细胞培养概述ppt课件.ppt

第一章 细胞培养概述,主讲: 况海斌 Ph.D南昌大学医学院生理学教研室计划生育生殖内分泌研究室,课程安排:,第一次：细胞培养发展史（略讲）、细胞培养室的设计（重点理解其原理，从而达到对细胞培养室要求的理解，如进出培养间要关好每一扇门）。实验器械清洗、包装和清毒（清洗要领、清洗液的配配制和使用的期限、包装的具体步骤：如何包装培养瓶，清毒的方式、压力与时间。第二次：实验室常用仪器、设备的使用与维护：净化台（使用的区域、物品的摆放、操作方式、消毒、秽物处理）；自动双重纯化水蒸馏器（使用与注意事项）；培养液的过滤器（简单与自动抽气泵的过滤器使用介绍、操作关键点）；清毒器（种类、消毒时间、压力、和注意事项），CO2培养箱（使用及注意事项）；干燥箱；液氮生物容器；冰箱；显微镜；倒置显微镜；荧光显微镜；天平；酸度计；电泳仪；PCR仪；离心机；振荡器，摇菌摇床等相关设备。,第三次：细胞培养用液及培养液（基）：水的要求；平衡盐溶液（种类与配制）；消化液（种类与配制）；谷氨酰胺补充液；抗生素溶液的配制；培养基颜色要求与变化代表的意义；小牛血清的批号、灭活与分装；天然培养基；常见合成培养基种类、如何配制、分装与贮存。第四次：细胞培养的基本技术：原代细胞分离（培养前准备、无菌操作的注意事项具体的流程）、培养（酶消化法和组织块培养法、如何计数、接种密度）。细胞生长状况的观察（培养液颜色与透明度的变化、细胞生长状况、细胞形态变化、微生物污染、体外培养细胞的生长类型、细胞培养中的常用术语）；培养细胞一代生长过程（分期及特点）；盖玻片条细胞培养法；细胞传代（消化酶、传代的比例、及注意事项）；冻存与复苏（冻存和复苏的原则：慢冻快融；冻存和复苏具体操流程）。细胞培养注意事项（如细胞污染判断、观察与处理原则）。,第五次：细胞培养的研究方法：活力的检测（死、活细胞鉴别；凋亡细胞检测）；细胞增殖实验（MTT法、MTS法以及BrdU法）；细胞和细胞器分离与培养（速度、等密度、流式细胞分离技术）；细胞形态学研究方法（细胞固定、常用染色法、细胞免疫组化，免疫荧光法）；细胞克隆技术（细胞克隆形成试验）。第六次：具体原代细胞的分离与培养流程及实验设计（如心肌分离与培养、从作者论文来分析论文设计及实验操作关键过程）。第七次：干细胞的分离与培养流程、及实验设计（使学生了解长期细胞培养流程、注意事项、以及干细胞诱导分化过程、鉴定的流程和相关的指标）。,第八次：细胞转染技术（质粒序列选择、酶切位点选择及引物设计、如何连接、接种，挑选阳性菌进行PCR扩增和测序，以及产物鉴定。磷酸钙共沉淀法基因转染、脂质体转染法。了解病毒转染法和RNA干扰技术。）第九次：胚胎技术：（常用的昆明白小鼠超排卵方法及胚胎收集程序、小鼠胚胎培养步骤、小鼠胚胎与小鼠子宫上皮共培养步骤、小鼠子宫内膜上皮和基质细胞的分离培养、小鼠外胎盘锥的培养、外胎盘锥与蜕膜细胞的共培养、人绒毛的分离与培养、胚胎移植技术、显微操作技术）第十次：参观与讨论：,主要参考书：,1. 动物细胞培养技术作者：程宝鸾，出 版 社：中山大学出版社2细胞培养 作者：司徒镇强，吴军正出 版 社：世界图书出版公司3. 小鼠发育生物学与胚胎实验方法作者： 金岩 出版社：人民卫生出版社4. 小鼠胚胎操作实验手册 作者：安德拉斯. 纳吉 翻译: 孙青原,主要内容:,一、细胞培养发展史（略讲）:二、细胞培养室的设计（重点理解其原理）:三、细胞培养实验室无菌的基本要求:四、如何准备一次实验(实验器械清洗、包装和清毒):,一、组织培养发展简史（一）发展史,1878 Claude Bernard: 证明一个器官在个体死亡以后仍然可以人工维持。1885 Wilhelm Roux: 首次采用了“Tissue culture”这个名词。1887 Ross Harrison: 利用的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经嵴，维持其活性达数星期，并观察到了 Ross Harrison被称为细胞培养之父。,Ross Harrison,早期培养,1898年 Ljunggren 将人体皮肤保存在腹水中几天至几周后再移植手术获得成功。1903年Jolly 用玻片悬滴法培养蜂螺白细胞存活近一个月1906年Beebe等 用动物血清培养狗的传染性淋巴瘤细胞达72小时。1910 Burrows: 率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞.,培养器材：,Harrison（1906）通过采用单盖片悬滴培养法,用淋巴液培养蛙胚神经组织数周，从此标志着体外培养组织细胞的基本模式的建立。Carrel（1923）设计了卡氏培养瓶，进一步研究细胞的营养问题。Strengeway（1926）设计了表玻璃培养法，为研究动物器官在体外的发育与功能作出贡献。以及现在培养瓶、培养板和培养皿的发展。,组织培养发展示意图,1948 Fisher: 研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006，该培养液至今还在使用。1951年Eagle 开发了能促进动物细胞体外培养的人工合成培养基。1952 Gey 和同事： 分离培养了Hela细胞。1952 Dulbecco: 发明了噬斑法，用长满的单层细胞检测病毒。,培养基（液）：,1955年 Dulbecco发明了用胰蛋白酶消化分离组织细胞的方法，建立了单层细胞培养技术。1961 Hatflick & Moorhead: 显示人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。1965 Ham: 配制了第一个无血清培养液。1975 Kohler & Miltein: 成功的得到了第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。,（二）我国组织、细胞培养的发展：,20世纪30年代传入我国。20世纪50年代起步。20世纪70年代，成为医学和生物学研究中普遍应用的手段。,（三）细胞培养的优点：,1、活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动。 2、可控制：,选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段）,调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素）,利用方法：研究技术、记录方法,3、应用广： 领域多：医学研究、生物技术、基因工程等 对象广：各种动物（低等动物-高等动物-人类） 一种动物（不同年龄、不同组织） 正常或异常（肿瘤） 4、较经济： 可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。,优点,（四）细胞培养的缺点：,人工模拟的培养环境与体内相比仍然存在一定差异，培养的细胞或组织，其形态或功能会发生不同程度的改变。,与体内主要不同 相对孤立、相对单一、缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。 主要表现 失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱、细胞趋向单一化。 提示 要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。,缺点：,二、细胞培养室的设计,（一）细胞培养的必备设施,无菌实验室 超净工作台 恒温培养箱 其他设备 （电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽滤装置等）,1、无菌实验室：,设计原则：防治微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。,1、无菌实验室：,总的要求：抽风过滤系统,无菌实验室：,组成： 更衣间：放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。 缓冲间：位于更衣间与操作间之间，也可同时与 几个操作间相通。 操作间：放在内间，供无菌操作和细胞培养，房 间不受日光直射，大小适宜，高2.5m。,2、超净工作台：,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,其它老师专门讲述实验室仪器：,恒温培养箱其他设备（电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽滤装置等）,3、如何维护无菌环境：,保持无菌的基本要求：,（1）实验前准备：分门别类制定操作卡片，实验前按卡片收集、清点、清洗及消毒所需物品，一并放入无菌操作台内，实验器材准备数要大于使用数，瓶盖数要大于瓶数。,（2）无菌室及操作野消毒,实验前无菌室及无菌操作台(超净台) 以紫外灯照射30分钟灭菌，打开抽风系统，抽风大约20分钟，进入培养室。以70 %ethanol 擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。,(3)无菌操作要求,无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。,(3)无菌操作要求：,小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验.容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的火焰前方进行,瓶口、吸管、注射器使用前要经过火焰消毒后使用。,试剂用后立即封闭瓶口。专管专用，勤换吸管。瓶口液滴不能倒回瓶内，液滴用干酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒。盖瓶时瓶口和瓶盖经火焰消毒。,(4)实验后要求,实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面（一般先用加入新洁而灭或84的液体清洗）。关闭超净台灯、风和电源。未使用过的器材放入饭盒中，用过的器材清水浸泡。,(5)整个实验室的日常维持：,实验室维持： 实验室的日常维持是动物细胞工程实验室所必须进行的。在实验室工作的每一位研究人员都应该被安排在一定范围内承担实验室维持工作任务，以便使实验室保持在一个好的工作状态和工作秩序。,(5)实验室日维持任务废物容器和废液体应带出细胞培养室，并在每天工作完成后将其清除。如果有培养物污染而需要废弃时，应立刻从培养室移出，并进行高压蒸汽灭菌处理。进入实验室工作的所有人员，在每天进行实验工作的前、后，用适当的消毒剂(如70%75%酒精)擦拭工作台面。,(6)实验室月维持任务实验室月维持任务很少经常进行，但至少应该定期进行一次。如果实验室有多台培养箱连续工作，每月应有1台培养箱停止运行，进行清理和保养，拆解培养箱，对各个培养室部件进行消毒(我们半年进行一次,每月会更换孵育箱的水)。定期进行培养箱温度和CO2水平的校正，如果具有自动调零功能，至少应1年1次，最好半年进行1次自动调零。,四、如何准备一次实验,分门别类制定操作卡片，实验前按卡片收集、清点所需物品，进行相应清洗、包装与消毒。实验器材准备数要大于使用数（瓶盖数要大于瓶数）。,（一）一般需要准备物品：,1、培养瓶（培养液、消化液以及PBS）。2、离心管、吸管、盖子、TIP管、冻存管、烧杯、量筒、容量瓶、饭盒,培养皿3、枪头（TIP头）4、培养板与培养皿5、手术器械。,（二）实验器材的清洗、包装和消毒,细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒,1、清洗,在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗,（1）玻璃器皿的清洗,包括浸泡、刷洗、干燥、浸酸和冲洗等步骤清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹不能残留任何物质,浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等先用自来水简单刷洗，然后用5稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质，再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上,刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度,干燥：,50-560C,浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml） 强清洁液 631000200 次强清洗液 120 2001000 弱清洁液 100 1001000,清洁液的配制,配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色,冲洗在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹最好用洗涤装置（超声波洗涤器）如用手工操作需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次（喜欢浸泡过夜），晾干备用,（2）胶塞的清洗,新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用,（3）塑料制品的清洗,塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用,2、包装,组织培养的器皿要清洗晾干。在消毒前必须进行包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。,包装的方法：,3、消毒,细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染常见原因：操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染,消毒灭菌方法：,物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min湿热（高压蒸气灭菌法）：121，20min干烤：160, 2 小时过滤：0.22m化学消毒灭菌法70%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理1新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒抗生素（主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染）,物理消毒灭菌方法干热消毒,在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿。干热消毒后的器皿干燥，易于保存。缺点是干热传导慢，可能有冷空气存留于烤箱内，因此要用较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的，需加温到160，保持90120min方能杀死芽胞。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。,湿热消毒,是一种很有效的消毒方法，一般使用高压蒸汽灭菌器进行。高压消毒可在50、10、15、20磅的压力下进行，持续时间可为10、15、20、30min。根据不同的物品选择不同压力和时间，一般物品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是15磅20min，有些常规使用液体要消毒15磅15min，橡胶用品为10磅10min。煮沸消毒可用于注射器及某些用具的快速消毒，缺点是湿度太大。,故湿热消毒后要进行干烤：但过滤器不能干烤。,紫外线消毒,紫外线直接照射消毒是目前各实验室常用的方法之一，主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。但在房内安装不能高于2.5米，要使各处能有0.06微瓦/cm2能量照射，否则影响消毒效果。也可以用紫外线消毒一些塑料培养器皿。缺点是有臭氧产生，污染空气，影响身体健康。,过滤除菌消毒,有很多组织细胞培养使用的液体不能采用高压消毒的方法进行灭菌处理，目前培养工作中采用的培养用液，包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肽、生长因子等具有生物活性物质的液体等，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能。,因而上述液体多采用滤过消毒以除去细菌。滤器有抽吸（抽滤）式及加压式两种类型；滤板（或滤膜）结构可为石棉板、玻璃或微孔膜。,常用的滤器,Zeiss滤器玻璃滤器微孔滤膜滤器 这种滤器的基本结构为金属结构，其中间为一种一次性的特制混合纤维素脂滤膜。可用于包括血清在内的各种培养液体的过滤除菌，速度较快，效果较好，现已为许多实验室所使用。滤膜的规格很多，主要根据滤器的直径大小而划分其型号，可按待滤过液体的量来选择适当的型号。用于小量培养液时，可选用2.5cm直径滤器，以注射器推动为压力而过滤。微孔滤膜滤器可为加压式（正压式）或抽滤式，以加压式更佳。,以滤过除菌时，最好使用 0.22m孔径的滤膜（可以除去细菌和霉菌）。由于滤膜很薄，在滤器的上层和下层的相应部位各有一凹槽以放置一硅胶垫圈来固定、压紧滤膜。安装滤膜时要注意；滤膜薄而且光滑，容易移动，千万不能装偏而使过滤失败；同时要注意滤膜的正反面，正面（光面）应向上。由于滤膜薄，承受压力有限，力量不能过大、过猛，以免造成滤膜破裂。,如何安装微孔滤膜滤器：,化学方法,消毒剂 组织细胞培养工作中也可利用消毒剂来进行灭菌处理，消毒剂主要是75%酒精、过氧乙酸、乳酸、来苏儿等化学制剂。可分别用于操作人员的皮肤、实验台、器械、器皿的操作表面，实验室的椅、桌、墙壁、地面及空气等的处理。如：75%酒精最为常用，用途也最广泛；0.1%新洁尔灭可以对器械、皮肤、操作表面进行擦试和浸泡清毒；乳酸可用于空气消毒；来苏儿对皮肤有刺激性，可用于地面的消毒；过氧乙酸是一种新的消毒剂，消毒能力很强，在0.5%浓度下，10min可将芽孢菌杀死。,抗菌素也常在组织细胞培养工和中使用，但多数是为了预防。要注意的是不能完全依赖抗菌素来达到消毒灭菌。常用的抗菌素为青霉素及链霉素。,小结：消毒方法的选择,实验室中空气的消毒，最理想是采用过滤系统，并与恒温设备结合使用，但价格较贵。亦可用紫外线消毒，但安置紫外线灯时要符合要求（使用寿命指UV灯管在相同能量输入而产生的可利用紫外线强度不够） 。另外尚可用乳酸等蒸气或电子灭菌灯消毒。实验台的消毒处理，最常用的是以酒精擦拭，亦可以紫外线照射。,消毒方法的选择：,培养器械的消毒：多数培养用的器材常用干热或湿热消毒，不能耐高温的塑料制品，可用消毒剂浸泡或紫外线照射。培养用液体的消毒：盐溶液及一些不会因高温破坏其成份的溶液，常采用高压蒸汽消毒。血浆、血清等生物性的天然培养基，不能以高压蒸汽消毒，必须用过滤方法除菌；合成液体培养基也采用过滤除菌的方法。,5、准备相应的实验：,第一讲内容：,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,滤 器,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，14 h)。箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,酶标仪 微孔板震荡器,培 养 板,培养瓶,动物细胞工程的实验室基础,图3-1 研究用标准细胞培养实验室参考平面图,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,表3-3 培养器皿特性,表3-3 培养器皿特性,表3-3 培养器皿特性,培养器皿特性,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,培养器皿特性,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,培养器皿特性,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,动物细胞的工程化操作是基于无菌(asepsis)条件下进行的，需要建立一套满足无菌操作(aseptic manipulation)技术和无菌培养(aseptic culture)的环境。 有了这些基础，就可以通过无菌操作过程获得动物组织、器官和细胞等无菌培养物，并在适宜环境条件下生长、发育、繁殖。,归纳起来，实验室要具备进行洗涤、储藏、准备、灭菌、无菌操作、培养和检测等6项主要功能。按照这些功能要求，动物细胞工程实验室一般分为实验准备工作区和无菌操作区两大主要区域，可按照具体执行的功能再进行细分，各个功能区域都应配备有专用仪器设备和器材。,第一节 实验室建设及主要仪器设备一、实验室功能要求与规划布局,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,1洗涤区 用于各种实验用具和实验材料的洗涤。 2普通贮藏区 用于各种实验器皿、培养液、化学药品等放置。 3培养液配制区 用于培养液灭菌前试剂的称量、稀释等。如果培养液的市场供应便捷，小型实验室不必自备培养液。但对从事细胞培养工作人数较多的大型实验室来说，用自备培养液较为经济，需要有专门的培养液配制区。 4灭菌区 热稳定溶液和耐热器材的高压蒸汽灭菌或干热灭菌工作在非无菌的准备区内进行，灭菌区用于动物细胞操作器械、物品及培养液的灭菌，灭菌后存放到无菌储藏柜或专用无菌贮藏区。,第一节 实验室建设及主要仪器设备一、实验室功能要求与规划布局(一)实验准备区功能要求及配置原则,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,实验准备工作区的各个区域的设置应彼此相邻，以方便操作。当然最好的设置是将实验准备工作区与细胞培养与胚胎工程无菌操作区分开，但在分开的同时最好与无菌操作区相近且无台阶阻隔，以便于工作进行及方便使用手推车、台车，若它们之间仅相隔一个走廊最理想的。,第一节 实验室建设及主要仪器设备一、实验室功能要求与规划布局(一)实验准备区功能要求及配置原则,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,标准细胞培养实验室无菌操作区主要分为缓冲准备区、操作液体和培养液的无菌配制区、无菌储藏区、培养物无菌操作区、培养区及鉴定分析区。操作液体等无菌配制区和培养物无菌操作区，以及培养区和鉴定分析区也可以合并使用。条件允许时，应有专门的无菌储藏区或配备专用的无菌物品储藏柜。,第一节 实验室建设及主要仪器设备一、实验室功能要求与规划布局(二)无菌操作区功能要求及配置原则,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,1标准细胞培养实验室无菌操作区(1)缓冲准备区(2)操作液体无菌配制区 (3)无菌储藏区(4)培养物无菌操作区 (5)培养区 (6)鉴定分析区2层流净化实验室层流净化实验室（laminar-flow laboratory）,第一节 实验室建设及主要仪器设备一、实验室功能要求与规划布局(二)无菌操作区功能要求及配置原则,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,表3-1 细胞培养实验室基本基础条件,(改自：英R. I. 费雷谢尼, 著. 章静波, 徐存栓, 等 译. 动物细胞培养基本技术指南，2004),Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,第二节 实验室基本操作技术,动物细胞工程涉及的体外培养工作需要使用大量消耗性物品，包括玻璃器皿、塑料和橡胶制品、金属器械，以及布类和纸类。虽然现在在体外培养实验室越来越多地使用一次性用品，但大多数培养用品仍然是多次反复使用。 而动物细胞工程的操作及培养对象，对操作及培养器具带来的毒性非常敏感，体外培养中任何与培养物相接触的有害物质都会影响培养物的体外生长和增殖，诸如微生物、细胞碎片以及非营养性化学物质等都可能干扰正常的实验结果。,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,第二节 实验室基本操作技术,在培养工作开始之前，对实验室所使用的操作及培养器具进行彻底清洗，消毒、灭菌，清除可能残存的细胞毒性物质；即使不进行培养时，培养物操作器械、物品，也应按照这些要求清洗，消毒、灭菌。清洗和消毒灭菌是否彻底直接关系到体外培养的成败。与体外培养有关的培养环境也必须进行严格地消毒与灭菌。 操作者在体外培养工作中，要建立无菌概念，掌握无菌技术，防止在任何环节上发生污染。 实验室基本操作技术：清洗与包装、消毒灭菌、无菌操作、实验室维持。,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,动物细胞工程的实验室基础,第二节 实验室基本操作技术,消毒灭菌方法： 干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 辐射灭菌法 过滤除菌法 化学消毒剂消毒法 抗生素抑菌法,Animal Cell Biotechnology College of Veterinary MedicineMA Bao-hua,