第六章酶工程制药ppt课件.ppt

复习,1、简述多抗、单抗制备的主要程序？,2、简答鼠源抗体在免疫导向中存在的缺陷？,3、基因工程抗体、抗体组合文库的概念?,作业：1、酶和细胞的固定化？ 2、酶在医药领域的应用？,第六章 酶工程制药,教学重点： 掌握固定化技术、酶的修饰、酶工程在制药工业的应用；了解酶特点及分离纯化。教学难点： 酶反应器 课时：6学时,主要内容,第一节 概述第二节 酶的分离纯化第三节 酶和细胞的固定化第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器第五章 固定化酶产品介绍（自学）,概述,一、酶工程简介二、酶的基础知识三、现代酶工程的主要内容四、酶的来源和生产五、酶在医药领域的应用,第一节 概述,一、酶工程简介 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。,酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。1953年，德国人提出了酶固定化技术 。1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨基酸。1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。,二 、酶的基础知识,（一）酶是生物催化剂酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。催化高效性专一性：结构专一性；立体异构专一性酶具有不稳定性,8,（二）酶的化学本质蛋白质,9,必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。,活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。,必需基团,活性部位,维持酶的空间结构,结合基团,催化基团,专一性,催化性质,三、现代酶工程的主要内容：,1.酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；2.酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测；3.酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；4.酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；,5.有机相中酶反应的研究；6.酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；7.抗体酶、核酸酶的研究；8.模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。,12,四、酶的来源和生产,（一）酶的来源 酶的生产目前多数直接从生物体中提取分离。非常少的是合成，基因工程。早期酶的生产：以动植物为主要原料，如激肽释放酶（胰脏）、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近10年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。,13,微生物生产酶的特点,1.微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都年从微生物中得到；2.微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控制培养条件来提高酶的产量；3.微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的高产菌株。,14,（二）酶的生产菌,1、对菌种的要求： （1）产酶量高、酶的性质符合要求、最好是胞外酶；（2）不是致病菌；（3）稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体；（4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。,15,2、生产菌的来源：1）菌种保藏机构和有关研究部门，但大量的工作应是从自然界中分离筛选菌样采集、菌种分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。2）改良（如基因突变、基因转移和基因克隆）。,16,3、目前常用的产酶微生物,E.coli：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶枯草杆菌：主要用于生产-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。,17,啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等；曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。,18,五、酶在医药领域的应用,1.在疾病诊断方面的应用由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和等催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景。酶学诊断方法：1）是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，2）利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。,19,根据体内酶活力的变化诊断疾病:一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。,胰腺癌：胰蛋白酶、胰型同工酶等升高肝炎：转氨酶升高,20,用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病：人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者某些组织器官受到损伤，就会引起体内某些物质的量或者存在部位发生变化。通过测定体液中某些物质的变化，可以快速、准确地对疾病进行诊断。酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶来测定体液中某些物质的含量变化，从而诊断某些疾病。,21,2.在疾病治疗方面的应用-酶类制剂 酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病的酶称为药用酶。,药用酶具有疗效显著，副作用小的特点，在疾病的治疗方面的应用越来越广泛。,溶菌酶：抗菌消炎和镇痛,22,1）消化类： 研究最早，是品种最多的一类酶.在这一类酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶等。,健美生消化酶帮助肠胃蠕动,23,2）抗炎净创类：目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。多数是蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，-淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等。,24,3）血凝和解凝类：都是从血液中提取出来的。凝血酶的作用：促使血中纤维蛋白原变成不溶性纤维蛋白,从而促使血液凝固，防止微血管出血。例如：蛇毒抗凝酶、促凝血酶原激酶。纤维蛋白溶解酶的作用：是溶解血块，为目前临床上最新的一种酶制品,治疗血栓静脉炎、冠状动脉栓塞等。例如:东菱克栓酶抑肽酶作为肽酶抑制剂：广泛应用于体外循环手术，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的渗血，消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡。,25,4）解毒类：主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的一种有害物质。主要品种有青霉素酶、过氧化氢酶和组织胺酶等。青霉素酶能够分解青霉素分子（青霉噻唑）中的一内酰胺环，使变成青霉素铜酸，消除因注射青霉素引起的过敏反应。,26,5）抗肿瘤的药用酶：L-天冬氨酸酶是第一种用于治疗白血病的酶；癌细胞缺乏天冬氨酸合成酶，自身生长时不能合成天冬氨酸， L-天冬氨酸酶可以切断外来的天冬氨酸供给。,27,3.在药物生产方面的应用利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方面的应用日益增多。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的。4.在分析检测方面的应用酶法检测或酶法分析如：ELISA,免疫组织化学，Western blot中的HRP,28,1、细胞破碎2、酶的提取3、酶的分离方法4、酶的组合分离纯化策略5、酶的浓缩、干燥与结晶,第二节 酶的分离纯化,一、酶的分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。,30,二、酶的提取,（一） 细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎,JY92-II D超声波细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,31,1.采用缓冲体系：防PH大幅度变化而失活2.添加保护剂：防活性基团活性中心受影响3.抑制水解酶的作用：加酶抑制剂4.其他保护措施：温度，PH，搅拌，光照，氧化等影响,为了保护目的酶的生物活性，常采取下列保护措施：,32,（二）酶的抽提,将酶从生物组织或细胞破碎液以溶解状态最大限度释放出来的过程。,33,(三）沉淀分离,粗提物：经细胞破碎和抽提后，得到的含目的酶的无细胞抽提物。,34,（四）、酶的纯化,过滤与膜分离电泳离子交换层析,35,第三节 酶和细胞的固定化,一、固定化酶的制备1、固定化酶的定义:指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。,36,2、固定化酶的特点,（1）可以多次使用，酶的稳定性提高；（2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。（3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；（4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更适合于多酶反应。,酶和细胞的固定化方法,热处理（细胞）,载体结合法,交联法,包埋法,网格型,微囊型,3.酶的固定化方法与技术,38,39,（1）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。A.物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。活性碳,多孔玻璃,树脂等优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再用。缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。,40,B、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。DEAE-纤维素等优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响，离子强度高时，酶易脱落。,41,C、共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。缺点：反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应。,42,（2）交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。交联法交联酶法酶与辅助蛋白交联法吸附交联法载体交联法常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。,43,酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,44,（3）包埋法：,A、网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶，多用于固定化细胞。,45,B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。,46,47,新型的酶固定化方法,温和的条件下进行，减少酶活力损失，提高固定化效率光偶联法：光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶无载体固定化酶：直接用交联剂交联用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶、和喷雾干燥酶等四种无载体酶体系， 。,48,无载体固定化酶优点如下：1.催化活性高，成本低2.具备较高的催化剂比表面3.可加入多种酶4.底物扩散受限制少5.极端条件下稳定性高,二、 固定化细胞的制备,1、固定化细胞：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶同被称为固定化生物催化剂。固定化细胞主要利用细胞内酶及酶系比固定化酶更普遍。如今该技术已扩展至动植物细胞，甚至线粒体、叶绿体及微粒体等细胞器的固定化。,2、固定化细胞的特点,为什么要固定化？E颗粒小、难于截流或定位，而固定化细胞不仅兼具细胞特性、生物催化功能及固相催化剂特点。特点：无需进行酶的分离纯化； 细胞保持酶的原始状态，故酶活回收率高； 细胞内酶比固定化酶稳定性更高； 细胞内酶的辅因子可以自动再生；细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应； 抗污染能力强。,3、固定化细胞的制备技术,固定化酶主要适用于细胞内酶，底物和产物易于透过细胞膜，细胞内不存在产物分解系统及其它副反应。固定化细胞技术主要有载体结合法、包埋法、交联法及无载体法。这些技术与前面提到的相关固定化酶的技术类似。,52,三、固定化方法的选择依据1.固定化方法的选择（1）固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。（2）固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。（3）固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、设 备和劳务投资等。,53,2、载体的选择,一般是为了工业化生产，因此性能好、价格便宜是一项重要的指标。如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用前途的载体。载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收固定化酶。,3.常用的固定化酶载体材料（自学）,四、固定化酶（细胞）的性状和性质,1、固定化酶的形状（1）颗粒状：包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶珠。（2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。,55,（3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。（4）管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。酶管的机械强度大，切断后可用于填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶 等酶管。,2、固定化酶的性质 （1）酶活力的变化：酶经过固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。 （2）酶稳定性的变化：包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。,操作稳定性；贮藏稳定性；对蛋白酶的稳定性。,（3）酶学特性的变化 A、底物专一性：对底物的专一性下降。 B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。 C、最适温度：一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。 D、最大反应速度（Vm）：变化很小或不变。,58,五、评价固定化酶（细胞）的指标,1.固定化酶活力测定活力回收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力相对活力固定化酶总活力/（加入酶的总活力上清液中未偶联的酶活力）2.偶联率及相对活力的测定,第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器,用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。,酶催化反应过程示意图,过程调控,生物反应器,消毒,原料预处理,产物分离提纯,产品,生物催化剂制备,空气,除菌,能量,热量,60,常见的酶反应器类型（了解）,按结构区分搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor, STR）鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR )填充床式反应器(packed column reactor, PCR )流化床式反应器( Fluidized Bed Reactor, FBR)膜反应器(Membrane Reactor, MR) 按操作方式区分分批式反应(batch )连续式反应(continuous )流加分批式反应(feeding batch ) 混合形式连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor, BSTR）,61,一、反应器的类型和特点,1.间歇式搅拌罐反应器用于游离酶反应后随即放料。又称为批量反应器。特点：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。,优点：装置较简单，造价较低缺点：固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。,63, 连续流动搅拌罐反应器,连续进料、连续出料连续搅拌釜式反应器。向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。,底物溶液进口,反应液出口,优点：混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。缺点：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。,3. 鼓泡式反应器,用于游离酶和固定化酶的催化反应。在使用鼓泡式反应器进行固定化酶的催化反应时，反应系统中存在固、液、气三相，又称为三相流化床式反应器。鼓泡式反应器的结构简单，操作容易, 剪切力小，物质与热量的传递效率高，是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器。例如氧化酶催化反应需要供给氧气，羧化酶的催化反应需要供给二氧化碳等。,4. 喷射式反应器,利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化的反应器喷射罐和维持罐组成一般用于耐高温酶的催化,5. 膜反应器,膜反应器是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。,68,6.填充床反应器,固定化酶添充于床层内。反应器内的流体的流动形态为平推流形。底物以恒定流速通过反应床.,70,优点：高效率、易操作、结构简单等，是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。缺点：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用填充床反应器,特点：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态,达到混合的目的。,7.流化床反应器,72,各种反应器的示意图,73,各种酶反应器的特点,74,二.酶反应器应用的注意事项（1）保持酶反应器的操作稳定性：一定时间后，检查酶活力，进行补充和替换（2）保持流体的流动方式和状态：流动状态的改变，会影响酶与底物，产物的接触（3）防止酶的变性失活:控制温度，PH，金属离子，剪切力（4）防止微生物污染：一般不必严格无菌操作，但底物与产物为营养物时，需防微生物污染。,75,措施：要求环境清洁，反应器使用前后进行清洗和消毒严格管理，经常检测加消毒剂等采用较高温度和低的PH,76,三.生产能力的下降及对策酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因是固定化酶活性降低或损失。造成固定化酶活性损失的原因：（1）酶本身的失活；（2）酶从载体上脱落；（3）载体的破碎或溶解。,77,第五章 固定化酶产品介绍,(1)氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶，可以用于生产各种L-氨基酸药物。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。,78,固定化酶法生产L-氨基酸,79,储罐,反应产物,消旋反应器,固定化酶柱子DEAE-葡聚糖氨基酰化酶,晶体 L-Ala,L-Ala A-D-Ala,A-L-Ala A-D-Ala,80,(2)天门冬氨酸酶：1973年日本用聚丙烯酰胺凝胶为载体，将具有高活力天门冬氨酸酶的大肠杆菌菌体包埋制成固定化天门冬氨酸酶，用于工业化生产，将延胡索酸转化生产L-天门冬氨酸。1978年以后，改用角叉菜胶为载体制备固定化酶，也可将天门冬氨酸酶从大肠杆菌细胞中提取分离出来，再用离子键结合法制成固定化酶，用于工业化生产。,81,(3)天门冬氨酸脱羧酶：将含天门冬氨酸脱羧酶的假单胞菌菌体，用凝胶包埋法制成固定化天门冬氨酸脱羧酶，于1982年用于工业化生产，催化L-天门冬氨酸脱去羧基，生产L-丙氨酸。,82,(4)青霉素酰化酶：是在药物生产中广泛应用的一种固定化酶。可用多种方法固定化。1973年已用于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头孢菌素。用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变pH等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6一氨基青霉烷酸(6一APA)或7一氨基头孢霉烷酸(7一ACA)，也可以催化6一APA或7一ACA与其他的羧酸衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基团的青霉素或头孢霉素。,83,固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸,青霉素酰化酶与抗生素改造,84,85,86,E.Coli 斜面 细胞 固定化细胞 青霉素G 转化液 滤液 6-APA 粗品,培养,固定,转化,过滤,抽提,1.技术路线,87,青霉素酰化酶转化流程图,