第一章紫外可见吸收光谱法教程ppt课件.ppt

第一章 紫外-可见吸收光谱法,Ultraviolet-Visible Absorption Spectrometry，UV-VIS,2,引 言：光学分析法,光学分析法是根据物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质相互作用而建立起来的一类分析方法。,包括从射线到无线电波的所有电磁波谱范围。,物质对光的选择性吸收（一）,当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，于是产生反射、散射、吸收或透射，如图所示。,光和物质发生作用示意图,物质对光的选择性吸收（二）,物质的颜色是由于它选择性的吸收了某一波长的可见光而产生的。,蓝绿,物质的颜色由透过光的颜色决定,目视比色法,特点,利用自然光,比较吸收光的互补色光,准确度低(半定量),不可分辨多组分,方法简便,6,分光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。,MnO4-的吸收光谱曲线,将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（即吸光度),7,分光光度法特点： 灵敏度高：测定下限可达10-510 -6molL-1, 准确度：能够满足微量组分的测定要求， 相对误差25操作简便快速应用广泛,8,1.2 紫外-可见吸收光谱,1.1 光吸收基本定律,1.4 紫外-可见吸收光谱的应用,1.3 紫外-可见分光光度计,1.1 光吸收基本定律,（Lambert-Beer定律）,9,1.透光率 (透射比,Transmittance),透光率定义:,T 取值为0.0 % 100.0 %,全部吸收,T = 0.0 %,全部透射,T = 100.0 %,1.1.1、朗伯比尔定律,2.吸光度 (Absorbance),1.1.1、朗伯比尔定律,常用吸光度来表示物质对光的吸收程度：,A值越大，表明物质对光的吸收越大，量纲为1。,当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光物质的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.,3. Lambert-Beer定律（光吸收基本定律）,1.1.1、朗伯比尔定律,K-吸光系数b-吸光液层的厚度(光程)， cm,c-吸光物质的浓度， g / L, mol / L,分光光度法的依据和基础,吸光度与光程的关系 A = Kbc,光源,检测器,显示器,参比,朗伯定律(1760),吸光度与浓度的关系 A = Kbc,比尔定律(1852),K ,K a,吸光系数， L g 1 cm -1,c：mol / L,c：g / L,摩尔吸光系数，L mol 1 cm -1,16, 摩尔吸光系数， 数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚度为1cm时，该溶液在某一波长下的吸光度。 但是，的值，不能直接取1mol/L 这样高浓度的有色溶液来测量，而只能通过计算求得。, 的物理意义及计算,吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数,不随浓度c 和光程长度b 的改变而改变,17,摩尔吸光系数,同一吸光物质在不同波长下的值是不同的。在最大吸收波长max处的摩尔吸光系数，以max表示,在温度和介质条件一定时， 仅与吸光物质的结构与性质有关；,max表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。, 越大, 灵敏度越高:, 105 超高灵敏度 =(610）104 高灵敏 =(26)104 中等灵敏度; 2 104 不灵敏 .,1.1.2、比尔定律的偏离,根据比尔定律，当光程b固定时，吸光度A与有色溶液浓度c成正比，即A=Kc. 因此，以吸光度对浓度作图应得到一条通过原点的直线，成线性关系。 但是，实际测得的线性关系常常出现偏差，即不再遵守比尔定律。,1.1.2、比尔定律的偏离,当被测定试样浓度比较高时，曲线发生上翘或下弯，称为对比尔定律的偏离。,AC 校正曲线,产生偏离的原因,(1)与样品有关的因素 (2)与仪器有关的因素,(1) 与样品有关的因素,浓度较大时，吸光质点的相互作用，产生负偏差， 朗伯-比尔定律只适合于稀溶液（C 10-2 mol/L )。,比尔定律本身的局限性,当试样为胶体、乳状液或有悬浮物质存在时，一部分光会因散射而损失，使吸光度增大，产生正偏差。,平衡效应：溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。 例： 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡： Cr2O72- + H2O 2HCrO4- 2H + 2CrO42-（橙色） （黄色） 溶液中CrO42-、 Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH 对测定有重要影响。,(1) 与样品有关的因素,（2）与仪器有关的因素,当入射光为单色光时，溶液的吸收才严格服从比耳定律，但在实际测定中，真正的单色光却难以得到。 无论是用滤光片或棱镜分光，所得的光源仍是含有不同波长光线的复合光带。,波长与吸光度关系示意图,波段A：吸光度相差不大，吸光度A的综合值的线性关系好.,波长与吸光度关系示意图,波段B：吸光度相差很大，吸光度A的综合值与浓度C未必成正比，A-C曲线就不呈线性 。,（2）与仪器有关的因素,1.1.4 怎样避免这种偏离？,（1）入射光纯度要高，应选择比较好的单色器。（2）入射光波长应选择吸收曲线斜率变化小的部位，即最大吸收波长处。,26,1.1.3、L-B定律成立的条件, 均一溶液，稀溶液, 入射光为单色光, 溶液界面无反射，光度计内无杂散光, 溶液为真溶液（无溶质、溶剂及悬浊物引起的散射）, 吸收过程中，吸收物质互相不发生作用,27,紫外-可见吸收光谱是基于分子内电子跃迁产生的分子吸收光谱，研究范围在200-800 nm （UV 200-380，VIS 380-800 nm）光区内的，灵敏度和选择性较好。涉及分子内外层电子(或价电子)的能级跃迁。分子在紫外-可见区的吸收与其电子结构紧密相关。,1.2 紫外-可见吸收光谱,28,物质分子内部三种运动形式，分别对应分子的三种能级： （1）电子相对于原子核的运动电子能级 （2）原子核在其平衡位置附近的相对振动 振动能级 （3）分子本身绕其重心的转动转动能级,能级是量子化的，各自具有相应的能量。,1.2.1 分子吸收光谱的形成,29,分子吸收外界辐射能,总能量变化为E总，其中： 电子运动能量变化:E电子 振动能量变化:E振动 转动能量变化E转动,E电子 E振动 E转动,1.2.1 分子吸收光谱的形成,30,E能量，J； h普朗克常数（4.1361015eVs） 光的波长，cm； v 频率，Hz； c 光速（2.9981010cm/s）,当用光照射分子时，分子就要选择性的吸收某些波长（频率）的光而由较低的能级E跃迁到较高能级E上，所吸收的光的能量就等于两能级的能量之差：,1.2.1 分子吸收光谱的形成,31,运动的分子外层电子-吸收外来辐射-产生电子能级跃迁-分子的电子光谱。,1.2.1 分子吸收光谱的形成,1.2.1 分子吸收光谱的形成,将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（即吸光度),吸收峰, max,MnO4-的吸收光谱曲线,以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，得到的谱图称为吸收曲线或吸收光谱。,物质分子内部结构不同 分子能级差异 E不同 选择吸收不同波长的光线,1.2.1 分子吸收光谱的形成,34,1.2.2 有机化合物的电子光谱,有机化合物的紫外可见吸收光谱，是由分子中价电子的跃迁产生的。,形成单健的电子形成双健的电子未成健的n电子,价电子有以下 三种：,1.2.2.1、电子跃迁的主要类型,1.2.2.1、电子跃迁的主要类型,(1) * (2) n * (3) n * (4) *,分子中电子的能级和跃迁,当分子吸收一定能量后，其价电子将从能量较低的轨道跃迁至能量较高的反键轨道。分子内各种电子的能级高低的次序为： *n,1.2.2.1、电子跃迁的主要类型,有机化合物的吸收光谱是建立在n* 或* 跃迁的基础上的，它们的吸收峰位于200800nm范围内。,这四种 跃迁所需能量大小顺序为： n n ,1.2.2.1、电子跃迁的主要类型,例1. 电子能级间隔越小，跃迁时吸收光子的： A. 能量越大；B. 波长越长；C. 波数越大； D. 频率越高。例2. 丙酮在己烷中的紫外吸收max为279nm，max为14.8，该吸收带是由哪种跃迁引起的？A. n*；B. *；C. n*； D. *；,1.2.2.1、电子跃迁的主要类型,40,1.2.2.2 电荷转移跃迁,某些分子同时具有电子给予体部分和电子接受体部分，在外来辐射激发下会吸收紫外或可见光，使电子从给予体外层轨道向接受体的电子轨道跃迁，产生电荷转移跃迁。,41,1.2.2.2 电荷转移跃迁,42,电荷转移跃迁实际上是一个分子内氧化-还原过程，相应的吸收光谱称为电荷转移吸收光谱。,电荷转移光谱的谱带较宽，吸收强度大，最大吸收波长处的摩尔吸光系数max可大于104。,1.2.2.2 电荷转移跃迁,43,1.2.4 常用术语,定义在近紫外和可见区域有特征吸收的 基团。结构特征具有电子： CC，CO， CN，NN，NO等。,（1）生色团,对应跃迁类型*和n*。,44,（1）生色团,常见的生色团及其特性见：教材,一个双键：*跃迁,强吸收，远紫外区。 多个生色团（共轭）：吸收出现在近紫外区。 在紫外光谱中，生色团并非一定有颜色。,1.2.3 常用术语,45,助色团本身不能在紫外-可见光区（200-800 nm）产生吸收，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收带最大吸收波长发生移动，并且吸收强度增加。,（2） 助色团,这类基团一般是带有非键电子对（孤对电子）的基团，如：OH，OR，NHR，SH，Cl，Br，I,1.2.3 常用术语,46,在有机化合物中，常常因为取代基的不同或溶剂的改变，使其吸收带的最大吸收波长max发生移动，吸收强度发生改变。,（3） 红移和蓝移,向长波方向移动红移，向短波方向移动蓝（紫）移；吸收强度增大增色效应，吸收强度减小减色效应,1.2.3 常用术语,47,(4). 吸收带的划分,1.2.3 常用术语,48,环状共轭, 产生三个吸收带：,苯：,具精细结构（由振动跃迁引起）,特征吸收带,E1带：max 184nm, 47000E2带：max 203nm, 7400B带： max 256nm, 230,例3：以下四种化合物中，能同时产生B吸收带、K吸收带、R吸收带的是：,50,1.2.4 影响紫外-可见光谱的因素,内因：分子结构,外因：测定条件,51,1.2.4.1 共轭效应的影响,电子共轭体系增大， max红移，max增大,原因？,共轭效应增大，使轨道能量降低，*跃迁所需的能量降低，max红移，max增大。,共轭多烯的紫外吸收,1.2.4.1 共轭效应的影响,-胡萝卜素与蕃茄红素：,例4：试估计下列三种化合物中，何者最大吸收波长最长？何者最短？为什么?,1.2.4.1 共轭效应的影响,54,(2)空间阻碍使共轭体系破坏，max蓝移，max减小。,共平面程度减小，共轭程度减弱。,1.2.4.1 共轭效应的影响,55,1.2.5.2 取代基的影响,给电子能力顺序：-N(C2H5)2 -N(CH3)2 -NH2 -OH -OCH3 -NHCOCH3 -OCOCH3 -CH2CH2COOH -H,给电子基：含未共用电子对的原子的基团。,吸电子基：易吸引电子而使电子容易流动的基团。,作用强度顺序：-N+(CH3)3 -NO2 -SO3H -CHO -COO- -COOH -COOCH3 -Cl -Br -I,56,给电子基未共用电子对流动性大，形成p-共轭，降低能量，max红移。,吸电子基的存在产生电子的永久性转移，max红移。电子流动性增加，吸收光子的吸收分数增加，吸收强度增加max增加。,给电子基与吸电子基同时存在，产生分子内电荷转移吸收，max红移，max增加。,1.2.4.2 取代基的影响,57,分子内电荷转移吸收,K吸收带,B吸收带,取代苯的*跃迁吸收特性,1.2.4.2 取代基的影响,58,溶剂极性越大，分子与溶剂的静电作用越强，使激发态稳定，能量降低，即*轨道能量降低大于轨道能量降低 ，因此 *跃迁能量减小。,1.2.4.3 溶剂极性的影响,E = h=h/,*波长红移,59,溶剂极性增大，*跃迁波长红移,1.2.4.3 溶剂极性的影响,60,n电子由于与极性溶剂形成氢键，基态n轨道能量降低大 ，因此n *跃迁能量增大。,E = h=h/,n*波长蓝移,1.2.4.3 溶剂极性的影响,61,溶剂极性增大，n*跃迁波长蓝移,1.2.4.3 溶剂极性的影响,62,极性溶剂中，由于溶质与溶剂的相互作用，振动的精细结构消失,1.2.4.3 溶剂极性的影响,63,影响因素小结, 共轭体系增大，max红移，max增大； 空间位阻增大，max蓝移，max减小；含给电子基时， max红移； 含吸电子基时，max红移，max增加； 同时含给电子基和吸电子基时，分子内电荷转移吸收，max红移，max增加； 溶剂极性增大，*跃迁吸收带红移， n*跃迁吸收带蓝移； 极性溶剂使振动精细结构消失。,64,1.3 紫外-可见分光光度计,1.3.1 分光光度法,1.3.2 主要部件,1.3.3 常用仪器类型,1.3.1 分光光度法,通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调, 故选择性好, 准确度高.,66,光源,碘钨灯,氘灯,单色器,测量池,参比池,样品池,光电倍增管,数据处理和仪器控制,1.3.2 主要部件,光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度,稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯(3202500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180375nm) 氙灯：紫外、可见光区均可用作光源,1.3.2 主要部件,单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。,（1）. 棱镜:依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,入射狭缝,准直透镜,棱镜,聚焦透镜,出射狭缝,白光,红,紫,1,2,800 600 500400,1.3.2 主要部件,（2）光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。,M1M2出射狭缝,光屏,透镜,平面透射光栅,光栅衍射示意图,原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.,波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使用方便,1.3.2 主要部件,71,3.吸收池,1.3.2 主要部件,吸收池也称比色皿，用来盛放样品溶液。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。,可见光区：一般用玻璃池；紫外光区：须采用石英池,72,4.检测器,1.3.2 主要部件,利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号光电池，光电管，光电倍增管。,5.检流计（指示器）：低档仪器：刻度显示 中高档仪器：数字显示，微机,1. 单波长单光束分光光度计,简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，,1.3.3 常用仪器类型,74,单光束仪器的不足：,1）操作麻烦：,空白I0样品I,任一波长下,2）不能进行吸收光谱的自动扫描,3）光源不稳定会影响测量精度,1.3.3 常用仪器类型,75,1.3.3 常用仪器类型,2.单波长双光束分光光度计,自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。,光束几乎同时通过样品池和参比池,77,2.双光束分光光度计,1.3.3 常用仪器类型,79,3.双波长分光光度计,1.3.3 常用仪器类型,两个波长间隔1-2nm，测量的是吸光度对波长的变化率曲线,80,3.双波长分光光度计,1.3.3 常用仪器类型,82, 可以降低杂散光，光谱精度高。, 消除背景吸收，可用于悬浊液和悬浮液的测定。, 无须分离，可用于混合组分的同时测定。,3.双波长分光光度计,1.3.3 常用仪器类型,紫外-可见吸收光谱法主要用于化合物的定量分析 灵敏度高：测定下限可达10-510 -6molL-1, 准确度：能够满足微量组分的测定要求，相对误差25作为四大波谱之一，是鉴定许多化合物，尤其是有机化合物的重要定性工具之一。,1.4 紫外-可见吸收光谱的应用,定性分析基础,定量分析基础,物质对光的选择性吸收,在一定实验条件下, Ac,测定依据,1.4.1 显色反应及其条件的选择,1.4.2 光度测量条件的选择,1.4.3 标准曲线与测定步骤,一. 显色反应,mX(待测物)nR(显色剂)XmRn(有色化合物)主要有配位反应(为主)和氧化还原反应。,1.4.1 显色反应及其条件的选择,配位显色反应 当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生很强的紫外可见吸收光谱。,氧化还原显色反应,例如：钢中微量锰的测定，Mn2不能直接进行光度测定 2 Mn2 5 S2O82-8 H2O =2 MnO4- + 10 SO42- 16H+将Mn2 氧化成紫红色的MnO4-后，在525 nm处进行测定。,二. 显色剂,：,：,：,：,助色团：NH，OH，X (孤对电子)ne,O,生色团：NN，NO，,O,C=S,N （共轭双键）e,无机显色剂: SCN- Fe(SCN)2+ H2O2 TiOH2O22+,有机显色剂:,三.显色反应的选择,*灵敏度高，一般104*选择性好*显色剂在测定波长处无明显吸收。 对照性好, max60 nm .*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，重现性好。,要求：有色化合物与显色剂之间的颜色差别应尽可能大。,Fe3+ + 磺基水杨酸 三磺基水杨酸铁(黄色) （组成固定） Fe3+ + SCN - FeSCN2+、 Fe(SCN)2 + （组成不固定）,四. 显色条件的确定,c(R),c(R),c(R),1. 显色剂用量,Mo(SCN)32+ 浅红Mo(SCN)5 橙红Mo(SCN)6- 浅红,Fe(SCN)n3-n,选择曲线变化平坦处。,2. 显色反应酸度,酸度的影响,副反应,M + nR = MRn,弱酸解离,RH = R- + H+,生成不同配比的络合物,例，磺基水杨酸(Ssal) Fe 3+,pH = 2 3,FeR,紫红色,pH = 4 7,FeR2,橙色,pH = 8 10,FeR3,黄色,pH12 Fe(OH)3,沉淀,例：二甲酚橙 pH6.3 红紫色， pH6.3 黄色 金属配合物则 红色 故：只适合于pH6.3的条件。,3. 显色温度及显色时间,根据具体反应，选择溶液颜色最为稳定的条件,96,所选择的溶剂应易于溶解样品并不与样品作用，且在测定波长区间内吸收小，不易挥发。常见溶剂可用于测定的最短波长。见教材,五. 溶剂的选择,六.共存干扰离子的消除,（1）控制酸度,测Fe3:(控制pH),Fe3+, Cu2+,Fe(Ssal)+（紫红）Cu2+,pH 2.5,Ssal,六.共存干扰离子的消除,Co2, Fe3+,Co2+FeF63-,Co(SCN)2 (蓝),NaF,SCN,Co2+Fe2+,Sn4+,(2)Sn2+,Co(SCN)2,SCN,测Co2(含Fe3+) : (掩蔽法),（2）选择适当的掩蔽剂,六.共存干扰离子的消除,（3）利用生成惰性配合物,例：钢铁中微量Co2的测定,（4）选择适当的测量波长,例：K2Cr2O7存在下测定KMnO4,如不能通过以上办法消除干扰，则需采取分离法。,如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。,（3）利用生成惰性配合物（4）选择适当的测量波长（5）分离,1.测量波长的选择,“吸收最大，干扰最小”,1.4.2 光度测量条件的选择,一般选择最大吸收波长,2.参比溶液的选择,试液无吸收,显色剂无吸收,试液有吸收,显色剂无吸收,试液无吸收,显色剂有吸收,试液有吸收,显色剂有吸收,参比溶液（空白溶液）是用来调节工作零点 即 A=0，T%=100% 的溶液，以消除溶液中其它基体组分以及吸收池和溶剂对入射光的反射和吸收所带来的误差。,浓度测量的相对误差与T(或A)的关系,实际工作中，应控制A在0.20.8之间 (调c, b, ),3. 吸光度读数范围的选择：,最佳值,最佳读数范围,【例】某一有色溶液在2.0cm的吸收皿中，测得透光率T1，若仪器透光度的绝对误差T0.5，计算（1）测定的浓度的相对误差c/c（2）为使测得吸光度在最适读数范围内，溶液应稀释或浓缩多少倍？（3）若浓度不变，而改变比色皿厚度（0.5cm, 1.0cm，2.0cm,3.0cm）,则应选择那种厚度的吸收皿最合适，此时c/c为多少？,解 （1）,（2）A=-lgT=-lg1%=2 设有色溶液原始浓度为c，当b一定时，AbcKc,要使A0.20.8，则,即稀释2.510倍,（3）当c一定时，AbcKb,要使A0.20.8，则,b=2cm,所以，b=0.5cm最合适，此时：,1.4.3、定量分析测定方法与步骤,1 单组分的测定 测定依据：朗伯比尔定律,测定方法： 标准曲线法,配制一系列已知的具有不同浓度的标准溶液，在相同条件下配制样品溶液。,实验点浓度所跨的范围要尽可能宽(同一数量级内)样品溶液浓度最好位于标准曲线的中央部分,如： 采用啉菲罗啉分光光度法（标准曲线法）测定地面水中微量铁的含量。 配制铁的标准系列溶液并测定其吸光度，绘制成一标准曲线 。,标准溶液系列配制,110,在相同条件下测量样品溶液的吸光度，就可以从标准曲线上查出样品的浓度。,A,分别在选定波长处测其吸光度A，然后以标准溶液的浓度c为横坐标，以相应的吸光度A为纵坐标，绘制出Ac关系曲线，称为标准曲线或称工作曲线。,吸光度的加和性,若试液属多组分体系，而各种吸光物质之间没有相互作用，这时体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性，即 A=A1+A2+A3+An =1bc1+2bc2+3bc3+nbcn,2、多组分的测定,112,2、多组分的测定,根据吸光度具有加和性的特点，在同一试样中可以同时测定两个或两个以上组分。 假设要测定试样中的两个组分A、B，如果分别绘制A、B两纯物质的吸收光谱，绘出三种情况 ：,113,（a）两组分互不干扰,（b）A组分对B组分的测定有干扰，而B组分对A组分的测定无干扰,（c）两组分彼此互相干扰,2、多组分的测定,114,（a）情况可以用测定单组分的方法分别在1、2测定A、B两组分；,2、多组分的测定,115,（b）情况则可以在1处单独测量A组分，求得A组分的浓度CA。然后在2处测量溶液的吸光度 及A、B纯物质的 和 值，根据吸光度的加和性，即得 则可以求出CB；,2、多组分的测定,116,（c）情况表明两组分彼此互相干扰，此时，在1、2处分别测定溶液的吸光度 及 ，而且同时测定A、B纯物质的 、 及 、 。然后列出如下联立方程, 解得CA、CB。,解联立方程组法,2、多组分的测定,117,例题2： 钛-H2O2和钒-H2O2络合物的最大吸收波长分别在415nm和455nm处，取50.00mL 1.0610-3mol/L钛-H2O2溶液，定容100mL, 以1cm比色皿在415nm和455nm处测得吸光度分别为0.435和0.246; 取25.00mL 6.2810-3mol/L 钒-H2O2溶液，定容100mL, 以1cm比色皿在415nm和455nm处测得吸光度分别为0.251和0.377。取20.00mL钛钒混合液，加入H2O2显色后定容为100mL，以上述相同的条件测得A415=0.645, A455=0.553, 求原混合液中钛和钒的浓度。,解:, 了解样品特性(如：含量或溶解性等); 选择光度分析体系(显色剂或衍生试剂等)； 确定样品称取量，配制样品储备液(根据光度测定的误差对吸光度的要求)； 吸收光谱的测定，确定测量波长； 显色条件的优化(显色剂用量、溶液酸度、显色温度与时间、干扰及其消除等)； 配制标准溶液，绘制标准曲线； 7.配制样品溶液，计算样品含量。,3. 样品测定步骤,