电离辐射的细胞效应ppt课件.ppt
电离辐射的细胞效应,Cellular effects of irradiation,电离辐射对细胞周期进程的影响 Effects of Irradiation on Cell-Cycle,细胞周期（Cell Cycle）,组织的生长和维持依赖细胞复制（再生）某些细胞在成年人永不分裂增殖。There are a specific set of steps involvedG1 (G0)Gap Phase 1Functional cellSSynthesisDNA synthesisG2Gap phase 2RestM MitosisCell Division,细胞周期时间 Cell-cycle time or generation time,人类细胞增殖依赖细胞的分裂。从细胞分裂开始到下一次分裂开始的时间称为细胞周期时间(Cell-cycle time )。正常增殖的细胞其周期时间大多为1020h。,细胞周期调控Cell cycle regulation,关于细胞周期的疑问（ Question of cell cycle regulation）如何保证细胞增殖过程中各事件的有序进行。G1-S-G2-M-G1.每个细胞周期必需复制一次，分裂前染色体必须分离。,细胞周期检查点Cell Cycle Checkpoints,细胞周期进程中向各个时相过渡的点。是生化途径从顺序和时间上、从细胞时相上调控细胞进程。DNA受损后检查点减慢细胞通过时相点的进程。,分类（Classification ）,根据在细胞周期（cell cycle）中的时间顺序，可将checkpoint分为三类 1、G1期(Restriction) Checkpoint 2、G2 Checkpoint 3、Metaphase Checkpoint （细胞分裂期，M期）,调控内容（Regulating the contents ）,1、DNA损伤检查点(DNA damage checkpoint) 负责查看DNA有无损伤；2、DNA复制检查点(DNA replication checkpoint) 负责DNA复制的进度；3、纺锤体组装检查点(spindleassembly checkpoint) 管理染色体的正确分配已否，因为染色体的分配主要依赖于纺锤体的作用。,一、细胞周期的运行原理,1、周期蛋白（Cyclin）和周期蛋白依赖性激酶（ Cyclin-dependent kinases (Cdks)）: 所有真核细胞周期运作均依赖于共同的核心驱动装置，即Cyclin -CDKs复合物，并且哺乳动物细胞周期的不同期有不同的Cyclin和CDKs表达，这些Cyclin和CDKs均有不同程度的同源性，称为周期蛋白家族和CDKs家族.,1）周期蛋白（cyclin）,调节真核细胞周期的一组蛋白质，其浓度在细胞周期中出现周期性变化，激活特异的依赖细胞周期的蛋白激酶，控制细胞周期按照阶段逐一进行。 周期蛋白作为一种调节亚基，与周期蛋白依赖性的蛋白激酶结合并将之激活。,只在G1期中表达并只在G1期到S期的转化过程中执行调节功能，被称为G1期周期蛋白，如Cyclin C、D、E、Cln1、Cln2、Cln3等。 有的虽然在间期表达和积累，但到M期才表现出调节功能，所以常被称为M期周期蛋白，如Cyclin A、B等。 G1期周期蛋白在细胞周期中存在的时间相对较短，而M期周期蛋白在细胞周期中相对稳定。,周期性地活化蛋白激酶调控细胞周期进程,周期蛋白依赖性激酶（ Cdks）：引擎（ engine） 在细胞周期中恒定的表达（时间、时相）；激酶的活性在周期中是变动的；激酶活性变化由很多酶和蛋白质控制，其中cyclins是主要分子。,举例：G1 cyclins和CDKsG1 cyclins是指G1期或G1S交界处发挥作用、启动细胞周期和促进DNA合成的周期蛋白。目前已发现Cyclin C、D、E等多种。Cyclin C主要在果蝇及人的细胞中发现。,Cyclin E是人类细胞的G1 cyclin ，其mRNA和蛋白质水平在G1S交界处急剧升高达峰值，进入S期后降解， Cyclin E-CDK2复合物调节细胞周期进入S期，并在人类细胞的DNA合成启动中起重要作用。,周期蛋白-周期蛋白依赖激酶复合物的抑制（ Inhibition of a cyclin-Cdk complex ）,The inhibition of a cyclin-Cdk complex by Cdk inhibitor proteins (CKI)主要通过使cyclin-Cdk complex 构型改变,Cyclin-Cdk complex中Cyclin的解离和磷酸化激活位点Thr的去磷酸使CDK处于失活状态因而，在细胞周期中使Cyclin水平下降与激活位点Thr去磷酸的有关因素都是CDK抑制调控的重要因素。,二、几个参与细胞周期 调控的重要基因,已发现的三条相互联系的细胞周期调节系统：(1)Ras介导的MAPK信号转导系统；(2)CIP1KIP1家族介导P53P2lWAF1/CIP1周期蛋白ECDK2，周期蛋白DCDK4pRB途径：(3)INK4家族介导的P16INK4a周期蛋白DCDK4一pRB途径。,1、pRB（nuclear phosphoprotein） pRB作为细胞周期和基因转录调控的枢纽，通过调整E2F等转录因子的功能在细胞增殖和分化的控制中发挥关键作用。,在某一给定细胞中pRB水平相对恒定，而其磷酸化/去磷酸化状态则随着细胞周期的进展而变化：在G1早期，pRB主要以脱磷酸化的活性形式存在， pRB的磷酸化主要发生在G1中期，到S期和G2M期则主要以高度磷酸化形式存在。,在CyclinCDK complex与蛋白磷酸酶1的协同作用下，pRB的磷酸化去磷酸化之间的动态平衡有效控制着G1限制点的“开启和关闭”，从而保证细胞周期的有序运行及细胞的正常增殖。,G2M checkpoints调节机制,有丝分裂促进因子（mitosis promoting factor, MPF）：Cyclin BP34cdc2(cdc2基因编码的34000的磷蛋白，简称p34,具激酶活性）,三、电离辐射影响细胞周期进程的机制,电离辐射引起DNA损伤，激活DNA damage checkpoint，导致细胞周期阻滞。依细胞周期进程，至少可分为3 checkpoints：G1/S (G1) checkpoint, intra-S phase checkpoint, and G2/M checkpoint.,1、G2阻滞（G2 arrest) 机制：细胞由G2期进入M期受MPF调控,Cyclin B,激酶P34cdc2Thr161磷酸化、Thr14,Tyr15脱磷酸化,IR,CyclinB的mRNA和蛋白水平下调P34磷酸化发生变化,MPF,辐射引起细胞G2延迟的机理：,DNA损伤后，经ATM或Rad3将信号传递至Chk1（检查点激酶基因），进而使cdc25C ser 216磷酸化，促使cdc25C结合1433（Rad24/Rad25表达产物），抑制cdc25C进入细胞核，阻止cdc2 Tyr 15脱磷酸化，导致G2期延迟。,2、G1阻滞（G1 arrest）(一)p53在辐射所致细胞周期G1期阻滞中的作用取决于细胞系的P53状态：只有表达野生P53的细胞，受照后才发生G1期阻滞。P53是作为转录因子，通过与其下游效应分子基因的靶序列结合从而激活这些基因转录的。再通过这些下游效应分子发挥调控G1期进程。,目前已发现多种分子转录被p53调节，如MDM2，P21wAFl、Gadd45 、Bax、IGFBP3，Fas等。 认为MDM2的正常功能是限制Gl期阻滞的时间，使DNA损伤修复后的细胞重新进入细胞周期。 在p53转录调控的效应分子中，Gadd45和P21是参与辐射所致细胞G1期阻滞的重要元件分子。,三、ATM、P53与DAN损伤的识别,3、S相延迟（S phase delay）与DNA合成速率下降有关IR对DNA合成的抑制呈现双相的剂量效应关系：较低剂量范围内剂量效应曲线斜率较大（辐射敏感），较高剂量，斜率变小（辐射抗性）与cyclin A及P53的表达有关,4、S/M解偶联（uncouplin）,S/M偶联：在正常情况下细胞周期中S期和M期之间存在协调关系，即细胞未完成有丝分裂前不会启动下一轮DNA合成。,电离辐射后，处于细胞周期中G2期细胞既不能进入有丝分裂的M期，也不发生G2阻滞，而是返回S期，继续进行DNA复制，使细胞形成内含数倍DNA而不分裂的巨细胞（giant cell)。,巨细胞 巨细胞：IR引起某些细胞体积增大，成为巨细胞（giant cell);内载几套染色体而不分裂； 细胞可以存活一定时间，具有功能活性，但最后凋亡； 可能与P53及其下游分子P21调控基因表达有关。,丢失某一检查点的后果：,机体对外界刺激的一种保护性反应，目的在于保证基因组的遗传稳定性检查点功能丢失导致突变、基因重排，进而引起遗传不稳定（ genetic instability）-出生缺陷、各种疾病（ eg. cancer),研究进程影响规律有利于设计合理的肿瘤治疗方案，提高化疗和放疗疗效,电离辐射引起的细胞死亡 Cell death caused by ionizing radiation,一、细胞存活（cell survival ）,两大类细胞（Two type of cell）有增殖（reproductive）能力（或克隆形成能力）的细胞（ clonogenic cell）。已分化的细胞（differentiated cells）,细胞存活与死亡的概念The concept of cellular survival and death.,对有增殖能力的细胞，保留其增殖能力，能无限产生子代的细胞为存活细胞（survival cell） 。凡失去增殖能力，不能产生大量子代的细胞，称为死细胞（death cell） 。,克隆形成细胞死亡方式的分类,1、增殖死亡（proliferative death)又名代谢死亡或延缓死亡是指受照细胞丧失了持续增殖的能力、在经过一个或几个有丝分裂周期后丧失代谢活动和细胞功能而死亡。,通常测定增殖死亡采用体外细胞成集落培养法，即观察单个细胞在培养条件下经多次分裂后形成一个克隆的能力。如果细胞在一次或数次分裂后不能形成一个克隆，即计为死亡；能够生长成克隆者则计为存活。,Figure 4.1. Examples of pedigrees of EMT6 mouse cells.,NORMAL,IRRADIATED,Mitotic death,2、间期死亡（Interphase death）或即时死亡（ Immediate cell death ）指受照射细胞未经分裂就死亡。照射剂量很大（100Gy以上）,已分化的细胞（differentiated cells）,对那些不再增殖的已分化的细胞，则以其是否丧失特殊功能来衡量细胞是否存活，保留机能者为存活细胞，失去功能者为死亡细胞。,可供选择的死亡方式,程序性细胞死亡 type1-凋亡（apoptosis）程序性细胞死亡 type2-自噬（autophagy）病理性死亡-坏死（necrosis）,病理情况下，3种形式均可存在；生理情况下只有前两种,程序性细胞死亡（PCD ，programmed cell death）： 在机体生理过程中，在一定信号的启动下，相关基因有序地表达，制约着对整体无用的或有害细胞的清除，因此，这种活动被命名为PCD。,1、细胞凋亡（apoptosis）,维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程 。,Physiologic Programmed Cell Death,Sex differentiation,CELL 88:350, 1997,2、自噬,自(体吞)噬是胞质溶胶和细胞器被隔离到双层膜的小泡中，由此运送到溶酶体/空泡中降解，并使因此形成的大分子进行再循环的一个过程 。,3、细胞的坏死(necrosis) 通常是由突然及严重的损伤所造成的细胞意外死亡，这类损伤包括电离辐射、严重的感染、剧烈的炎症、烧伤或其他形式的创伤以及化学损伤等：,细胞凋亡与细胞坏死的比较,细胞凋亡的形态学变化,电离辐射诱导的死亡方式,三者均可。Mitotic death after irradiation can be by any molecular mechanismInterphase death after irradiation is by rapid apoptosisProminent in lymphocytes, spermatogonia, oligodendrocytes, salivary glandOccurs in many tumors and tissues, normally in specific sites,细胞存活的剂量效应关系,细胞存活曲线（cell survival curve),测量受不同辐射剂量照射后，有增殖能力的细胞在体内、外克隆或集落形成的能力，即存活率的变化所绘制剂量效应曲线,一、细胞存活的体内、外测量,1、体外测量（cell survival measurement in vitro,某一剂量照射后形成的集落数,接种的单个细胞数PE,SF=,接种的单个细胞数PE,某一剂量照射后形成的集落数,接种的单个细胞数PE,SF=,某一剂量照射后形成的集落数,接种的单个细胞数PE,SF=,接种的单个细胞数PE,某一剂量照射后形成的集落数,接种的单个细胞数PE,SF=,某一剂量照射后形成的集落数,接种的单个细胞数PE,SF（surviving fraction)：细胞存活分数PE(plating efficincy):系数接种效率,SF=,某一剂量照射后形成的集落数,接种的单个细胞数PE,SF=,SF=,SF=,SF=,SF=,某一剂量照射后形成的集落数,SF=,某一剂量照射后形成的集落数,接种的单个细胞数PE,SF=,某一剂量照射后形成的集落数, Seeded 100 cells A) 70 colonies formed PE = 70% B) 37 colonies formed PE = 37%,得到一条存活曲线,2、体内测量（survival cell measurment in vivo）脾结节计数法SF,Nx/Cx,Nc/Cc,Nx 和Cx ：代表受某一剂量照射，供体细胞形成的结节数及注入细胞数Nc和Cc：代表未受照射，供体细胞形成的结节数及注入细胞数,三、细胞存活曲线类型,常用的细胞存活曲线有二种 1、指数型（ exponential）或线型的（Linear） 2、弯曲的（ curved）：分有肩的和无肩的,1、指数型（ exponential）曲线,见于某些特定情况：病毒、细菌和单倍体的酵母菌。哺乳动物细胞的某些特定情况特殊类型细胞（如造血干细胞）同步于M或 G2期 的细胞群高LET照射（如粒子）,细胞（或生物大分子）的存活分数为辐射剂量的简单函数。半对数图为一直线。 S = e-kD属于单击单靶模型。D37的倒数即为存活曲线斜率。D37：引起细胞（或酶分子）63死亡（或失活）的照射剂量。,2、带肩的细胞存活曲线,假设在细胞死亡前有两个或多个靶受到一次击中。 S = ne-kD曲线初始斜率不等于0，即在很低剂量时仍有一些细胞死亡。这个模型对许多哺乳动物细胞都适用。,剂量存活曲线的直线部分斜率的倒数为D0-平均致死剂量。D37 = D0 + Dq,Two major types of cell survival curves,Exponential,Sigmoid,D0 （mean lethal dose）值：细胞的平均致死剂量:剂量存活曲线的直线部分斜率的倒数D0愈小，斜率愈大D0值大小代表细胞放射敏感性的高低从存活曲线对数坐标0.1和0.037各作一条与横坐标相平行的线与曲线相交，从这两个交点分别作垂直线与剂量轴相交。相交点剂量之差即为D0值，多在12Gy,细胞存活曲线的参数,Dq （quasithreshould dose）值准阈剂量细胞积累亚致死性损伤的能力，与损伤修复有关。克服肩区所需的剂量由纵坐标1.0处作一条与横坐标的平行线，与外推线的交点在横坐标上投影点的数值即为Dq多在0.52.5Gy,n（extrapolation number) 值代表细胞内靶的个数或所需击中靶的次数将直线部分外推与纵坐标相交点的数值即为外推n值多为13,D37值引起细胞（或酶分子）63死亡的照射剂量D37D0+Dq单靶单击时，剂量存活曲线无肩区，Dq为0，此时D37就等于D0,3、连续弯曲曲线线性平方模型 Linear-Quadratic Model (LQ),细胞的放射敏感性 Intrinsic cellular radiosensitivity,衡量辐射敏感性的指标,个体：常用存活率或半致死剂量（D50）细胞：多数情况下都用克隆形成率(成灶率)表示其存活率，对肿瘤细胞也用SF2(2Gy照射后的存活率)；此外，染色体畸变率也是常用的评价指标,Bergonie&Tribondeau定律： 组织的放射敏感性与其细胞的分裂活动成正比而与其分化程度成反比。一般适合有许多例外如胸腺、淋巴细胞,一、哺乳动物细胞辐射敏感性的差异,1、不同细胞群体的放射敏感性体内细胞群体依据更新速率分为：（1）不断分裂更新的细胞群体敏感（2）不分裂的细胞群体（成熟）抗性（3）一般状态不分裂或分裂很慢抗性；但刺激后迅速分裂敏感。,第一类细胞：造血淋巴组织细胞，胃肠粘膜上皮和生殖上皮细胞第二类细胞：神经元，肌纤维，成熟粒细胞，红细胞等。第三类细胞：刺激后活跃分裂的，如再生肝,2、辐射敏感细胞具有如下特点：,细胞具有高分裂率(high division rate)细胞具有高代谢率(high metabolic rate)细胞尚未分化好(non-specialized type )具有很好的营养(well nourished),3、肿瘤细胞的辐射敏感性,敏感性有明显差异对射线高度敏感的肿瘤有：恶性淋巴瘤、精原细胞瘤、肾母细胞瘤等；中度敏感的，如多种鳞状上皮癌、分化差的腺癌、脑胶质瘤等；对放射治疗表现抗性的：如恶性黑素瘤、胃癌、软骨肉瘤等,Tumor cells vary dramatically in intrinsic radiosensitivity depending on their tissue of origin. The number of DNA lesions are the same but the outcome is different.,二、细胞周期不同时相 的放射敏感性,对辐射的敏感性由高到低： M G2 G1 S早S晚,Radiosensitivity of cell in cell cycle,Relative survivability of cells irradiated in different phases of the cell cycle: synchronised cells in late G2 and in mitosis (M) showed greatest sensitivity to cell killing,M G1 S G2 M,三、环境因素对细胞放射 敏感性的影响,细胞所处环境影响: 1、氧分压 2、防护和增敏作用的化学因子 3、密集抑制的稳相细胞培养,密集抑制的稳相细胞培养： 细胞处于拥挤状态，其生长、增殖受抑，放射敏感性降低潜在致死性损伤（potential lethal damage ,PLD)照射后，使细胞处于次佳生长环境下，染色体已受损的细胞若不立即进入分裂期，有丝分裂的延迟有利于DNA的修复。,四、细胞放射敏感性的机制探讨,几种机制1、DNA双链断裂的修复 （1）DNA SSB的修复与细胞的SLD修复 有关 （2）DNA DSB的修复与PLD修复有关,2、染色质结构的影响 S期为染色质；G2/M期为染色体3、初始DNA断裂 酶学修复过程之前的损伤产额,凡是有双链重接缺陷的细胞，其敏感性都是高的；然而敏感性高的细胞却不一定有明显的重接修复异常。原因有： （1）修复效率变化的幅度较小，现有的测定方法不够灵敏，不能测知。,（2）重接速率虽无变化，但修复不正确。如AT。 （3）各时相细胞内天然存在的SH化合物水平不同，G2/MS。 （4）存在别的机理。,辐射诱导的细胞损伤及其修复 Radiationdamage& repaire of cells,一、细胞放射损伤的分类,1、致死性损伤（lethal damage, LD）2、亚致死性损伤（sublethal damage, SLD）3、潜在致死性损伤（potentially lethal damage, PLD）,二、影响细胞放射损伤及修复的因素,1、射线种类损伤LET 曲线斜率变陡 肩区变小 n值降低,SLD、LD,2、剂量率3、氧效应4、辐射增敏剂5、辐射防护剂6、增温,对于正常细胞来说，总剂量一定时，剂量率越低，照射时间越长，生物效应就越轻。其机制是在拖延照射的过程中发生亚致死性损伤的修复和细胞增殖。,包括热水浴、短波透热、微波、超声和射频细胞效应取决于温度的高低及增温时间的长短机制不清与X射线的敏感性互补，在晚S期最敏感影响因素：PH、营养条件、氧热增强比（thermal enhancement ratio TER）,TER=,不增温时引起一定效应的辐射剂量,增温时引起相同效应的辐射剂量,一、写出下列缩写的中、英文全称并解释 PCD SF CDK CKI LD SLD PLD SLDR PLDR SER二、解释名词 G1阻滞 G2阻滞 存活分数 致死性损伤 亚致死性损伤 潜在性致死性损伤 亚致死性损伤修复 潜在性致死性损伤的修复 周期素 细胞周期三、简述题 1、试述辐射诱导G1阻滞的基因调控 2、试述辐射诱导G2阻滞的基因调控,复习题：,下课啦,
