细胞凋亡周期ppt课件.ppt

细胞生命活动之 -细胞凋亡、细胞周期,细胞凋亡（ Apoptosis）概念,为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。是机体主动、高度有序清除无用细胞过程。是生物体中一种普遍存在的现象。,与细胞坏死 (Necrosis) 相区别，坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。,细胞凋亡生理意义, 蝌蚪尾的消失,脊椎动物的神经系发育 约50%细胞凋亡,发育过程中手和足形成 蹼消失,细胞凋亡与疾病,细胞增殖,细胞凋亡,生与死的平衡,癌症自身免疫长期感染,I型糖尿病神经退行性疾病：老年痴呆、帕金森氏症、亨廷顿氏症等心肌梗塞艾滋病,细胞凋亡多事件发生,1 细胞凋亡之细胞膜事件,磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)是一种细胞膜活性物质，正常细胞中，其位于细胞膜脂质双层内侧,在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面。,细胞凋亡之细胞膜事件,早期凋亡特征：磷脂膜(PS)外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI染色为阴性DNA没有发生断裂,早期凋亡PS检测及结果判定,经典明星产品,细胞膜变化的检测：Annexin V/PI,优点：简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞,样本设置：1. 空白对照：辅助判断管，即不加Annexin V/PI，但用它调电压的话，电压偏高，即根据它确定的阴阳性界限是偏低的。2. 阴性对照：未诱导的，Annexin V/PI双染，细胞绝大部分都在双阴性区域，用它来确定两荧光通道的电压，这是为了排除非特异性结合。3. 单阳样本：诱导凋亡，Annexin V单染，用来调补偿4. 单阳样本：诱导凋亡，PI单染，用来调补偿,注意事项：1. 细胞制备或储存时细胞膜损伤，造成假阳性2. 贴壁细胞消化时避免使用EDTA，螯合钙离子,FAQ常见问题回复,1. 是否 Annexin V Kits 可以检测小鼠或其他物种?Annexin V试剂盒可以检测多种属2. 这个试剂盒是否可用于贴壁细胞、固定或冻存的细胞、或组织?No. 上述样本的细胞细胞膜都会或多或少受到损害，这样的样本建议用免疫荧光技术,3 当样本表达GFP（绿色荧光蛋白），还能使用Annexin-FITC吗？,FAQ常见问题回复,推荐使用Annexin V-APC/7-AAD染色,4.贴壁细胞酶消化，应注意哪些事项？0.25%胰酶消化：过渡消化损伤细胞，可在消化时加2%BSA防过渡消化胰酶含EDTA(钙离子螯合剂）：标记Annexin V前用1xPBS或1xbinding buffer洗脱，清除EDTA,以免螯合钙离子，影响Annexin V结合 5. 是否与细胞表面标记兼容? 只要Ca离子不影响该表面Marker就可以同时做,FAQ常见问题回复,2 细胞凋亡之线粒体,Fluo-3-Am为高度特异性Ca2+荧光指示剂，是膜通透性染料，可以灵敏地反映细胞内游离钙离子浓度的变化Fluo-3-Am本身荧光弱，进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶的Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与细胞内游离钙结合后产生较强荧光。,FLUO-3/AM检测钙离子流：凋亡早期，线粒体膜内钙离子外流到胞浆，细胞膜外钙离子内流。,线粒体事件,JC-1检测线粒体膜电位变化（JC-1是一种阳离子脂质荧光染料）,原理：JC-1有有单体和多聚体两种存在形式，高浓度时多聚体，发红色荧光（FL2检测），低浓度时单体形式，发绿色荧光（FL-1检测）。正常细胞：膜电位正常，JC-1靠线粒体膜极性进入线粒体内，随浓度升高多聚体，红光凋亡细胞：线粒体膜电位去极化，JC-1从线粒体释放，浓度降低，转为单体，绿光通过检测绿色和红色荧光：,流式检测结果,定性(细胞群的偏移）定量（细胞群的荧光强度）检测线粒体膜电位的变化,优点：操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测,3细胞凋亡之 caspase检测, 背景知识 细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶） Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞的重要组分，即Caspase 3激活=细胞凋亡,检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的Caspase活性。WB IF IHC ELISA FLOW,细胞凋亡之 凋亡相关酶检测,细胞凋亡之caspase-3,细胞凋亡之 caspase-3,Jurkat T-Cells Mouse Thymocytes,细胞凋亡之 caspase-3,固定、破膜过程,细胞凋亡之 caspase-3,通过酶和底物显色进行Caspase酶活检测试剂盒,4细胞凋亡之 核内DNA事件,凋亡晚期特征DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成185bp为基数的有序片段。检测方法Tunel流式法:通过在核酸片段末端标记优势计算凋亡百分比末端转移酶标记技术,细胞凋亡之 核内DNA事件,细胞凋亡之 核内DNA事件,通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP （多为dUTP）接到DNA片段的3-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。通常检测方法：FCM IHC,Tunel方法,一步法实验用2种染料PI染色总DNA：得到细胞周期的信息；FITC-dUTP染色凋亡细胞：检测凋亡。在流式细胞仪488nm激发下，PI发射约623nm荧光，FITC发射520nm荧光。,Tunel方法,二步法PI染色检测细胞周期FITC染色检测凋亡（如果不需要周期信息，则可不做PI染色步骤）,31,核内DNA事件之 明星产品,不同时期凋亡的检测指标的选择早期：Annexin V早中期：Cytochrome C 和线粒体相关中晚期：Caspase-3, 8, 9, other proteins晚期：DNA Fragment,检测水平 细胞核酸细胞膜胞内通路线粒体,检测方法免疫荧光 TUNEL法 Annexin V/PI Caspase 通路 线粒体膜电位,细胞生命活动之：细胞周期,2.1细胞周期,细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。,利用特殊的荧光染料(PI等)与细胞内DNA碱基结合，被这些荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量。,2.1.1细胞周期检测原理,细胞周期的样本制备,样本来源 培养的细胞、血液、骨髓、体液、灌洗液、外科手术活检、细针穿刺物等的细胞都可用来做DNA分析。 新鲜的、冰冻或固定保存的、或常规固定/包埋用于组织检查的样本均可。通常最好的结果来自新鲜标本。 标本的细胞数应106注意事项： 获得单个细胞，尽量避免DNA的降解 样本最关键的就是减少碎片（EDTA/不可过度吹打/离心rpm） PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解 PI质量及RNase所加量很重要，建议用商品化试剂 污染脱氧核糖核酸酶会降解DNA，故玻璃器皿和试剂要干净灭菌,细胞周期样本检测,注意事项：1. 进样速度：一般检测细胞浓度调整为2E52E6/ml，进样速度为低速。若峰形较宽，可能就是进样速度太快2. 仪器质控定期做，尽可能排除因机器设置引起的峰形加宽3. 排除粘连细胞（FL2-A/FL2-W）通过电压脉冲信号的宽度和面积区别实体组织标本中的粘连细胞群体，最大程度的减少粘连细胞带来的假阳性结果,细胞周期样本检测,结果分析,CellQuest、WinMDI等软件均可以进行分析，但需要手工进行参数统计和计算；推荐使用ModFit分析软件（分析如下：）1. 打开软件；2. 在FL2-W/FL2-A散点图中设定单个细胞门（R1），去除聚集细胞，必要时可以设两个门。3. 在FL2-A直方图中显示R1中细胞的DNA含量直方图备注：该软件可以自动分析，也可手动分析；可以分析凋亡、异倍体、各期比例等；结果均自动计算。,结果分析,正常细胞周期分析,肿瘤组织中的各种DNA倍体,肿瘤细胞,细胞周期与肿瘤,辅助肿瘤早期诊断与鉴别诊断,研究药物对细胞周期的影响,细胞周期与药物研发,