流式细胞术应用与进展ppt课件.ppt
流式细胞术应用与进展 (Flow Cytometry, FCM),贾正才 副教授TEL: 68752345E-mail: 生物医学分析测试中心,一、流式细胞术,Biomedical Analysis Center,Flow Cyto metry,对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。,研究对象: 单细胞悬液外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、 培养细胞、细菌、藻类等。,二、流式细胞仪发明过程,Biomedical Analysis Center,1930年，Casperrsson和Thorell致力于细胞的计数；1940年，Coons用结合荧光素的抗体标记胞内蛋白；1953年，Taylor利用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器；1953年，Parker和Hutcheon描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形；,Biomedical Analysis Center,1967年，Kamemtsky和Melamed提出细胞分选方法； 1969年，Fulwyler及其同事们发明第一台荧光检测细胞计；1972年，Herzenberg改进细胞分选器，能够检测出荧光抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。1975年，Kochler和Milstein提出单克隆抗体技术。,二、流式细胞仪发明过程,FL2 PE,SSC,FSC,FL3 PerCP, Cy5,FL1 FITC,Light detectors,laser,三、流式细胞仪基本结构,Biomedical Analysis Center,荧光素的激发、发射波长与检测图例,四、流式分析常用荧光素,Biomedical Analysis Center,1. 有机小分子FITC、Cy5、Cy7、Alexa Flour、DyLight、TexasRed优点： 容易标记 标记抗体很稳定 非常一致的发射光谱缺点： 较小的光谱偏移(50-100nm) 荧光容易淬灭,Biomedical Analysis Center,2. 荧光蛋白PE、APC、PerCP优点： 稳定性好 荧光强度高 一致的发射光谱 （不同供应商间差别大）缺点： 分子量大 标记较困难,HCAM表达检测,四、流式分析常用荧光素,Biomedical Analysis Center,3. 蛋白-小分子偶联物PE-Cy5、PE-Cy7、APC-Cy7、PE-TxRD,蛋白-小分子偶联物发射荧光原理,四、流式分析常用荧光素,Biomedical Analysis Center,碘化丙啶 (PI) 嵌入到双链DNA和RNA碱基对中 对碱基无特异性选择 不能穿过正常细胞膜,DAPI 结合双链DNA小槽(AT碱基对) 特异性比PI高 可穿透正常细胞膜,4. 常用核酸染料,PI和DAPI染细胞核,四、流式分析常用荧光素,Biomedical Analysis Center,相对细胞大小 （前向角散射光 FSC）,五、流式细胞术的参数与数据,相对细胞颗粒密度和内部复杂度 （侧向角散射光 SSC）,染色细胞的相对荧光强度 （荧光-Fluoresent light）,Biomedical Analysis Center,前向角散射光 - FSC, FSC信号收集方向与激光束相平行 FSC与被测细胞相对大小及表面积相关,Biomedical Analysis Center,前向角散射光 - FSC,FSC is proportional to relative size & cell-surface area,Biomedical Analysis Center,侧向角散射光 - SSC, SSC信号收集方向与激光束相垂直 (90) SSC与被测细胞内部颗粒度和结构复杂度相关,Biomedical Analysis Center,侧向角散射光 - SSC,SSC is proportional to cell granularity or internal complexity,基于FSC和SSC的全血散点图,Biomedical Analysis Center,Biomedical Analysis Center,基于FSC和SSC的组织细胞散点图,Biomedical Analysis Center,荧光强度 (Fluoresence intensity), 荧光信号的强度: 细胞表面或细胞内物质浓度,Biomedical Analysis Center,染色细胞的相对荧光强度,流式细胞分析结果直方图,Biomedical Analysis Center,染色细胞的相对荧光强度,流式细胞分析结果散点图,流式细胞分选器示意图,六、流式细胞分选原理,流式细胞分选示意图,在鞘液的包裹和推动下，细胞悬液中的细胞被排成单列，以一定速度从喷口喷出。 喷嘴射出的液柱被分割成一连串液滴，每液滴含1个细胞。充电电路对选定细胞液滴充以正、负不同电荷。带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器。,六、流式细胞分选原理,Biomedical Analysis Center,1. 细胞周期分析（DNA倍体分析） (cell cycle),七、流式细胞术的应用,2. 细胞凋亡分析 (cell apoptosis),3. 流式多色分析 (multi-parameter experiment ),4. 流式细胞术研究进展,Biomedical Analysis Center,细胞周期分析,Biomedical Analysis Center,流式细胞仪检测：,细胞周期分析,流式细胞仪检测图例,Biomedical Analysis Center,结果解读：,细胞周期分析,细胞周期流式检测结果,Biomedical Analysis Center,结果解读：,细胞周期分析,G0/G1期：63.08%G2/M期：8.83%S期：28.10%G2/G1为1.95峰的变异系数 CV：3.38%,细胞凋亡分析,细胞凋亡不同时期的特点,Biomedical Analysis Center,Biomedical Analysis Center,原理：,1. 细胞凋亡 磷脂酰丝氨酸 (PS)外翻2. Annexin V 与PS高亲和力结合,细胞凋亡分析（Annexin V/PI）,3. PI无法进入正常活细胞4. 坏死细胞/晚期凋亡细胞 细胞膜受损 annexin V、PI能进入,细胞凋亡分析（Annexin V/PI）,流式细胞仪检测：,Biomedical Analysis Center,设置欲分析检测的目的细胞门,细胞凋亡分析（Annexin V/PI）,结果解读：,Biomedical Analysis Center,细胞凋亡检测结果,Biomedical Analysis Center,注意事项：,1. 设置必需的对照 阴性对照、Annexin V单染、PI单染2. 洗涤细胞时应轻柔，减少对细胞的机械损伤3. 根据细胞特性，选择合适的离心条件4. 选择多种凋亡分析方法,细胞凋亡分析（Annexin V/PI）,Biomedical Analysis Center,细胞凋亡分析（Annexin V/PI）,阴性对照结果图例,阴性对照：,确定阴性细胞和阳性细胞的界线。,Biomedical Analysis Center,细胞凋亡分析（Annexin V/PI）,发射光谱交叠,Annexin V/PI单染：,不同荧光素发射光谱交叠，导致假阳性产生。 调节补偿，避免假阳性引起的实验结果错误。,Biomedical Analysis Center,细胞凋亡分析（Annexin V/PI）,未调补偿,调节补偿后,Biomedical Analysis Center,应用：,流式多色分析,检测同一细胞上和/或细胞内多种分子的表达,荧光抗体选择原则：,根据目标分子情况，选择相应荧光抗体。不同荧光抗体上的荧光素不同。不同荧光素的最大发射波长相差越大越好。,流式多色分析,流式细胞仪检测：,Biomedical Analysis Center,设置欲分析检测的目的细胞门,流式多色分析,结果解读：,Biomedical Analysis Center,注意事项：,1. 根据流式细胞仪选选择荧光抗体 激光器：488nm、635nm、355nm、561nm2. 根据分子的表达情况选择荧光抗体 PerCPAPC-Cy7FITC PerCP-Cy5.5PE APC = PE-Cy5 弱表达：高荧光强度荧光素标记的抗体3. 考虑荧光抗体间补偿的多少4. 设置必需的对照 同型对照、各抗体单染,流式多色分析,Biomedical Analysis Center,流式多色分析,发射光谱交叠图例,局限性：可同时检测的分子种类有限,Biomedical Analysis Center,基本原理：,传统流式细胞术与原子质谱法相结合过渡元素的同位素标记抗体流式细胞仪产生单细胞液滴，原子质谱检测每个细胞上同位素的数量、种类理论上可同时检测单细胞上/细胞内的100种以上的分子,质谱流式细胞术 (Mass Cytometry),流式细胞术研究进展,基本原理：,过渡元素,质谱流式细胞术 (Mass Cytometry),基本原理：,Biomedical Analysis Center,质谱流式细胞术 (Mass Cytometry),基本原理：,质谱流式细胞术获得的细胞树状结构图,圆点：表达分子种类 相同的细胞圆点大小：细胞数目相邻圆点：表达分子 种类相近颜色：分子表达强弱,质谱流式细胞术 (Mass Cytometry),Biomedical Analysis Center,优点： 理论上可检测单细胞的100种以上的分子 无需繁琐的荧光补偿 细胞群的解析更清晰、信息量更大,缺点： 细胞被破坏，不能进行细胞分选 灵敏度没有某些荧光燃料高,质谱流式细胞术 (Mass Cytometry),八、文献阅读,Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum,Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, Amir el-AD, Krutzik PO, Finck R, Bruggner RV, Melamed R, Trejo A, Ornatsky OI, Balderas RS, Plevritis SK, Sachs K, Peer D, Tanner SD, Nolan GP.,Science. 2011;332(6030):687-96.,Biomedical Analysis Center,Biomedical Analysis Center,Introduction,The outline of hematopoiesis is generally understood.A comprehensive framework of its system-wide properties remains to be determined.Use of flow cytometry remains practically confined to the measurement of 6 to 10 simultaneous parameters.Analysis at the 11- to 15-parameter range is possible but limited by compensation.,Biomedical Analysis Center,Experiment Design,Simultaneously measured 34 parameters in each single cell in human bone marrow (BM) samples.In-depth analysis: immune cell types of bone marrow mononuclear cells. cell subsetspecific signaling phenotypes of drug action.Provide a system-wide view of signaling behaviors, allowing us to limit the functions that certain drugs might have on complex tissues,Results,Immunophenotypic progression in human bone marrow,Results,Stimulation by IL-7 induced phosphorylation of STAT5,生物医学分析测试中心,FACSCalibur,FACSAria II,细胞周期多色分析,细胞凋亡 细胞分选,Biomedical Analysis Center,FACSVerse,2激光4色,3激光8色,4激光11色,细胞增殖 绝对计数,Thank you！,
