上第一个试管婴儿路易斯-布朗,1992年我国首例三胞胎试管婴儿,广州8胞胎-试管婴儿 连中八元,三、胚胎性别控制 是畜牧业生物技术中一项重要的高新技术。这项技术的应用可以使畜牧上大动物的繁殖按照人们的意愿只生产同一性别动物，例如奶牛、奶羊等的生产按照人们的意愿只生产母畜，可以显著提高奶牛的繁殖效率，获得可观的经济效益。,在医学上对人类性别控制的研究也具有积极的意义。有的遗传性疾病属于性连锁遗传，例如进行性肌营养不良，为X连锁隐性遗传，男性发病，女性携带异常基因但不发病。携带此致病基因的女性怀孕后如做胚胎性别鉴定，可避免男性患儿出生。 正常情况下，法律禁止对胎儿性别进行控制！,性别控制技术主要有3种不同的途径：1.分离X精子与Y精子：流式细胞光度法2.对胚胎进行鉴定以控制性别：在胚胎移植前对胚胎的部分组织用染色体检查、间接免疫荧光法和PCR法进行性别鉴定。其中PCR法具有高效、快速的特点。3. 改变酸碱度： 酸性环境下X型精子活力强，碱性环境下Y型精子活力强，如雌性动物喂食酸性饲料，子代雌性动物可能性大，喂食偏碱性饲料，子代雄性动物可能性大。同样原理，交配前用酸性溶液冲洗阴道，子代雌性动物机会多；用碱性溶液冲洗阴道，子代雄性动物机会多。,四、胚胎培养: 胚胎培养是指将获得的未成熟的卵母细胞、受精卵、冷冻保存胚胎在体外人工创造的环境中培养成熟，并通过体外受精发育成各阶段的早期胚胎。 研究胚胎发育的环境和条件，揭示胚胎细胞的生长发育和分化的奥秘。 但体外胚胎培养只能发育到受精卵的囊胚期，然后必须移植到动物的子宫内。,五、胚胎移植 胚胎移植技术是胚胎工程技术的最后一步，体外受精、胚胎分割、转基因动物、克隆动物等任何一项生物技术所生产的胚胎，最终都必须移植到受体动物的生殖管道一定部位，继续生长、发育、分娩出生仔代动物。 显然，在同一物种动物之间进行胚胎移植更易于成功。,在畜牧业方面： 牛奶营养丰富，但普通奶牛的产奶量低。现在如果从国外购进几头高产的荷斯坦奶牛，有什么技术可以让这些高产的奶牛短时间内快速繁殖成一个群体呢？胚胎移植技术（借腹怀胎）。,胚胎移植技术的应用,供体：只产生具有优良遗传特性的胚胎,受体：担任漫长繁重的妊娠和育仔任务,23,问题1： 将准备移植的荷斯坦奶牛胚胎，移植到另外一头普通母牛的子宫内，一定能发育吗？ 供体母牛和受体母牛必须具备相同或相似的子宫内生理环境，供体的胚胎移入受体子宫后，才能存活和发育，这是胚胎移植成功的生理学基础。因此，胚胎移植也可以看成是早期胚胎在相同子宫内环境条件下空间位置的转移。,问题2： 怎样才能使供体母牛和受体母牛具备相同或相似的子宫内生理环境？ 同期发情处理，使胚胎移植中的供体和受体几乎同步性的出现卵泡期、排卵期和黄体生成期，这样才能使两者体内的子宫内膜的状态、各种激素水平都具有一致性，保证移植后的胚胎具有最合适的发育环境，是胚胎移植成功的基本条件。 注射孕激素等，延长黄体期，抑制卵泡发育; 前列腺素，溶解黄体，促使卵巢进入卵泡期。,供体母牛,超数排卵,配种,收集受精卵,受体母牛,质量检查、培养,同期发情处理,发情,胚胎移植,妊娠,有价值的后裔,受体公牛,奶牛胚胎移植技术路线示意图,26,同一种属内的不同品种品系可互相进行胚胎移植。如近交系C57BL/6J小鼠的胚胎可移植到雌性封闭群ICR的生殖管道内；日本大耳白兔的胚胎可移植到雌性新西兰兔的生殖管道内。这一特点在畜牧业很有价值，如为了加快良种奶牛的繁殖，可将良种奶牛的胚胎移植到普通黄牛的生殖管道内，借腹怀胎。,胚胎移植技术的新进展：,六、胚胎冷冻保存 指在低温（-196）条件下利用低温保护剂保存生殖细胞及胚胎的一门技术。目前应用的低温保护剂有二甲基亚砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮(PVP)、甲醇、乙二醇、羟甲基淀粉（HES）等。 可以避免或减少结冰的程度与速度，降低细胞周围未冻结溶液中的电解质浓度，从而避免或减少胚胎冷冻过程中所发生的物理和化学损伤。 自1972年以来，世界各地已有小鼠、大鼠、田鼠、兔、山羊、绵羊、牛、马、狒狒等20多种动物的胚胎被成功地冷冻保存。,28,液氮罐,胚胎冷冻保存技术的应用 （1）应用于实验动物的保种和珍稀或濒危动物种质保存。（2）应用于实验动物的长途运输。（3）应用于实验动物的生物净化。 被病原体感染的实验动物的生物净化，一般采用子宫切开术，取出胎仔由无菌动物或SPF动物代乳。但是这种方法成功率并不高，而且较为麻烦。通过胚胎冷冻、胚胎移植等技术，可以使生物净化变得更简便和安全。,（4）应用于实验动物育种和野生动物实验动物化。 胚胎克隆技术、体细胞克隆技术结合胚胎冷冻技术，已经应用于实验动物和其他动物的育种，可以缩短育种时间，可以克服野生动物进入实验室后因环境改变而交配困难，可以利用极少量的原种繁殖出大量的后代，可以克服杂交障碍而实现基因的种间转移(如转基因动物等)。,胚胎移植实现了优良性状个体的繁育，如果我们能确定某个胚胎将发育为非常理想的个体，那么有没有办法让这样的一个胚胎一次性地繁育更多的个体？,思考,第三节 动物体细胞克隆技术,一、克隆的定义,克隆（Clone）是指一个细胞或个体通过无性繁殖（不经过两性生殖细胞的结合）方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。 无性繁殖在植物中很常见，如孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖；植物的根、茎、叶等经过压条、扦插或嫁接等方式产生新个体。,关于动物无性繁殖的设想，吴承恩在西游记中已有精彩的描述孙悟空经常在紧要关头拔一把猴毛变出一大群猴子，用今天的科学名词来说就是孙悟空能迅速将自己身体的一部分克隆成自己，用现在的理论来解释，就是通过对猴毛中含有的蛋白质基因逆转录来进行克隆。 动物的克隆技术，经历了由胚胎细胞克隆动物到由体细胞克隆动物的发展过程。,二、动物克隆技术：1.胚胎分割2.细胞核移植 2.1 胚胎细胞核移植 2.2 胚胎干细胞核移植 2.3 胎儿成纤维细胞核移植 2.4 体细胞核移植,胚胎分割： 受精卵在发育为胚胎的过程中，早期未分化的胚胎细胞具有全能性，能够分化成发育所需的所有细胞，如果对其加以分割，再将分割的胚胎细胞分别加以培养，就能够发育出完整的新一代，由于这些后代来自同一胚胎，具有相同的遗传物质，因此胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一。,胚胎分割的最佳时期是受精卵发育到囊胚期，用分割针将胚胎切开，吸出其中的半个胚胎，直接移植给受体。,对囊胚期的胚胎进行分割时，为什么要均等分割？,囊胚期的内细胞团将来要发育成胎儿的各种组织，是胚胎本身的基础细胞。如果分割时不能将内细胞团均等分割，会出现含内细胞团多的部分正常发育的能力强，少的部分发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题。所以要将内细胞团均等分割。,问题,分割的份数越多，操作的难度会越大，移植的成功率也越低。目前多采用2分割与4分割技术。,胚胎移植胚胎分割？,思考,（后代少）,（后代多，但不能无限分割）,（更多）,动物体细胞的形成不会像胚胎细胞那样受到时间和数量的限制；而且同一个个体所有体细胞都具有同样的遗传信息，因此，利用动物体细胞进行克隆，可以复制出比胚胎分割数量更多的优良个体。1.畜牧业育种；2.克隆能够生产特殊医药蛋白的转基因动物。3.利用个体克隆技术可以研究细胞发育过程中不同基因的表达规律和调节控制机理, 4.利用动物克隆技术可以获得足够量的动物器官，用于人类器官移植。5.延缓珍稀野生濒危动物的灭绝。,相对于通过胚胎分割克隆动物，通过细胞核移植来克隆动物，意义更大，因为生物的遗传信息DNA，主要存在于细胞核内，可以通过技术手段（显微操作技术）将一个动物的细胞核移植到另一个去核的动物细胞中，再通过胚胎移植，使之发育成个体。整个过程没有经过精子和卵子的受精，核移植动物的全部遗传信息来自供体核细胞，等于是复制了提供细胞核的动物。,。,卵母细胞 去核卵母细胞,Nucleus of stem cells or others,Nuclear Transfer TechnologyFor cloning,核移植,用于核移植的供体核来源细胞无论是早期胚胎细胞、胚胎干细胞还是胎儿成纤维细胞都有一个特点，即都是处在未分化或低分化状态，具有重新发育成个体的潜能，而且这种克隆都是子代动物的克隆，不存在伦理上的争议。但是成年体细胞核移植的成功却意义重大，它第一次推翻了长期以来人们认为的已经分化了的体细胞不再具有重新分化的能力，证明了即使是已分化了的成年体细胞在某种条件下也具有全能性，即可重编程序发育成一个新个体。我们一般所说的“克隆”主要是指成年体细胞核移植。,体细胞克隆羊”多莉”（动画）,在裸小鼠身上克隆出人耳,三、克隆动物的研究进展,克隆牛,克隆鼠,克隆山羊,克隆猫,2003年8月，我国首批本土自主克隆牛。,我国首例异种克隆羊2004年1月21日零时在新疆诞生。,胚胎细胞克隆兔在广西大学出生,在2000年美国的科学杂志上，科学家宣布，他们使用新的方法成功地克隆了一个恒河猴，这是与人类血缘最近的动物灵长目动物第一次被成功克隆。,美国科学家2003年5月宣布培育出一头克隆骡子。它头上戴有3个“世界第一”桂冠：第一个克隆的骡子，第一个克隆的马科动物，第一个克隆的杂种动物。科学家们说，该成果将有助于克隆其他自身繁殖有困难的濒危动物，对研究癌症等疾病也有重要的参考价值。,2003年12月22日，美国得克萨斯农业和机械大学公布了世界上第一头克隆鹿的照片。这一成果被认为在濒危鹿种保护等领域具有潜在应用价值。,目前，动物体细胞核移植技术还不很成熟，克隆成功率很低，克隆动物的先天性缺陷很多，这说明对克隆技术和克隆动物的研究还有许多问题尚待解决。,2003年2月14日，英国苏格兰爱丁堡罗斯林研究所的科学家宣布，全世界第一个克隆动物多利羊已经死亡，活了6年半。当科学家们发现它患上无法治愈的肺病后，决定实施“安乐死”让它长眠。 一般来说，一只绵羊平均可以活年，而多莉今年只有岁，寿命仅相当于普通羊的一半。,59,克隆技术的安全性也存在很大风险，克隆过程中无法避免基因变异的问题。在自然情况下，精子和卵细胞必须经过几个月才能成熟，这一过程绝大多数情况下是非常完美的，而克隆过程中的卵细胞必须在几分钟或数小时内，要完成通常花几个月或几年才能完成的“任务”。人为地加快了动物自然生殖过程，容易导致很多基因复制时出现一些错误，造成胚胎停止发育或基因变异，而在其诞生后产生许多生理问题。,60,克隆鼠、克隆牛、克隆猪等先后问世，甚至有些已经出现第6代复制品，但一些克隆动物生长过快，患了肥胖症，或是肺发育不正常。 更令人不寒而栗的是 “克隆人”，虽然目前克隆人引起的争议主要集中在伦理道德方面，但科学家指出，真正的问题是在于克隆人可能会出现基因变异，导致致命的生理问题。 综上所述，克隆技术虽然很神奇，但它是一把“双刃剑”，它诱人的地方也就是最危险的地方。,61,第四节 干细胞技术,62,干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的未分化细胞。具有发育的全能性，能够被诱导或分化为机体几乎所有的细胞类型。因此干细胞也被称为“种子细胞”， 根据来源的不同，干细胞主要分为三种：1.胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)2.诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）3.成体干细胞(adult stem cells，ASCs),63,一、胚胎干细胞（ESCs) 来源：囊胚期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞,64,1981年Evans和Kaufman首次成功分离小鼠ESCs 目前已在仓鼠、大鼠、兔、猪、牛、绵羊、山羊、水貂、恒河猴、美洲长尾猴以及人类都分离获得了ESCs ，而且已经证明小鼠ESCs可以分化为心肌细胞、造血细胞、卵黄囊细胞、骨髓细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、黑色素细胞、神经细胞、神经胶质细胞、少突胶质细胞、淋巴细胞、胰岛细胞、滋养层细胞等。人类ESCs也可以分化为滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。,65,ESCs的应用：1. 研究体外细胞分化和发育调控机制的理想材料。 在ESCs培养液中加入分化诱导因子, 可以诱导ESCs向不同类型的组织细胞分化，研究胚胎发育过程中细胞分化、组织和器官形成的规律。小鼠ESCs已成为研究哺乳动物早期发育规律重要工具之一。,66,2.治疗人类的某些难治性疾病 利用ESCs可以诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ESCs可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能。目前，用ESCs诱导分化出的某些组织细胞已成功地治愈了部分糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑难病症。,67,3.培育出人造组织器官，用于器官移植 ESCs作为 “种子细胞”，可为临床的组织器官移植提供大量材料。通过ESCs体外诱导分化，可以培育出人造组织器官，解决目前临床上存在的供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题，为人类移植医学带来一场革命。,68,4.生产克隆动物（设想） ESCs从理论上讲可以无限传代和增殖，以其作为核供体进行核移植后，在短期内可获得大量基因型和表现型完全相同的个体，使用该项技术进行异种动物克隆，对保护珍稀野生动物有重要意义。5.生产转基因动物（设想） ESCs可以作为一种载体，将通过同源重组产生的基因组的定点突变导入个体，从而突破亲缘关系的限制，加快动物群体遗传变异程度，进行定向变异和育种。利用ES细胞技术，可在细胞水平上对胚胎进行早期选择，这样可以提高选样的准确性，缩短育种时间。,69,二、诱导性多能干细胞（iPS细胞）1.iPS细胞的产生 2006年，日本科学家山中伸弥利用病毒载体将四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc）引入小鼠胚胎和皮肤纤维母细胞，发现可诱导其发生转化，产生了在形态、基因和蛋白表达、分化能力等方面都与胚胎干细胞极为相似的一种细胞类型，并命名为iPS细胞。,70,2.iPS 细胞系建立的主要过程: 分离和培养宿主细胞； 通过病毒介导或基因转染的方式将若干个多能性相关的基因导入宿主细胞； 将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上, 用ESCs专用培养体系中培养, 同时在培养液中根据需要加入相应的小分子化合物，以促进重编程。 进行iPS细胞系的鉴定，包括细胞形态、表观遗传学、体外分化潜能等方面。,71,3.iPS 细胞与ESCs相比，具有很多优势。 目前的研究成果表明，iPS细胞与ESCs具有相似的多能性，而且iPS细胞不需要从动物囊胚期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞中分离，不存在伦理问题，理论上可以从任何组织的细胞，甚至皮肤组织的细胞来制造，技术上更加简单。 目前, 科学家们已经成功地从小鼠、大鼠、猕猴、猪和人的体细胞中诱导并获得了iPS细胞。,72,在实际应用方面，iPS细胞的建立进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离，iPS细胞在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选方面具有巨大的潜在价值。 此外，iPS细胞在神经系统疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈现，iPS细胞在体外已成功地被分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等。在临床疾病治疗中具有巨大应用价值。,73,二、成体干细胞（ASCs）1.来源： ASCs存在于机体的各种组织器官中，可以自我更新，在一定条件下也可以分化，产生各种特异的细胞类型。但成体干细胞含量很少，在正常情况下一般静止休眠状态（不分裂），直到组织受到损伤或发生疾病时被激活，才开始分裂，表现出现修复和再生能力，维持正常生理功能。 目前已经报道的含有ASCs的组织包括：脑、骨髓、外周血液、血管、骨骼肌、皮肤和肝脏,74,2.体外培养： 取所要分离ASCs的组织，用酶消化法分散细胞进行体外培养。再用各种技术从体外培养细胞中分离ASCs，如用免疫磁珠分离系统分离乳腺ASCs 。3.应用： 疾病的替代治疗和移植治疗，如用造血干细胞治疗白血病，造血干细胞在体外诱导分化成心肌细胞来修复受损伤的心肌，治疗心力衰竭。骨髓来源干细胞及其他来源干细胞都可以分化得到成骨细胞，通过将细胞与支架材料结合后移植于骨骼受损部位，用于修复骨骼缺损。,75,对ESCs、iPS细胞和ASCs的研究，在干细胞研究领域、表观遗传学研究领域以及生物医学研究领域都引起了强烈的反响，这不仅是因为它们在基础研究方面的重要性，更是因为它们为人类带来了光明的应用前景，必然成为未来的研究热点。,第五节 外源基因导入胚胎技术,一、外源基因直接导入受精卵或早期胚胎内1.显微注射法：在显微镜下利用玻璃显微注射针直接将外源DNA注入到受体的细胞核内。是应用最为广泛的转基因技术，可获得大量的转基因动物。2.逆转录病毒载体法：目前已有许多逆转录病毒载体。将外源基因克隆到这些病毒载体，感染受体胚胎细胞时，外源基因可整合到宿主细胞染色体。该法转移效率高。3.精子载体法：将外源DNA与动物精子一起孵育，在体外受精过程中由精子将外源DNA带入卵内。该法重复性较差，尚有争议。,二、外源基因通过胚胎干细胞和体细胞进入早期胚胎步骤： 首先将外源基因转染ESCs或体细胞，在体外细胞水平进行基因定点整合筛选； 电穿孔法、脂质体法、EAE-葡聚糖介导法、磷酸钙介导法、基因枪法 筛选出的定点整合ESCs通过崁合体技术进入囊胚，体细胞通过克隆技术（核移植）进入早期胚胎。,1电穿孔法：使用高电压击穿细胞膜，从而使外源DNA被摄入细胞中。最大优点是可以快速对大量细胞进行转化，且转染效率高。2脂质体法：脂质体是一种人造膜，将外源DNA装入脂质体，与培养细胞一起温育，将外源DNA导入受体细胞。3DEAE-葡聚糖介导法：DEAE-葡聚糖是高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA，实现暂时表达。操作快速简便。4磷酸钙介导法：把DNA直接和CaCl2及磷酸盐缓冲液混合，从而形成细微的DNA-磷酸钙共沉淀。然后加在培养细胞上，外源DNA即可被有效导入。5基因枪法：又称粒子轰击法。将吸附有外源DNA的钨（或金）微细颗粒通过高压放电或高压气体获得加速，射入受体细胞，从而将外源DNA导入。,将带有外源基因的ESCs注入到囊胚内，制作嵌合体动物。1.用灌流法从妊娠3天的C57BL/6J小鼠（黑色） 子宫中冲出囊胚。2.带有外源基因的ESCs取自129系小鼠（白色）。3.用显微注射法将ESCs 注入囊胚腔内4.体外培养后将囊胚移植于假孕小鼠的子宫中，出生后的小鼠即为崁合体小鼠（应该是？颜色）。,崁合体小鼠,将遗传上不同的两类胚胎或胚细胞组合起来，由此而发育形成的动物称为嵌合体动物。由于嵌合体动物是两类遗传背景不同的胚胎发育形成的，不同细胞群体互相嵌合构成了器官和组织。,显然，制作嵌合体动物动物并不仅仅是处于观赏和猎奇的需要，还有更重要的意义和应用价值。 现有的医疗技术决定人体器官移植还要在同种人与人之间进行，除了在技术上需要组织配型，大量免疫抑制剂的应用外，更重要的是供体器官来源紧缺，造成每年都有许多心、肝、肺、肾等脏器衰竭的病人在等待器官移植中死去。而且人体之间的器官移植涉及伦理、道德、人权、公民素质等许多社会问题，所以科学家们都在寻找一条新的途径，争取让更多的人延年益寿。,人类曾做过异种器官移植的尝试，但几乎所有接受异种器官移植的病人都在移植后立即死亡。 利用ESCS制作嵌合体动物的成功，为异种器官移植的研究提供了新的思路，对人类的器官移植有着积极的意义。目前已有“嵌合体猪”问世，猪器官移植于人类的主要技术困难正在被克服，有望把猪的脏器移植于人体，如果再结合克隆技术，前景将是十分诱人的。,三、外源基因进入细胞后的命运 外源DNA直接导入或转染进入到胚胎细胞后可能有三种命运：1.被胞内酶降解：外源基因在胞浆内被核酸酶降解。2.以游离状态存在：游离的未整合外源DNA只要有真核细胞能识别的启动子、编码基因以及poly(A)信号等，一般都能得到表达，但随着细胞衰老，表达力下降。这种表达不能传代，称为暂时表达。3.整合到受体细胞染色体（最理想的结局） 而整合到受体细胞基因组的外源基因，能随细胞分裂遗传到子细胞，称为稳定表达。,