细胞凋亡及其调控ppt课件.ppt

第四章 细胞凋亡及其调控,细胞凋亡的特征及意义细胞凋亡的发生机制检测凋亡的常用方法和技术细胞凋亡的调控细胞凋亡与疾病,Biochemistry & Molecular BiologyCell,细胞凋亡（aopotosis，a Greek word that means “dropping off” or “falling off”)是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程，其发生受到机体的严密调控细胞凋亡对多细胞生物的生长发育和正常生命活动至关重要，与许多疾病的发生也相关,2002年10月7日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。,2002年诺贝尔生理与医学奖获得者（图片来自http:/www.nobel.se/）,4.1 细胞凋亡的特征及意义,一、细胞凋亡的基本特征1、形态学特点单个凋亡细胞与周围细胞分离以胞浆空泡开始，与细胞膜融合，导致膜发泡。随后空泡自细胞内排出，引起水分丧失、细胞容积减少、细胞固缩染色质浓缩或重新分布于核膜下呈圆形或半月形最后细胞器也超浓缩，细胞核解体，细胞膜下陷，包裹着核碎片和细胞器形成凋亡小体凋亡小体最终被周围细胞吞噬,Cell structure changes during apoptosis. The top panel shows a normal cell. The lower panel shows an apoptosing cell; arrows indicate condensed nuclear fragments.,检测凋亡的常用形态学方法,在实际研究中，为了对细胞凋亡进行严格、合理的评价，往往采用多种方法，联合应用。细胞形态学的评价(1)普通光镜、荧光显微镜观察 分别对细胞核、质染色，计算凋亡细胞数目缺点：常受主观因素干扰，重复性较差,(2)电子显微镜观察,凋亡细胞膜表面变化，如膜发泡和某些结构的丢失，染色质固缩和线粒体超浓缩,necrosis,apoptosis,凋亡细胞的生物化学特点,（1）非随机性DNA降解：细胞凋亡过程中，核酸内切酶活化，基因组DNA被降解产生寡核小体片段，大小相当于核小体（180200bp）的倍数（2）细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻：正常细胞的膜磷脂分布不对称，氨基类磷脂如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺多分布在膜内侧。（3）正常的能量代谢（4）胞浆蛋白交联：凋亡细胞的mRNA和蛋白合成减少，诱导组织谷氨酰胺酶表达，在胞膜下形成壳状结构，使凋亡小体稳定,3、凋亡细胞的结局,在细胞凋亡末期，破碎的核片段由一层包被，形成凋亡小体，被邻近细胞，主要是巨噬细胞清除，不会导致周围组织损伤和炎症反应。坏死（necrosis）因溶酶体水解酶的释放而导致邻近组织的损伤和炎症反应,二、细胞凋亡的生物学意义,1、个体的生长发育(1)胚胎发育中特定种类细胞在完成其使命后通过凋亡而淘汰，代之以新的细胞类型指、趾、关节腔的形成，人、蝌蚪尾巴的消失(2)成年个体中，通过细胞凋亡清除衰老细胞并代之以新生的细胞，从而维持特定组织器官的细胞类型和数量的稳定皮肤和粘膜等细胞的更新 （1.维持细胞总数和机体生活力 2.调节细胞数量和质量 3.参与形态建成）,细胞凋亡在鸭和鸡的脚的形态发生中的作用,细胞凋亡在非洲爪蟾发育过程中尾巴消失中的作用,溶酶体中 cathe-pasin酶的浓度,2、淋巴细胞的成熟和维持免疫系统的功能,在淋巴细胞的发育分化中，自身反应性B细胞克隆的清除一些免疫活性细胞可以通过诱导凋亡来杀伤靶细胞防止过高的免疫应答（受抗原刺激活化的T淋巴细胞自身可以通过激活诱导的细胞死亡过程而凋亡 3、细胞凋亡与DNA和组织损伤、修复有密切联系细胞损伤严重，无法修复时，细胞通过凋亡清除；组织损伤后由肉芽组织转变为瘢痕过程,4、细胞凋亡与衰老密切相关,随着年龄的增长，许多类型细胞失去凋亡能力，可能是导致衰老和器官功能普遍下降的原因胸腺和淋巴细胞可能也丧失触发凋亡信号途径的能力5、细胞凋亡可能与多种疾病的发生有直接联系肿瘤，神经退行性疾病,4.2 Mechanisms of apoptosis,Apoptosis is triggered by a variety of pathways,Overview of the evolutionarily conserved apoptotis pathway in C. elegans and vertebrates.,Regulators促进或抑制凋亡，CED-9 和 Bcl-2在营养因子存在的情况下抑制细胞凋亡. Adapters 作用于调控蛋白和效应蛋白;在营养因子存在的情况下促进效应蛋白的激活. 蛋白酶 caspases（胱天蛋白酶） 是胞内一种重要的效应蛋白;其活化可导致胞内底物的降解，最终导致细胞死亡.,一、caspase与细胞凋亡 1、caspase的种类与性质胱天蛋白酶caspase（天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶）,活性位点含有QACXG（X=R，Q，C）保守氨基酸序列。这类酶都以无活性的酶原形式合成并存储在细胞中。N-端为一个序列、长度特异的原结构域，是caspase的活性调节结构域，其后是一个大亚基和一个小亚基序列。,Caspase被活化时，在原结构域C-端及大、小亚基间保守序列的Asp位点被切割，游离的大、小亚基结合成异二聚体，其活性中心由两个亚基的部分氨基酸序列共同构成。 caspase异二聚体可进一步二聚化，形成活性更强的四聚体。,Caspase activation requires dimerization and two cleavages.,迄今共发现14种caspase，根据其结构的同源性分3个亚家族： Caspase-1亚家族：caspase-1，4，5，11，12，13，14。它们的活化与炎症因子的合成有关，多数情况下不是细胞凋亡的直接效应分子。Caspase-2亚家族：caspase-2Caspase-3亚家族：caspase-3，6，7，8，9，10。它们都直接参与介导细胞凋亡过程,根据caspase前体分子(procaspase)的N-端原结构域, 以及它们在细胞凋亡中的作用不同，caspase-3亚家族也可以分两类：具有”long-prodomain”的起始分子initiators，如caspase-8, 9, 10等。可以通过这种long-prodomain与胞膜上的受体和接头蛋白构成的caspase激活复合物结合，结果使caspase起始分子发生聚集，并通过分子间切割而活化，继而切割活化下游的caspase分子。,具有“short-prodomain”的效应分子，如caspase-3, 6, 7。它们不能相互聚集，只能作为上游caspase的底物，活化后作用于胞内多种蛋白质或酶类，促使细胞凋亡。 (p517, 表21-2）,caspase对底物的酶切作用是高度特异的，至少可识别包括Asp在内的4个氨基酸残基并切割Asp后的肽键，该作用同时受底物空间结构的影响。不同的caspase对其底物的氨基酸序列亲和力不同，与其功能相适应。 N- -Asp X X- X- -C 疏水 多样化 可变，Glu最佳,Four caspase pathways involved in apoptosis Adapted from “Cytokine Bulletin”,Cell type-specific effector of apoptosis-inducing agents on caspase-9 or caspase-3 deficient mice,2、caspase的活化,在不同的细胞凋亡因素刺激下，caspase在细胞内可以通过多种不同的途径被活化，然后切割并激活下游的caspase分子，介导细胞凋亡。（1）由死亡受体介导的“诱导接近”模型：如caspase-8，在上游分子的作用下寡聚化，然后紧密结合的caspase-8分子之间可以发生切割，释放p18和p10至胞浆，并装配成活性蛋白酶。这种起始活性蛋白酶将进一步激活下游的效应蛋白酶caspase-3, -6, -7，或另一分子起始蛋白酶caspase-9。,（2） caspase-9的活化通常需要线 粒体的参与。Caspase-9在线粒 体释放的细胞色素C和dATP存 在下，通过与Apaf-1的CARD (caspase recruitment domain) 结合成一个复合体而得以活化，然后再去激活下游分子，包括caspase-3以及可能随后被激活的caspase-2, -6, -8, -10, 诱导细胞凋亡。Cyt c和dATP与Apaf-1结合并诱导后者构象变化，更易聚集caspase-9,效应caspase, 如caspase-3, -6, -7, 主要通过上游caspase的切割而活化。切割后游离的大、小亚基装配成活化caspase。 caspase活化后的功能?,3、活化的效应caspase诱导凋亡的机制,细胞内有上百种caspase的底物蛋白，如聚（ADP-核糖）多聚 酶（PARP）；DNA依赖的蛋白激酶；IkB-；蛋白激酶C、和；Rb蛋白；Ras-GTPase活化蛋白；MEKK1；Akt-1和Fak等 对于其中一些底物的认识提示，caspase可能通过以下几种机制参与凋亡,（1）灭活细胞凋亡抑制蛋白如caspase对ICAD/DFF45的剪切 CAD(caspase活化的DNA酶） 是一种导致细胞发生随机性 DNA降解的特定核酸酶。非凋亡期，CAD和ICAD（inhobitor of CAD）结合形成无活性复合物细胞凋亡时，caspase剪切ICAD使其失活，CAD从而游离并进入细胞核，降解DNA。DFF：HeLa细胞中分离的DNA片段化因子，ICAD同源分子,（2）剪切细胞结构蛋白,如caspase对核板的降解作用核板是衬托于核内膜表面的坚固结构，与染色质的组织密切相关。它由核纤层蛋白的头尾多聚体组成。细胞凋亡过程中，caspase在单一位点剪切核纤层蛋白，导致核板塌陷和染色质浓缩。Caspase剪切的还有肌动蛋白，Fak和核分裂相关蛋白等。,（3）剪切核效应蛋白,Caspase可能作用于DNA修复、mRNA拼接和DNA修复相关蛋白，使其活性丧失或失调。聚（ADP-核糖）多聚 酶（PARP）与DNA修复、基因完整性监护有关；细胞凋亡启动时，PARP被剪切，导致其氨基端的两个结合DNA的锌指结构与羧基端的催化结构域分离，进而丧失其正常功能。,4、caspase活化的抑制剂,细胞内存在一些caspase的抑制蛋白，防止caspase的非特异性活化。一些病毒蛋白或人工小肽也可以抑制caspase（1）IAP(inhibotors of proteins)家族可以通过与死亡受体复合物上的TRAF结合而阻止细胞凋亡（2）一些caspase的底物如IL-1以及一些人工小肽，是caspase的抑制剂,（3）一些能阻断long-prodomain相互 作用的物质 如sentrin能特异性结合Fas，却不能结合FADD，从而阻断了caspase-8的活化（4）丝氨酸蛋白酶抑制剂如昆虫病毒蛋白p35, 牛痘病毒蛋白CrmA等，都能抑制caspase的活性（5）FLIPs家族在病毒中发现的凋亡抑制剂，结构域中含有DED，与FADD或caspase-8竞争结合而发挥负调节作用,5、介导细胞凋亡的其它酶类,核酸内切酶: 多数作为caspase的底物而被活化并发挥作用，在核小体连接处切割染色体蛋白激酶：一些与caspase相互作用影响细胞凋亡的蛋白激酶，如PKC，DNA-PKcs（DNA-依赖性蛋白激酶，一种哺乳动物丝/苏氨酸蛋白激酶，参与损伤DNA的修复、维持细胞结构与功能的完整性，可被caspase-3催化而灭活）,总之，caspase是细胞凋亡调控的关键分子群，其活化是不同凋亡途径中共同的下游事件。活化的caspase通过切断与周围细胞的联络、重组细胞估价、阻止DNA复制和修复、破坏DNA和核结构、诱导凋亡小体的形成等，在细胞凋亡中起重要作用。,Key Concepts,靶细胞表面的Fas受体与作用细胞质膜表面的FasL（配体）相互结合，从而被激活.Fas 和TNF（肿瘤坏死因子）受体相关, FasL 类似 TNF.Fas与FasL结合后聚集成为三聚体结构.Fas受体胞浆区结构域即“死亡受体”， 作用是与其它蛋白质相互作用。,二、死亡受体介导的细胞凋亡,1、死亡受体的结构细胞表面有一类能结合细胞间凋亡刺激分子，并将信号传导至胞内引起凋亡的受体，称“死亡受体”(death receptor, DR) 。属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族。,Topology structure of DR,TNFR结构上包括：一个由1-6个富含Cys结构域构 成的保守的胞外区，一个60 80 个氨基酸组成的 “死亡结构域”(death domain, DD)的胞内区Fas/FasL信号途径中，还含有死亡效应结构域（death effector domain, DED)。该结构域同时存在于起始caspase分子中。,2、死亡受体介导凋亡的途径,通常FasL分子以同三聚体形式和3个 Fas分子交联，导致Fas的死亡结构域 DD成簇，并以DD为中介结合FADD， 形成死亡诱导信号复合体（DISC）。 随后，FADD通过其DED结构域和caspase-8的DED相互作用，导致caspase-8形成寡聚体，并驱使其自身活化活化的caspase-8进一步活化效应caspase, 如caspase-3等，使细胞发生凋亡。,TNF与其受体TNFR结合后，（1）能够活化转录因子NF-B 和AP-1，诱导促炎症和免疫调节基因表达 （2）通过与Fas L 相同途径诱导 细胞凋亡,通过对小鼠突变基因lpr的研究证实了这一凋亡信号通路. 该基因是Fas的隐性突变, 导致胸腺淋巴细胞增生,引起B细胞、T细胞免疫失衡. 另一具有类似作用的突变是gld (产生淋巴肉瘤疾病， lymphoproliferative disease). 证明该基因编码FasL.,The related properties of these two loci suggest that this apoptotic pathway is triggered by an interaction between the FasL ligand (gld product) and Fas (lpr product). 该通路对淋巴细胞的成熟至关重要,Mitochondria and Bcl-2 families are involved in Fas-induced apoptosis,三、线粒体与细胞凋亡（ Apoptosis involves mitochondrial events ）,Changes in mitochondria occur during apoptosis (and also during other forms of cell death) . These are typically detected by changes in permeability(线粒体通透性）. The breakthrough in understanding the role of mitochondria was the discovery that cytochrome c is released into the cytosol （细胞色素c释放）,1、细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的变化线粒体内膜通透性小，存在一些载体蛋白和质子泵，能有效地将线粒体基质内的质子泵入外室，形成内负外正的线粒体跨膜电位。几乎所有诱导剂引起各种细胞凋亡时都伴随有线粒体跨膜电位的下降，并且这种变化发生在凋亡细胞的形态学和生物化学改变之前。线粒体跨膜电位的部分维持依赖于线粒体膜通透性转运孔（MPT）。,生理条件下，MPT呈周期性开放，使线粒体外室的质子进入基质，从而防止质子在外室的过度蓄积。MPT的持续开放或关闭则分别诱导和抑制细胞凋亡。几乎所有诱导细胞凋亡的因素都可以造成MPT的破坏，如GSH耗竭剂、caspase-1等。MPT的持续开放将产生致死性后果，如跨膜电位和呼吸链脱偶联、GSH耗竭、ROS产生、基质Ca2+外流和线粒体膜间蛋白的释放等。这些因素进一步导致MPT的开放和跨膜电位的破坏,Mitochondrial damage affairs,2、线粒体释放的凋亡诱导分子,The mitochondrion plays a central role in apoptosis by releasing cytochrome c. This is activated by BID. It is inactivated by Bcl-2.Cytochrome c binds to Apaf-1 and (pro)-Caspase-9 to form the apoptosome.,在Bax过表达、UV照射、氧化剂、神经酰胺等因素的作用下，线粒体MPT开放，外膜破坏并释放Cyt C等凋亡相关分子，是介导线粒体凋亡途径中的重要效应分子。,caspase-9 (and other caspases)的蛋白水解酶活性 可被 IAP 家族抑制.线粒体可释放IAP蛋白家族的拮抗分子.,（1）Cyt C： 被释放至胞质的Cyt C在ATP或dATP的辅助下可特异性结合胞浆接头蛋白Apaf-1并促进Apaf-1寡聚化，Apaf-1借其N-端CARD直接募集多个 caspase-9分子，形成 “apotosome”,变构并活化 caspase-9.,活化的caspase-9再激活下游分子，包括caspase-3及可能随后被激活的caspase-2, -6, -8, -10。,Cyt C还是线粒体呼吸链的重要组成成分，Cyt C的耗竭可能导致呼吸链中电子传递的破坏使ATP生成受阻和ROS产生，进而诱导细胞坏死。Cyt C释放诱导凋亡还是坏死取决于细胞类型：Cyt C充足的细胞，仍然有足够的Cyt C维持电子转运，氧消耗和ATP声称2保持正常水平凋亡反之，在含有大量caspase抑制剂的细胞，Cyt C的释放不能诱导caspase依赖的细胞凋亡，MPT的破坏则诱导坏死,Antiapoptotic signalling by the PI3-kinase/Akt kinase pathway,(2)Smac (second mitochondria-derived activator of caspase),线粒体释放的caspase活化蛋白，MW 25 kD，N-端具有线粒体定位信号。Smac从线粒体释放后，与caspase活性抑制蛋白IAPs家族分子结合，从而解除IAPs对caspase的抑制。Smac在p53介导的细胞凋亡信号通路中起重要的促进作用，而Bcl-2、Bax则分别通过抑制和促进Smac的释放对细胞凋亡起调控作用。,（3）凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor, AIF）,1996年发现，存在广谱caspase抑制剂是，鼠肝细胞线粒体膜间隙组分仍有促凋亡活性，分离鉴定出AIF。AIF可直接进入细胞核，导致染色体浓缩、断裂，作用不依赖于caspase。 （4）Endo G（endonuclease G）MW 30 kD, 是一种可以切断DNA的caspase非依赖性核酸酶，进化上保守，在细胞凋亡中可导致DNA断裂和染色质浓缩。,四、There are multiple apoptosis pathways,（一）细胞核凋亡诱导途径以p53为中心的核凋亡通路及其转换机制在细胞凋亡的诱发中具有重要作用。当细胞面临DNA损伤、纺锤丝断裂、癌基因异常激活、缺氧等不利因素时，在上游信号分子的作用下，p53表达上调，一方面通过与p16, p21以及Rb等相互作用引起细胞周期阻滞，另一方面通过促进bax, fas等基因表达，诱导细胞凋亡。,（二）粒酶(Granzyme)B介导的细胞凋亡,细胞毒性T淋巴细胞杀伤靶细胞的机制之一是诱发细胞凋亡，这种凋亡 的作用主要是由它们分泌的粒酶B实现的。1、粒酶B（GrB）的基本结构与功能粒酶是CTL和NK细胞杀伤性颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称。以酶原形式合成，接受胞内外信号刺激后被激活。人类有5种：GrA、GrB、GrH、GrM和类胰蛋白酶-2粒酶的重要功能是参与颗粒介导的杀伤过程，酶切靶细胞内多种底物蛋白，有效启动细胞凋亡。,Properties of granzymes in humans and rodents Granzyme Species Activity Predicted cleavage Mr(kD) Cellular expression A Mo, H, Rt Tryptase Lysine, arginine 65* CTLs, NK cells, T cells and thymocytes B Mo, H, Rt Asp-ase Asp Glu 32 CTLs, NK cells, T cells and thymocytes C Mo, Rt Unknown Asp or Ser 27 CTLs D Mouse Unknown Hydrophobic 35-50 CTLs E Mouse Unknown Hydrophobic 35-45 CTLs F Mo, Rt Unknown Hydrophobic 35-50 CTLs G Mouse Unknown Hydrophobic 30 CTLs H Human Chymase Phen Tyr 32 CTLs and NK cells J Rat Unknown Unknown 30 Unknown M Mo, H, Rt Met-ase Met Leu 30 NK cells,JA Trapani, Genome Biology 2001, 2(12):reviews3014.13014.7,GrB活性中心由3个氨基酸组成：His44，Asp88，Ser183，其中Ser是发挥催化活性的关键残基。GrB与其它几种粒酶及穿孔素(perforin, PFN)等一起贮存于CTL的杀伤性颗粒中。其N-端带有一个酸性二肽，必须经颗粒中的二肽酰基肽酶1加工除去，才能产生活性GrB。 GrB活性受严格调控。（酶原形式，环境pH）。,2、粒酶B进入靶细胞的途径,当CTL识别靶细胞时，杀伤性颗粒迅速移向与靶细胞接触的位置-极化现象。发生脱颗粒，使其中的GrB等释放，接着进入靶细胞。进入途径有：PFN孔道模型：PFN在中性pH和Ca2+参与下，12-18个PFN形成直径1518nm的多聚复合体孔道，将GrB运输入胞。,GrB内吞模型：GrB是通过靶细胞膜表面受体介导内吞作用，进入靶细胞的内吞小体中。阳离子非依赖型6-磷酸甘露糖受体是GrB的死亡受体。PFN的主要功能是促使GrB从内吞小体中释放，进一步定位到细胞核与细胞浆，特异切割底物。,3、粒酶B诱导细胞凋亡的途径,（1）caspase依赖的死亡通路GrB可以切割激活多种caspase前体。此外，GrB还可以直接切割caspase下游底物，如PARP, DFF45, Bid等，进一步放大caspase的作用。,（2）GrB介导的线粒体凋亡途径,GrB高效切割Bid，产生截短型Bid转位至线粒体，并募集Bax嵌入线粒体膜，诱导线粒体释放Cyt C、Smac/Diablo等多种促凋亡分子。GrB诱导线粒体开启膜通透性孔道PTP和破坏跨膜电位，直接损伤线粒体功能。GrB还能使线粒体去极化，直接引起细胞死亡。这一过程需要胞内因子参与。,（3）GrB还可以直接切割DFF45使之失活，释放出核酸酶CAD，引起细胞核DNA片段化；GrB还可以直接迁移至核内，切割核蛋白，启动回促进核凋亡。在GrB诱导细胞死亡过程中，caspase依赖性途径和线粒体途径占主导地位，其它途径的作用相对较弱。但各途径之间也是相互协同、相互补充的。当病毒或肿瘤细胞干扰、破坏主要途径，逃避宿主免疫监视时，次要途径就发挥重要作用，清除异常细胞。,A schematic model of GrB mediated apoptosis,Putative extracellular (perforin-independent) roles for GrB in age-related chronic inflammatory disorders,Laboratory Investigation (2009) 89, 11951220,（三）内质网相关的凋亡诱导途径,Caspase-12前体分子主要定位在ER膜表面，可能与ER介导的细胞凋亡有关 钙离子通道剂A23187等作用下，ER表面的caspase-12被calpain剪切活化并释放到胞浆中，引起PC12等细胞凋亡。,(1)内质网蛋白质成熟和折叠的破坏导致内质网损伤从而引发细胞凋亡;(2)内质网凋亡蛋白酶caspase-12的激活;(3)内质网钙信号的异常(Breckenridge et al。2003)。(3) 内质网膜上也存在Bak等凋亡蛋白，在凋亡因子的刺激下，Bax也能在内质网上富聚，Bax和Bak的多聚化和caspase12的激活可导致细胞凋亡,Hu et al. J Biochem Mol Biol. 2005, 38(6):709-716Tan et al. JBC 2006, Apr 5, epub ahead,（四）细胞的脱落凋亡（anoikis）细胞与基质间的相互作用对细胞的生长和增殖有重要作用，如果失去基质的支持，细胞会发生程序性死亡，称脱落凋亡。整合素家族介导的相关蛋白激酶途径 起重要作用。包括FAK，PTK， PI-3K/Akt，MAPK，SAPK/JNK等。,Model for FAK-NT induced rounding and apoptosis in breast cancer cell lines,HIEC cellsselectively express PI3-K isoform complexes, translating into distinct roles in Akt-1 activation and cell survival, aswell as in a selective engagement by Fak and/or Src withinthe context of b1 integrin/Fak/Src-mediated suppression of anoikis,Apoptosis (2012) 17:566578,(五）necroptosis（necrosis + apoptosis，坏死状凋亡）,缺乏凋亡条件(如FasL, TNF等)的情况下，利用RIPK1激酶促发细胞坏死状凋亡,Aponecrosis 凋亡样坏死,指一类凋亡和坏死的混合形式。许多细胞毒性物质会在低浓度诱导PCD，在高浓度引起细胞坏死。假设细胞程序性死亡发生前细胞稳态过程已经受损，可以解释该现象。事实上，这是细胞毒性最常见的模式，从过氧化氢和其他氧化物到线粒体毒性物质antimycin A。Nicotera，Lipton和他们的同事证明了谷氨酸诱导的神经元细胞死亡，可能通过凋亡或坏死,依赖于线粒体膜电位改变和细胞内能量状态。然而，在大多数情况下，与坏死样形态学改变有关的aponecrosis并未证明是程序化的。,Apoptotic and necrotic hepatocellular death in response to stress signals,Journal of Reproductive Medicine and Endocrinology 2006; 3 (2): 103-108,4.3 检测凋亡的常用方法和技术,一、细胞形态学的评价1、普通光镜、荧光显微镜观察 分别对细胞核、质染色，计算凋亡细胞数目缺点：常受主观因素干扰，重复性较差,2、电子显微镜观察,凋亡细胞膜表面变化，如膜发泡和某些结构的丢失，染色质固缩和线粒体超浓缩用于定性研究, 不适于定量,necrosis,apoptosis,二、质膜完整性的评价检测,（一）细胞膜及核膜完整性的检测1、膜通透性检测（1）拒染实验 台盼蓝、碘化丙啶（PI）、EB等为膜不通透染料，可使坏死细胞或凋亡后期继发性坏死细胞核着色，而活细胞或凋亡细胞不着色。缺点：不能区别继发性坏死和真正意义上的坏死细胞；且易低估细胞死亡的程度，因为早期凋亡细胞还具有完整的细胞膜而被错误地当作活细胞。,（2）浓染实验Hoechst 33342、33258等为膜通透性染料，可之凋亡细胞着色浓密，区别正常细胞和凋亡细胞。（3）双重染色采用对正常细胞膜和凋亡细胞跨膜通透性不同的两种染料同时染色来区别常用流式细胞仪或荧光显微镜对丫啶橙（AO）和EB的双重染色的细胞进行分析。正常细胞AO染色呈绿色；凋亡细胞AO阳性，EB阳性红染。,2、Annexin V的检测,一种通过检测细胞膜结构的改变来区分活细胞、凋亡或坏死细胞的方法。凋亡细胞膜磷脂不对称，膜内磷脂酰丝氨酸外翻，与连接素（Annexin）V有较强的亲和力。因此荧光标记的Annexin V可以作为一种敏感探针来检测细胞凋亡同时使用膜不通透性染料PI能将凋亡细胞与坏死细胞区别,FCM detecting of Annexin V-conjugated cells,（二）线粒体等细胞器膜完整性的检测,通过检测线粒体跨膜电位的改变，来检测线粒体膜完整性一些带有正电荷、并具有膜通透性和亲脂性的荧光染料均能被活细胞摄取并堆积在线粒体中。当凋亡发生后，线粒体跨膜电位降低，染料减少，可借助流式细胞仪检测。,The fluorescent indicator provided aggregates in the mitochondria. healthy cells - red fluorescence. apoptotic cells - green fluorescence.,三、DNA断裂的检测,1、DNA ladder 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 180-200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1细胞色素c诱导0 h2细胞色素c诱导1 h3细胞色素c诱导2 h4细胞色素c诱导3 h5细胞色素c诱导4 h6阴性对照7Marker （ 自赵允、翟中和）,“DNA ladder”被作为细胞凋亡的一个重要的生化指标。 缺点：此方法敏感性不高，大量凋亡细胞同时存在时才出现典型的结果，且只能被用于细胞群体，不能用于组织的原位检测。,2、DNA凋亡峰的检测,凋亡细胞在固定和清洗中，易发生小分子量DNA流失，导致细胞内DNA含量减少应用DNA特异性荧光染料（PI，DAPI，Hoechst）染色后，在流式细胞仪进行的细胞周期分析中，凋亡细胞常以亚二倍体形式出现,3、TUNEL技术,原理:细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。,优点,未端脱氧核苷酸转移酶（TdT）使核苷酸在双链的断端延伸，不需要模板的存在由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。,缺点,值得注意的是坏死期由于内源性核酸内切酶和蛋白质酶的等作用，DNA被切割成大小不等的片段，常可出现 阳性反应；组织或细胞处理不当时也可出现假阳性。因而，TUNEL等方法对凋亡细胞的标记是选择性的,而不是特异性的。TUNEL或其他DNA裂解原位标记的分析应结合阳性细胞的形态，尤其是核的特征，细胞的分布和有无炎症反应，以排除非凋亡的阳性反应。,四、生化指标,Caspase 3的活化,细胞色素c的释放,Bcl-2的表达和磷酸化,Fas和FasL 的表达,4.4 细胞凋亡的调控,一、细胞自身蛋白的调控作用1、p53的调控作用 p53的基本结构：野生型p53蛋白为一393 AA的转录因子，活性形式为四聚体，自N-端为：转录活化区、DNA结合区、四聚体化区及C-端调节区。p53 C-端易被降解或发生磷酸化修饰,AA324-355对p53蛋白的四聚化是必需的，使之首先形成2个各由2个-折叠和2个-螺旋构成的二聚体，两个二聚体通过疏水作用连接成一个四螺旋结构,P53的表达及活性调节细胞中DNA损伤，纺锤丝断裂，癌基因异常激活，缺氧，以及ATP耗竭等信号都能导致p53水平的迅速升高和p53蛋白活化。（蛋白半衰期延长、转录上调）已发现几种探测DNA损伤的“分子探测器”ATM、DNA-PKcs、ATR等，可以将DNA损伤或胁迫信号传递给p53, 诱导细胞凋亡。,正常细胞中p53的含量和活性是受到严密监控的。HDM2（human double minute-2)是p53的最主要的负反馈分子，介导p53的胞浆转运和泛素化降解；JNK也可以结合p53并介导其泛素化降解细胞受到刺激时，众多激酶可以对p53分子的不同位点进行多种修饰，进而发挥不同功能。如p53的Ser15, Thr8, Ser20等被磷酸化后，HDM2不能与p53结合阻止降解；某些激酶磷酸化HDM2的p53结合位点，使其失去结合能力,14蛋白与HDM2结合，抑制HDM2的E3泛素连接酶活性，使p53免于降解,Regulation of p53 protein,53对细胞凋亡和细胞周期的调节作用细胞可以经过以p53为核心的信号转导机制进行基因修复、引起细胞周期阻滞、或诱导细胞凋亡p53主要作用于细胞周期的G1期、G2/M期、G0-G1-S-Rb等检查点，并引起细胞周期停滞。G1/S期调节点是p16-cyclinD1-CDK4-Rb途径，p16是cyclinD1-CDK4的负调节因子，Rb是cyclinD1-CDK4的主要靶蛋白，通过作用于E2F-DP转录因子复合体调节细胞周期S期必需基因。,53可以通过促进细胞周期抑制蛋白p21作用于p16、Rb等信号途径，抑制cyclin-CDK复合体，如cyclinD-CDK4, cyclinE-CDK2等的活性，,接着Rb去磷酸化，结合E2F并抑制E2F家族的转录调节活性，引起细胞周期停滞在G1期。,细胞周期在G1、G2/M期的停滞为DNA修复提供了时间，一旦修复失败，p53则在其它因素的配合下诱导细胞凋亡。,2、Bcl-2家族蛋白的调控作用Bcl-2是迄今研究最深入、广泛的凋亡调控基因之一。哺乳动物中已发现至少15个Bcl-2同源蛋白： 凋亡抑制蛋白：Bcl-2, Bcl-XL, A1/Bf-1, Bcl-W, Mcl-1等 凋亡诱导蛋白：Bax, Bcl-Xs, Bad, Bik, Bak, Bid, Hrk等,（1）Bcl-2家族的结构特点及其与功能的