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枸杞多糖的提取工艺研究,学院：步长医药学院专业；药物制剂姓名：罗丽指导老师：张爽,毕业论文,枸杞多糖的提取工艺研究学院：步长医药学院毕业论文,目录,摘要Abstraet第一章 概述1.1 多糖和枸杞多糖的概述1.1.1 多糖与枸杞多糖1.1.2 多糖与枸杞多糖的药理作用1.2 本研究的目的与意义1.3 多糖的提取方法第二章 枸杞多糖的提取2.1 实验材料与仪器2.2 实验步骤与方法2.2.1 多糖含量标准曲线的绘制,2.2.2 枸杞多糖得率计算2.2.3 超声辅助提取枸杞多糖第三章 试验结果与分析3.1 多糖含量标准曲线的绘制3.2 单因素试验结果3.3 超声辅助提取的枸杞多糖的正交试验结果与分析3.4 正交试验结果验证3.5总结第四章 结论第五章 前景展望参考文献致谢,目录摘要2.2.2 枸杞多糖得率计算,摘要,枸杞为茄科植物枸杞的干燥成熟果实，主产于河北与宁夏，是一种食药两用植物，味甘、性平、入甘、肾经，具有多种药理作用和生物功能。枸杞多糖是枸杞中的主要活性成分之一。其中有关枸杞多糖的化学、药理与临床研究十分瞩目，已有不少研究报道枸杞多糖具有增强免疫力、抗癌、防衰老、增强造血功能、防止遗传损伤、抑制肿瘤生长和细胞突变等作用。鉴于枸杞多糖具有多种药理作用和生理功能，引起了人们的广泛关注。本试验是为了研究超声辅助法对枸杞多糖的提取的影响。,摘要枸杞为茄科植物枸杞的干燥成熟果实，主产于河北与宁夏，是,目的:研究超声辅助提取法在枸杞多糖提取中的应用，并筛选出提取枸杞多糖的最佳提取条件。方法:采用正交实验的方法，对超声辅助提取法提取枸杞多糖的加水量、提取时间、提取温度及超声功率进行考察，以枸杞多糖得率作为评价指标，找出最适提取条件。结果:加水量为20倍，提取时间为40min，提取温度为80，超声功率为250W时枸杞多糖得率最高,可达到3.06%。结论:超声辅助提取法可作为枸杞多糖提取的一种有效方法。关键词:枸杞多糖; 超声辅助提取; 正交实验,目的:研究超声辅助提取法在枸杞多糖提取中的应用，并筛选出提取,Abstraet,ChWolfberry is the mamre fruitage and mostly planted in Hebei and NingxiaIt is a kind of edible and officinal plant and has various pharmacological effect and biological functionChWolfberry polysaccharide is the main functional component in ChWolfberryThe study of ChWolfberry focus attention upon chemistry, pharmacology and clinicIt is reported that ChWolfberry be able to buildup immunity capability, resist cancer, prevent consenescence，enhance hematopoietic function，avold genetic trauma，restrain tumour grow and cell mutation.ChWolfberry polysaccharide is broad attended because of its various pharmacological effect and biological function This experiment is to study the ultrasonic assisted method of Lycium barbarum polysaccharides extraction effect.,AbstraetChWolfberry is the m,Methods: using the method of orthogonal experiment, the ultrasonic assisted extraction of Lycium barbarum polysaccharides by water, extraction time, extraction temperature and ultrasonic power were studied, in order to LBP rate as evaluation index, find the optimal extraction conditions of.Results: The amount of water to 20 times, the extraction time was 40, the extraction temperature was 80, the ultrasonic power 250W wolfberry polysaccharide yield,up to 3.06%. Conclusion: ultrasound assisted extraction of Lycium barbarum polysaccharides extraction can be used as an effective method.Key words: LBP; extraction; orthogonal experiment,Methods: using the method of o,第一章 概述,多糖(Polysaccharide)又称多聚糖，由是由十个以上的单糖基通过普键连接而成的一类结构复杂的大分子化合物。一般多糖都由100个以上甚至几千个单糖组成，分子量为数万到数百万，是构成生命活动的4大基本物质之一，与生命的多种生理功能密切相关1。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。多糖可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖2。,1.1 多糖和枸杞多糖的概述1.1.1 多糖与枸杞多糖,第一章 概述多糖(Polysaccharide)又称多聚,多糖的分类3：根据多糖的来源不同，可将多糖分为植物性多糖，动物性多糖和微生物性多糖三大类。常见的植物性多糖有淀粉、纤维素、葡聚糖、果聚糖、半纤维素、树胶、粘液质、卡拉胶等4。常见的动物性多糖有肝糖元、甲壳素、肝素、硫酸软骨素、透明质酸等；常见的微生物性多糖有黄原胶等。根据生物功能多糖可分为储能多糖和结构多糖，结构多糖是一种水不溶性多糖，分子呈直糖链型，如纤维素、甲壳素等;贮能多糖可溶于热水成胶体溶液，可经酶催化水解释放单糖以供应能量，分子为支糖链型，如淀粉、肝糖原等。根据多糖在微生物体内分泌的部位又可分为胞内多糖、细胞壁多糖和胞外多糖。胞外多糖是由微生物大量生产的多糖，易于与菌体分离，故可实现工业化生产。,多糖的分类3：根据多糖的来源不同，可将多糖分为植物性多糖,根据存在的状态多糖可分为游离多糖和结合多糖(如蛋白多糖、脂多糖等)。根据分子结构的组成不同多糖可分为同多糖和杂多糖。同多糖是由一种单糖分子缩合而成的多糖，自然界中存在的如淀粉和搪原(分别是植物和动物中葡萄糖的贮存形式)、纤维素(植物细胞主要的结构组分)，都是由葡萄糖组成。杂多糖是由两种以上的单糖缩合而成的多糖，如透明质酸、硫酸软骨素等。有一些杂多糖由含糖胺的重复双糖系列组成，称为糖胺聚糖，又称氨基多糖，粘多糖等。糖胺聚糖是蛋白聚糖的主要组分，根据重复双糖单位的不同可分为五类:硫酸软骨素、硫酸用层酸、透明质酸、肝素、硫酸皮肤素、硫酸乙酞肝素5，6。,根据存在的状态多糖可分为游离多糖和结合多糖(如蛋白多糖、脂多,1.1.2 多糖与枸杞多糖的药理作用,70年代以来，科学家们发现多糖及糖复合物参与和介导了细胞各种生命现象的调节，特别是调节免疫力。80年代，现代生物技术如分析、测序、合成和结构诸方面研究的成熟，带动了多糖研究的深入，人们发现多糖的糖链能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长和衰老，在分子生物学中起着决定性作用，80年代末，糖蛋白的糖链与细胞识别，免疫保护等诸多生理功能相关的发现，使得多糖的研究形成了“糖生物学”和“糖工程学”两个新型学科，且发展极为迅速。近年来，多糖特别是中药多糖因具有增强免疫力、抗肿瘤及抗衰老等药理作用。而枸杞多糖(LBP) 是枸杞的有效成分之一。经研究发现，枸杞多糖既是保健功能因子,又是一种非特异性免疫增强剂，具有调节免疫功能、降血糖、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、增加造血功能、防止遗传损伤等作用711。现代医学研究证明：枸杞有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、降血脂、降血糖、降血压、补肾、保肝、明目、养颜、健脑、排毒、保护生殖系统、抗辐射损伤十六项功能。中药现代科学研究表明，枸杞子滋补肝肾，兼有人参、当归、黄花、肉桂等优点，其养价值很高，所以既是食品，又是药品。,1.1.2 多糖与枸杞多糖的药理作用70年代以来，科学家们,枸杞的提取工艺研究课件,1.2 本研究的目的与意义,本实验采用正交试验方法研究超声辅助提取法在枸杞多糖提取中的应用，并筛选出提取的最佳工艺条件。,1.2 本研究的目的与意义本实验采用正交试验方法研究超声辅,多糖常用的提取方法有：热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法和酶法。其中前三种为化学方法，酶法为生物法。在提取多糖之前，首先要根据多糖的存在方式及提取部位的不同，决定是否作预处理。动物多糖和微生物的细胞内多糖多有脂质包围，一般需先加入醇或醚进行回流脱脂，释放多糖，然后依多糖性质(如酸碱性、胞内或胞壁多糖)再将脱脂后的残渣采用冷水、热水、冷或热的氢氧化钠、乙酸或苯酚等溶液提取。溶剂性质、浸提温度、时间等均影响提取效果。提取多糖常用的酶有纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和复合酶。杨云等用蛋白酶提取大枣多糖12，孟庆繁等用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶的复合酶提取百合多糖13，林宇野、杨虹将其用于提取银耳多糖14，都取得了很好的效果，不仅提高了多糖的得率，而且缩短了提取时间。,1.3 多糖的提取方法,多糖常用的提取方法有：热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法和酶法。,此外，利用超声波、微波等技术有效的提高了多糖的得率和产品质量，并缩短了反应时间。李钟玉等用超声波提取灵芝多糖15，刘霞等用其提取甘草多糖16，都显著提高了多糖的得率。此外，李芙蓉、吕波用微波提取刺五加多糖17，孙萍等用微波提取甘草多糖18，也取得了较好的效果。根据多糖性质和结构可以采用热水提法、酸提法、碱提法、超声波提取法、微波提取法、超声辅助提取法以及微波辅助提取法19等方法，前三种方法不但耗时，而且酸和碱易破环多糖的化学结构；而超声波提取的时间较短，参考赵盈在柿子多糖的提取、分离、结构分析及体外抗氧化作用研究的文献20，我采用超声辅助提取法。,此外，利用超声波、微波等技术有效的提高了多糖的得率和产品质量,第二章 枸杞多糖的提取,材料、试剂与仪器 产地或者厂家葡萄糖标准品(Purity=99UV) 中国食品药品检定研究院枸杞子 西安盛兴中药饮片有限责任公司(宁夏)石油醚(分析纯) 天津市河东区红岩试剂厂 H2SO4 (分析纯) 北京化工厂 苯酚（分析纯） 天津市河东区红岩试剂厂乙醇(分析纯) 天津市河东区红岩试剂厂氯仿(分析纯) 北京化工厂KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司RE52A型旋转蒸发器 上海安亭实验仪器有限公司HHS2S数显示恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司DHC9502A型电热恒温鼓风干燥箱 上海琅玕实验设备有限公司SHB一循环水真空泵 郑州长城科工贸有限公司 精密电子天平 上海第二分析仪器厂UV752型紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司,2.1 实验材料与仪器,表1实验材料、仪器,第二章 枸杞多糖的提取材料、试剂与仪器,2.2 实验步骤与方法2.2.1 多糖含量标准曲线的绘制,采用H2SO4苯酚法对其加以改良。精密称取无水葡萄糖标准品25.0mg，置于25ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，配成1mgml的储备液，分别精密吸取储备0、0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml，置25ml容量瓶中,加5苯酚溶液1.0ml,摇匀，用移液管迅速垂直滴加浓硫酸各5.0ml，立即摇匀，再用蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀，沸水浴中煮沸15min；冷却后用分光光度计在490nm波长处测定其吸光度值；以试样糖含量C (mgml)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。,2.2 实验步骤与方法2.2.1 多糖含量标准曲线的绘制,2.2.2 枸杞多糖得率计算21,枸杞粗多糖质量( g)多糖得率 = 100% （公式2-1） 枸杞原料质量 ( g),2.2.2 枸杞多糖得率计算21,2.2.3 超声辅助提取枸杞多糖2.2.3.1 枸杞多糖提取工艺流程22,枸杞粉碎石油醚回流脱脂(水浴温度60) 过滤滤渣风干样品称重(预处理样) 超声波法提取抽滤粗多糖提取液浓缩至原体积的1/4醇沉Sevag法脱蛋白水溶解二次醇沉冷冻干燥枸杞粗多糖,2.2.3 超声辅助提取枸杞多糖2.2.3.1 枸杞多糖,2.2.3.2 单因素实验,(1)料液比对枸杞多糖得率的影响：称取破碎适度的枸杞10g，采用料液比为1：10、1：15、1：20、1：25，四个水平，90提取两次，每次30min，根据枸杞多糖的得率确定料液比。,本研究分别考察超声功率、超声处理时间、料液比、浸提温度和浸提时间对枸杞多糖得率的影响。采用苯酚一浓硫酸法测枸杞多糖23。,2.2.3.2 单因素实验(1)料液比对枸杞多糖得率的影响：,（2）超声功率对枸杞多糖得率的影响：称取破碎适度的枸杞10g，分别采用超声功率为100、150、250、300W四个水平，料液比1:20，在90下，提取两次，根据枸杞多糖的得率确定超声功率。（3）浸提温度对枸杞多糖得率的影响：称取破碎适度的枸杞10g，分别采用60、70、80、90四个温度水平，料液比1:20，提取两次，每次30min，根据枸杞多糖的得率确定浸提温度。（4）超声处理时间对枸杞多糖得率的影响：称取破碎适度的枸杞10g，分别采用超声处理时间20、25、30、35、40min四个水平，料液比1:20，在90下，提取两次，根据枸杞多糖的得率确定超声处理的时间。,（2）超声功率对枸杞多糖得率的影响：称取破碎适度的枸杞10g,2.2.3.3 超声辅助提取的枸杞多糖的正交试验24,25,在单因素试验的基础上，运用L9(34)正交表，以枸杞多糖得率为考察指标，由料液比、浸提温度、浸提时间、超声功率做四因素正交试验，以确定枸杞多糖超声辅助提取的最佳工艺参数。正交试验因素水平见表2。称取破碎适度的枸杞9 份，每份10 g，按照正交实验设计的条件提取。每次提取后过滤，合并滤液，浓缩至10 ml，备用。,2.2.3.3 超声辅助提取的枸杞多糖的正交试验24,25,水平 液料比（A） 超声功率/W(B) 提取温度/ (C) 提取时间/min (D) 1 10:1 150 70 30 2 20:1 250 80 35 3 25:1 300 90 40,表2 超声辅助提取枸杞多糖正交试验因素水平表,水平 液料比（A） 超声功率/W(B) 提取温度/,2.2.3.4 醇沉26,本研究采用95%的乙醇对枸杞多糖进行沉淀，将提取液浓缩至原体积1/4时，加入4倍量体积的95%乙醇，使多糖充分沉淀，待脱蛋白后再次醇沉。,2.2.3.4 醇沉26本研究采用95%的乙醇对枸杞多,2.2.3.5 Sevag法脱蛋白27,28,Sevag法脱蛋白：取一定量的粗多糖，加蒸馏水完全溶解，使其浓度为lOOmgml，按枸杞多糖水溶液体积的20加入氯仿，再加入氯仿体积的20的正丁醇，剧烈振摇20min，使其充分混匀，1000rmin离心，倾出上清夜，除去中间变性蛋白和下层氯仿。重复以上操作，直至中间层无变性蛋白，得到脱蛋白多糖。,2.2.3.5 Sevag法脱蛋白27,28Sevag,第三章 试验结果与分析,H2SO4苯酚法测多糖含量的标准曲线 表3 葡萄糖标准液吸光度 序号 0 1 2 3 4 5 浓度C 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1吸光度A 0 0.0712 0.1643 0.2412 0.3456 0.4209,3.1 多糖含量标准曲线的绘制,第三章 试验结果与分析 H2SO4苯酚法测多糖含量的标准,图1 H2SO4苯酚法测多糖含量的标准曲线,经线性回归，得回归方程为:Y=4.2923x-0.0074 (R2=0.9978), 葡萄糖浓度在0.020.1之间线性关系良好。,图1 H2SO4苯酚法测多糖含量的标准曲线 经线性回归，,3.2 单因素试验结果,（1）料液比对枸杞多糖得率的影响,图2 料液比对枸杞多糖得率的影响,3.2 单因素试验结果（1）料液比对枸杞多糖得率的影响图2,（2）超声功率对枸杞多糖得率的影响,图3 超声功率对枸杞多糖得率的影响,（2）超声功率对枸杞多糖得率的影响图3 超声功率对枸杞多糖,（3）浸提温度对枸杞多糖得率的影响,图4 温度对枸杞多糖得率的影响,（3）浸提温度对枸杞多糖得率的影响图4 温度对枸杞多糖得率,（4）超声处理时间对枸杞多糖得率的影响,图5 超声处理时间对枸杞多糖得率的影响,（4）超声处理时间对枸杞多糖得率的影响图5 超声处理时间对,3.3 超声辅助提取的枸杞多糖的正交试验结果与分析,在单因素试验的基础上，运用L9(34)正交表，以枸杞多糖得率为考察指标，由料液比、浸提温度、浸提时间、超声功率做四因素正交试验，实验结果见表4。,3.3 超声辅助提取的枸杞多糖的正交试验结果与分析在单,表4 枸杞多糖提取的正交试验结果,最佳工艺：A2C2B2D3,表4 枸杞多糖提取的正交试验结果最佳工艺：A2C2B2D,3.4 正交试验结果验证,表5 正交试验验证实验的结果实验号 多糖得率% 平均得率%1 2.862 3.18 3.063 3.16,3.4 正交试验结果验证表5 正交试验验证实验的结果,通过正交试验得出枸杞多糖的最佳提取工艺条件为料液比1:20,超声功率250W，80提取40min，提取两次，但是正交试验没有安排这组实验，必须进行实验验证。由表5中的结果可知该提取工艺条件合理可行，重现性好。因此利用宁夏枸杞为原料，提取枸杞多糖的最佳工艺条件为：采用超声辅助提取方法，提取溶剂以水为萃取溶剂；超声提取功率为:250W；料液比1:20；提取温度80,提取时间40min，提取两次，可实现枸杞多糖得率3.06%。,通过正交试验得出枸杞多糖的最佳提取工艺条件为料液比1:20,3.5 总结,在单因素实验的基础上，选定提取温度、提取时间、料液比及超声功率四个因素设计了四因素三水平正交试验，通过正交试验极差分析得出，影响枸杞多糖提取率的因素大小顺序为ACBD，即料液比对枸杞多糖提取率的影响最大，其次是提取温度和超声功率，提取时间对枸杞多糖提取率的影响较小。根据上述枸杞多糖提取工艺的优化研究直观分析确定了枸杞多糖的提取工艺条件为料液比1:20,超声功率250W，80提取40min，通过3次平行验证试验得出在该方案下枸杞多糖的提取率为3.06%，该结果说明本方案较为有效，可在较短的时间内提取出枸杞多糖，该方案可用于枸杞多糖的提取。,3.5 总结在单因素实验的基础上，选定提取温度、提取时间、,第四章 结论,实验选取宁夏枸杞作为研究对象，利用常规超声波辅助法提取，结合化学方法对提取产品进行了系统的分析研究，做出了最佳的提取工艺，为宁夏枸杞资源合理开发利用提供了依据，做出以下结论：获得了以宁夏枸杞为原料提取枸杞多糖的最佳生产工艺及参数：采用超声辅助提取技术，提取溶剂以水为萃取溶剂；微波提取功率为：250W；料液比1:20；提取温度80；提取时间40min次，提取两次，可实现枸杞多糖得率为3.06%优化提取工艺。,第四章 结论实验选取宁夏枸杞作为研究对象，利用常规超声波,第五章 前景展望,多糖作为药物其毒性极小，是开发防治肿瘤和免疫缺陷疾病药物的重要来源。枸杞子系茄科植物枸杞的干燥果实，性甘平，具有补肾养肝、润肺明目、益精骨、补血之功效。枸杞多糖(LBP)是从枸杞子中分离出的有效成分之一，具有降血糖、抗疲劳、增强免疫、耐缺氧、延缓衰老、促进排铅等多种生物功能。枸杞子自古以来就是一种常用的中药材，目前枸杞子具有的生物活性已逐渐被人们认知，枸杞多糖是其发挥降血糖和增强免疫活性的主要成分。研究显示枸杞中含有大量的活性成分，而我国的枸杞资源相当丰富。随着对多糖研究的进一步深入，枸杞多糖的其他生物活性可能会被进一步发现，因此枸杞多糖具有广阔的开发前景，对枸杞多糖的开发和利用也会越来越引起人们的重视。,第五章 前景展望,参考文献,【l】丁保金，金丽琴，吕建新.多糖的生物活性研究进展J.中国药学杂志2004，39(8):561一564.【2】刘湘，汪秋安等.天然产物化学M.北京:化学工业出版社，2010. 【3】冯婷，何聪芬等植物多糖研究概况 J 京工商大学学报，2004，(5)：1-4【4】李炳辉.之母多糖的提取分离及其活性探讨J.华南理工大学硕士论文.2011,6【5】方积年，丁侃.天然药物一多糖的主要生物活性及分离纯化方法J.中国天然药物，2007，5(5):338一346.【6】张力田.碳水化合物化学M.北京:轻工业出版社， 1988;292一318.【7】 王玲, 李维波, 邓学端, 等. 枸杞多糖对糖尿病小鼠模型免疫功能的影响J. 上海免疫学杂志, 2000, 15(2): 118.【8】 张勇. 枸杞多糖降血糖及预防糖尿病肾病作用的研究D.东南大学硕士论文. 2006， 5【9】 张敏, 赵太济, 张新华, 等. 枸杞子抗衰老保肝等实验研究综述J. 时珍国医国药, 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