模式植物拟南芥TDNA插入突变体的PCR鉴定ppt课件.ppt
十三 模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定,一、实验目的：,1. 学习用PCR方法检测生物遗传差异；2. 了解植物T-DNA插入突变体的鉴定原理。,二、实验原理,1. Ti质粒和T-DNATi质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。人们根据这一现象，将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。2. T-DNA插入基因内部导致基因突变T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。,3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体，LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR，根据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。,左引物 LP： TCATCCACCATGGAAGAAAAG 右引物 RP： TTGGATACGATGCGAGTAACC 中间引物LB: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG用LP+RP产生大带：1107bp用LB+RP产生小带：560-860bp,三、实验步骤,实验材料：拟南芥T-DNA插入突变体分离群体30个株号的植株。实验方法：（每人做1个株号的检测）,(一) 拟南芥基因组DNA提取,1. 原理,分离动物、植物、微生物DNA是进行遗传操作（基因组DNA序列分析、遗传标记分析、基因克隆、基因定位）的第一个步骤。不同的研究目的对DNA的纯度和产量要求不同。 如：构建基因文库及用于限制性片断长度多态(RFLP)等对纯度要求高；用于PCR分析的DNA则应不含干扰PCR反应的污染物；用于遗传标记分析的DNA，纯度要求低但产量则要高。,一个好的分离程序应符合三个标准：所得DNA的纯度满足下游操作要求；所得DNA应完整；所得DNA量足够。,DNA在化学上是稳定的，但它在物理上是易碎的，高分子质量的DNA长而弯曲，即具有极微弱的侧向稳定性，易受到最柔和的流体剪切力的伤害，由吸液、振荡、搅拌所致的水流能剪切断DNA双链。提取动物、植物、微生物基因组的DNA所面临的问题不尽相同，在这个实验中学习植物总DNA提取与鉴定。,本实验采用CTAB法。 CTAB的主要作用是破膜。 CTAB属阳离子表面活性剂，能溶解膜蛋白与脂类，也可解聚核蛋白。在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。酚/氯仿/异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质，并有利于水相与有机相的分开，而且可以消除泡沫。异丙醇或乙醇的作用是脱去DNA周围水分子，使DNA失水而聚合沉淀。,2、药品,CTAB提取液（1000 ml）组成： 20 g CTAB 100 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0 40 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 81.8 g NaCl 0.2%(V/V)-巯基乙醇注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇酚/氯仿/异戊醇： 25：24：1氯仿/异戊醇： 24：1TE缓冲液：Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L3 M NaAc（pH 5.2）,3. DNA提取步骤,用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离心管中，加入预热至65的600 l 的2CTAB提取液，轻摇混匀。65水浴1 h，其间轻摇混匀。12000 rpm离心15 min，弃沉淀，取上清转移至另一1.5 ml 离心管中。向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀10 min，然后12000 rpm离心15 min，再转移上清入新管。向上清液中加等体积的冷异丙醇，小心混匀。-20 放置30 min，12000 rpm离心10 min，弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。将沉淀在超净工作台上吹干，或空气中晾干。加50 l TE (pH 8.0)放4 缓慢溶解。电泳检测DNA的浓度和质量。,注意事项,1研磨后应迅速加入提取液，因为提取液中含EDTA，能够螯合Mg2+等二价阳离子，防止破碎细胞中的DNA酶降解DNA。2提取过程中，避免剧烈震荡，以免对DNA造成不必要的机械损伤。3. 干燥DNA时，要注意过干或过湿都不利于DNA的溶解。,（二） PCR反应,步骤,1. 按如下方法调制PCR反应液，因每管加样量少，可几人一组预混除模板DNA之外的成分。分装后各人再加入自己的模板DNA。PCR管上注意写明株号和引物类型：第一管： 第二管： 10 xTaq buffer 2.5ul 10 xTaq buffer 2.5ul MgCl2 2 ul MgCl2 2 ul 某株号模板DNA 2 ul 某株号模板DNA 2 ul 引物LP 1 ul 引物RP 1 ul 引物RP 1 ul 引物BP 1ul dNTP 1 ul dNTP 1 ul Taq酶 0.2 ul Taq酶 0.2 ul H2O 15.3 ul H2O 15.3 ul 总共 25 ul 总共 25 ul2. PCR程序：94变性5min； 94变性1min, 50复性1min, 72 延伸2min，共30个循环；72最终延伸10min;10保持。3. PCR结束以后，将样品拿出，检查管子上的株号是否清晰，放-20 保存，等待下次实验，电泳检查结果。,（三) PCR结果的电泳检查,步骤,用1XTAE或TBE电泳缓冲液配制1琼脂糖胶；在15 uL PCR产物中加3uL上样缓冲液(6x)， 15uL 基因组DNA中加3uL上样缓冲液(6x)，于1% 琼脂糖胶上电泳, 稳压100（5/cm）；电泳结束，溴化乙锭溶液染色20分钟（如果你的电泳凝胶中不含溴化乙锭）；在紫外灯下或用凝胶成像仪观察、拍照。,PCR产物电泳结果实例，纯合的野生型只有大带，纯合的插入突变型只有小带，杂合的插入突变型有大小2个带,Marker WT T,基因组DNA提取结果实例：左边泳道为分子量Marker,谢谢,骑封篙尊慈榷灶琴村店矣垦桂乖新压胚奠倘擅寞侥蚀丽鉴晰溶廷箩侣郎虫林森-消化系统疾病的症状体征与检查林森-消化系统疾病的症状体征与检查,
