第五章微生物的生长繁殖与生存ppt课件.ppt

第五章 微生物的生长繁殖与生存因子,相关定义第一节 微生物的生长繁殖第二节 微生物的生存因子第三节 其他不利环境因子对微生物的影响第四节 微生物与微生物之间的关系第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,相关定义生长：微生物利用营养物质，细胞物质的量增多，体积增大。繁殖：微生物细胞体积增大到一定程度时，细胞数目增多的过程。,第一节 微生物的生长繁殖,微生物的生长规律微生物的连续培养生长曲线在实际中的应用微生物生长量的测定方法,微生物的生长规律,分批培养：将一定量的微生物接种在一个封闭的盛有一定量液体培养基的容器中，保持一定的温度、pH和溶解氧，一定时间后停止培养。,同步生长：通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态。获得细菌同步生长的方法： 通过环境条件来诱导同步性，包括变换温度、光线、培养基等。 通过物理方法随机地从不同步细菌群体中选择出同步的群体，选择性过滤、梯度离心。,典型生长曲线定量描述非丝状单细胞微生物分批培养时,液体培养基中微生物群体生长规律的经典曲线。以时间为横坐标，细胞数目（或是对数）为纵坐标的曲线。,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,生长曲线的制作,接种的培养基中细胞变化趋势,菌种接种于培养基中后，细胞需要适应新的环境，因此细胞数目不增加；经过基础物质的积累，且因营养物质丰富，所以细胞迅速分裂，细胞数目急剧增加；细胞的繁殖导致营养物质不断减少，某一种营养物质不足时，有的细胞利用细胞内的累积物继续分裂，而会有一部分细胞因营养不足而死亡，表现为细胞数目不变；培养基中营养进一步匮乏，细胞不断裂解，细胞数目减少。,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,延滞期：少量细胞接种到新培养基后的一段细胞数目不增加的适应期。其长短主要受微生物的接种龄、接种量和培养基成分的影响。,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,对数期：细胞数以几何级数增长的一段时期。其时间长短主要受菌株种类、营养成分和营养物质浓度的影响。,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,稳定期：新繁殖的细胞数目与衰亡的细胞数目相等的一段时期。,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,衰亡期：细胞死亡数目超过新生的细胞数目的时期。死亡的细胞发生自溶。,延滞期（lag phase）又称停滞期、适应期细菌数目不增长的时期。特点：生长速率常数等于零；细胞形态变大或增长；RNA尤其rRNA含量增加，合成代谢活跃；对外界不良条件敏感。 影响延滞期的因素：1）接种龄；（对数期，则短；延滞期或衰亡期，则长；稳定期，居中。） 2）接种量（负相关） 3）培养基成分（丰富则延滞期短）,指数期（exponential phase）又称对数期以几何级数速度分裂的一段时期特点：生长速率常数R最大，则细胞每分裂一次所需要的代时G或原生质增加一倍所需时间最短；细胞进行平衡生长，各种组分最为均匀；细胞内酶系活跃，代谢旺盛。,1）繁殖代数：n（lgx2lgx1）/lg2=3.322(lgx2lgx1)2) 生长速率常数 Rn/(t2-t1)=3.322(lgx2lgx1) /(t2-t1)3)代时（G）：G=1/R=(t2-t1)/ 3.322(lgx2lgx1),影响因素：1）菌种； 2）营养成分（营养丰富则代时短,指数期则短） 3）营养物浓度（概念：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物称为生长限制因子） 4）培养温度（适合温度）,稳定期（stationary phase）死亡细胞数目和新增殖细胞数目平衡。平衡后期，曲线有下降趋势。菌体产量与营养物貭的消耗间呈现一定的比例关系。生长产量常数 Y（xx0）/(C0-C)= （xx0）/ C0 x：稳定期的干重；x0：刚接种时的细胞干重； C0：限制性营养物的最初浓度,在稳定期，细胞开始贮存糖原、异染粒和脂肪等贮藏物，产芽孢，产次生代谢产物。 可通过补料、调节pH、调整温度、流出产物等措施以延长稳定期累积更多的代谢产物。出现的原因：生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调；有害物质的累积；pH、氧化还原势等物质条件越来越不适宜。,衰亡期（decline phase）死亡后自溶释放出一些产物如：氨基酸、转化酶、外肽酶、流出培养物。因此可以在这个时期收集细胞内溶物。,一些细菌的代时,菌名培养基培养温度 代时E. coli（大肠杆菌） 肉汤 3717minE. coli 牛奶 3712.5Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）肉汤或牛奶 371618E. aerogenes 组合 372944B. Cereus（蜡状芽孢杆菌）肉汤3018B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌）肉汤5518.3Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌）牛奶376687Streptococcus lactis（乳酸链球菌）牛奶3726S. lactis乳糖肉汤3748Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）肉汤3723.5Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌）葡萄糖2534446Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合3779293Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌）组合271200,例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（ B ），经4h （ t ）后增加到49，000，000（ b ），这样， n (lg4.9107lg1.2104）0.30112,借助于 n 和 t ，还可以计算出不同培养条件下的代时G， G t / n在本例中， G 460 / 12 20min该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。,微生物的连续培养又称开放式培养。包括两种形式：流进新鲜培养基；流出培养物恒浊器（生长密度）培养：通过控制培养液中细胞浓度即浊度来完成。 恒化器培养：通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的。,恒浊培养,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如氨基酸、乳酸、乙醇等。,恒浊器与恒化器的比较,生长曲线在实际中的应用,细菌生长曲线在污、废水微生物处理中的应用常规活性污泥法利用减速期/稳定期的微生物 生物吸附法（生物膜法）利用稳定期的微生物 高负荷活性污泥法利用对数期/减速期的微生物 低负荷活性污泥利用衰亡期的微生物。延时曝气法：内源性呼吸阶段的微生物,微生物生长量的测定方法,测定微生物总数：计数器直接计数；比例计数法；比浊法测定活细菌数：平板菌落法（CFU）计数；液体稀释培养计数计算生长量：测细胞干重法；通过测细胞含氮量确定细胞浓度,血球计数板法,首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物。如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物。这种方法适合于细胞较大的微生物。,液体稀释法2,测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。,测生长量的方法,其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,第二节 微生物的生存因子,温度pH溶解氧氧化还原电位水活度渗透压,温度： 对于微生物而言，温度可分为适合生长温度、最高生长温度、最低生长温度根据微生物对温度的要求可以区分微生物为嗜冷微生物、嗜热微生物、嗜温微生物等,H（59） 最适生长pH偏碱范围内的微生物称为嗜碱性微生物或是耐碱性微生物；偏酸范围内的微生物称为嗜酸微生物或是耐酸微生物培养基内中性成分：糖类发酵氧化 有机酸 脂肪水解有机酸蛋白质脱羧胺类无机盐：NH3 NO3-,微生物 pH值 最低 最适 最高Thiobacillus thiooxidans 氧化硫硫杆菌 0.5 2.03.5 6.0Lactobacillus acidophilus 嗜酸乳杆菌 4.04.6 5.86.6 6.8Rhizobium japonicum 大豆根瘤菌 4.2 6.87.0 11.0Azotobacter chroococcum 圆褐固氮 4.5 7.47.6 9.0Nitrosomonas sp. 硝化单胞菌 7.0 7.88.6 9.4Acetobacter aceti 醋化醋杆菌 4.04.5 5.46.3 7.08.0Staphylococcus aureus 金黄葡球菌 4.2 7.07.5 9.3Chlorobium limicola 泥生绿菌 6.0 6.8 7.0Thurmus aquaticus 水生栖热菌 6.0 7.57.8 9.5Aspergillus niger 黑曲霉 1.5 5.06.0 9.0一般放线菌 5.0 7.08.0 10.0一般酵母菌 3.0 5.06.0 8.0,H对微生物的影响：1）引起细胞膜电荷的变化，影 响 对营养物质的吸收 2）影响胞内及胞外酶的活性培养基中pH调节的措施：外源调节:碱(NaOH 或KOH) 酸(H2SO4或HCl)内源调节:缓冲溶液;CaCO3,溶解氧：根据对溶解氧的要求，可将微生物分为专性好氧微生物、兼性厌氧微生物、微好氧微生物、耐氧微生物及厌氧微生物。专性好氧微生物（strict aerobe）：环境中有足够氧才能生存 O2作为最终氢受体，以呼吸方式产能。细胞含有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶、过氧化氢酶,兼性厌氧微生物（facaltative aerobe）环境中有氧时，靠呼吸产能。环境中氧不足或是无氧时，借发酵或无氧呼吸产能。 细胞中含SOD和过氧化氢酶。微好氧菌（microaerophilic bacteria） 只能在较低的氧分压条件下生长的微生物。 含SOD和过氧化氢酶。,耐氧菌（aerotolerant anaerobe）有氧条件下进行厌氧生活，靠专性发酵获能量。含SOD、过氧化物酶，而无过氧化氢酶 厌氧菌（anaerobe） 严格生活在无氧条件下，靠发酵形式产能。O2可以抑制这一类微生物的生长,溶解氧在细胞中能转化为过氧化氢及氧负离子自由基，均对细胞有害O22HH2O2 O2+eO2 好氧微生物及兼性厌氧微生物细胞中具有一定酶，可以转化过氧化物。O2 SOD H2O2 NADH过氧化物酶 H2O H2O2 过氧化氢酶 H2OO2 而厌氧微生物细胞中无相应的酶，不能解除过氧化物的危害，因此必须生活在无氧条件下,H2O + O22 O2 + 2H+O2 + H2O22H2O,12,SOD好氧生物和耐氧细菌,过氧化氢酶 好氧生物,过氧化物酶 NADH2NAD耐氧菌,氧化还原电位好氧微生物要求的Eh为300400mV专性厌氧微生物要求的Eh为300-400mV可以利用还原剂如抗坏血酸（Vc）硫二乙醇钠 谷胱苷肽等维持一定的Eh,水的活度的影响水活度aw表示水被吸附和溶液因子对水可利用性的影响的一种指标。一定温度下，某溶液或物质在与一定空间空气相平衡时的含水量与空气饱和水量的比值，用百分率表示。大多数微生物在aw为0.950.99时生长最好；而嗜盐细菌在低于0.8的培养基中生长最好。,渗透压：培养基中无机盐的渗透压为（0.51）101kpa对于一般微生物来说，在含盐5%30%或含糖30%80%的高渗条件下可抑制或杀死某些微生物。但各种微生物承受渗透压的能力不同，有些能在高渗条件下生长，称其为耐高渗微生物。低嗜盐菌：能在2%5% 盐溶液中生长中嗜盐菌： 5%20%极端嗜盐菌： 20%30%,第三节 其他不利环境因子对微生物的影响,辐射对微生物的影响 微波和超声波的影响 重金属对微生物的影响极端温度对微生物的影响干燥对微生物的影响极端pH对微生物的影响若干有机物对微生物的影响,辐射对微生物的影响紫外线： 100400nm260nm 破坏核酸（胸酰嘌呤二聚体） 280nm 破坏蛋白质 有O2时： u.v.+ O2O3,电离辐射：辐射：100nm 宇宙射线、射线、x射线（电离射线）破坏核酸骨架 H2O辐射H+O2- 可引起水和其他物质的电离，产生游离基，使核酸、蛋白质或酶发生变化，造成细胞损伤或死亡。,微波：微波的范围在9152450MHz之间。机理：微波产生热效应，使蛋白质、酶等物质变性，导致微生物死亡。 特点：加热均匀，热能利用率高、加热时间短。应用：食品消毒、灭菌。,微波和超声波的影响,超声波对微生物的影响： 频率大于20000Hz的声波 造成细胞内含物胶体发生絮状沉淀 使液体中气体变成无数极微小的气泡冲击细菌，溶液中产生压力变化，使之死亡。超声波杀菌效力大小与频率、强度、处理时间等多种因素有关。,重金属对微生物的影响：可以凝固蛋白；灭活酶的巯基；与代谢产物发生螯合,极端温度对微生物的影响高温对微生物的影响：蛋白、核酸在高温下能发生变性反应， 从而影响酶的活性和微生物的正常代谢。幼菌对温度较敏感，营养体对高温比芽孢敏感,干热灭菌：使细胞膜破坏，蛋白变性，原生质干燥以及各种细胞成分发生氧化，从而杀灭微生物。 1）灼烧灭菌法：针对接种环等金属工具2）干热灭菌法：主要适用于金属或玻璃器皿等,于170下灭 1h, 或160下灭2h。,湿热灭菌：利用水及蒸汽加热的方式灭菌，水蒸汽的潜热灭菌效果较好。湿热灭菌比干热灭菌有效，分为常压灭菌和加压灭菌。 真菌的孢子耐热 80 细菌的芽孢耐热 120,常压法（pasteurization）巴氏消毒法6085处理15秒30分：低温维持法（63 30分）高温瞬时法（72 15秒）煮沸消毒法间歇灭菌法：或称丁达尔灭菌法、分段灭菌法。主要针对于芽孢的抗热性。80100煮1560分37过夜80100，重复3次,加压法：常规加压法 121 （0.101MPa，1kg/cm2 or 15磅/英寸2）1520分钟 或115 30分钟（针对于含糖培养基）连续加压法：135140过热蒸汽维持 515秒优点：营养成分破坏得轻；缩短周期；提高锅炉利用率；适宜于自动化操作；降低工作人员得劳动强度。,注意事项：排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。,灭菌器的气体流动图,影响加压蒸汽灭菌效果的因素： 1、灭菌物体含菌量的影响（天然原料含菌量高，而纯粹化学制剂配制的含菌量少） 2、灭菌锅中空气排除程度影响（排不尽，会出现压力够而温度不够的情况） 3、灭菌对象pH的影响（pH 68 不易死亡；小于6，易死亡） 4、灭菌对象的体积 5、产热和散热的速度,干燥对微生物的影响直接影响微生物代谢速度干燥能引起微生物细胞内蛋白质的变性和盐类等物质浓度提高，从而抑制生长或造成微生物死亡。,极端pH对微生物的影响影响微生物细胞表面电荷，进而影响营养物质吸收；影响培养基中有机化合物的离子化作用，进而影响吸收；影响胞内外酶的活性,若干有机物对微生物的影响 醇：脱水剂/脂溶剂，可以溶解脂，变性蛋白。醇的杀菌效果随着碳数目增加而增加 甲醛：与蛋白质的氨基结合而干扰细菌的代谢机能,酚：引起蛋白质变性，并破坏细胞质膜。 苯酚溶液又称石炭酸，1g/L能抑制微生物生长 甲酚的皂液乳浊液来苏尔，1020g/L用于消毒皮肤 新洁尔灭（季胺盐）：阳离子表面活性剂，忌与肥皂同用。 合成洗涤剂：阳离子型洗涤剂较阴离子型的杀菌力强,常用的消毒防腐剂及其应用,抗生素：目前认为：抗生素是生物在其生命活动中的一种次生代谢产物或人工衍生物，他们在很低浓度时就能抑制或影响他种生物的生命活动。根据抗生素的作用范围可以分为广谱抗生素和狭谱抗生素两类,第四节 微生物与微生物之间的关系,微生物在自然界中除了与环境有一定关系外，与微生物也有密切关系。主要的关系有6种。竞争关系互生关系共生关系寄生关系捕食关系,竞争关系指不同的微生物种群在同一环境中，对食物等营养、溶解氧及其他共同要求的物质互相竞争，互相受到不利影响。竞争关系广泛存在于自然界中。,原始合作关系或称互生关系 指两种可以单独生活的生物，当它们生活在一起时，通过各自的代谢活动而有利于对方或偏利于一方的一种生活方式 。自生固氮菌与纤维素分解细菌 氧化乙酸脱硫单胞菌与一种绿硫细菌,共生关系两种不能单独生存的微生物共居在同一环境中，各自执行优势的生理功能，在营养上互为有力，不能分开的一种相互关系 真菌和藻类共生形成地衣 草履虫与小球藻厌氧生物处理中的S-菌株和M.O.H,偏害关系或称拮抗关系共存于同一环境中的两种微生物，甲方对乙方有害，而乙方对甲方无任何影响乳酸菌与其他细菌产生抗生素的菌体与其他微生物,捕食关系有的微生物不是通过代谢产物对抗对方，而是吞食对方。原生动物与细菌、藻类等,寄生关系一种小型生物生活在另一种较大型生物的体内或体表（或是细胞内），从中取得营养和进行生产繁殖，同时使后者蒙受损害甚至被杀死的现象。 噬菌体与细菌蛭弧菌与寄生细菌,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,衰退：微生物的性能发生负变。复壮：（狭义）从衰退的菌种中纯种分离和测定生产性能，从而从衰退的群体中找出未衰退的个体 （广义）在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作以期菌种的生产性能逐步有所提高,菌种衰退的防止： 1、控制传代次数（自发突变率下降） 2、创造良好的培育条件 3、利用不同类型的细胞进行传代（菌丝和孢子交替使用） 4、采用有效的菌种保藏方法菌种的复壮 1、纯种分离，分为菌落纯和细胞纯。 2、通过宿主体内生长进行复壮 3、淘汰已衰退的个体,菌种的保藏,最好采用休眠体（如分生孢子、芽孢）的状态保藏，创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如干燥（无氧化二磷、无水氯化钙）、低温、缺氧、缺乏营养及添加保护剂或酸度中和剂 。,菌 连续在培养基上（内）移种 种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种 保 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液） 法 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上,菌种保藏的方法,菌种保藏的方法举例：低温保藏法方法：菌种管置4冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。,干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。,真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（ -196）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。,几种常用菌种保藏方法的比较,