基因工程大实验课件.ppt
基因工程大实验,专 业：生 物 技 术授课教师：恩和、邰丽华,基因工程大实验专 业：生 物 技 术,目 录,实验 一、大肠杆菌感受态细胞的制备实验 二、大肠杆菌感受态细胞的转化实验 一、碱变性法抽提质粒DNA实验 四、DNA的纯度、浓度及分子量的测定实验 五、DNA的酶切、连接与转化实验 六、动物基因组DNA的提取和检测实验 七、植物基因组DNA的提取和检测实验 八、聚合酶链式反应实验-随机扩增 多态性DNA分析,目 录实验 一、大肠杆菌感受态细胞的制备,实验四、DNA的纯度、浓度 及分子量的测定,实验目的相关知识及原理仪器、材料和试剂操作步骤实验结果,实验四、DNA的纯度、浓度 及分子量的测定,实验目的,学习掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法 和技术学习掌握凝胶成像系统、琼脂糖凝胶电 泳系统、紫外-可见分光光度计的使用方 法,实验目的学习掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法,相关知识及原理,琼脂糖凝胶电泳 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效 应和分子筛效应 分子筛效应 DNA分子的大小和构型 质粒构型：cccDNA L-DNA OC-DNA,相关知识及原理琼脂糖凝胶电泳,仪器、材料和试剂,仪器 琼脂糖凝胶电 泳系统 凝胶成像系统 紫外-可见分光光 度计材料 pUC18,试剂 DNA Marker TAE/TBE缓冲液 点样缓冲液 溴化乙锭（EB） 琼脂糖,仪器、材料和试剂仪器试剂,实验结果,计算DNA浓度、纯度 浓度计算：OD 260=1 DNA浓度=50ng/ml DNA的浓度=稀释倍数(350)OD 260 50 纯度计算： OD 260/ OD 280 1.9 蛋白多 OD 260/ OD 280 2 RNA多 在紫外灯（360nm，312nm或254nm） 下观 察染色后的电泳凝胶,实验结果 计算DNA浓度、纯度,操作步骤,DNA的浓度、纯度测定 （1）稀释DNA (350倍) 10 l DNA + 3490 l TE （2）紫外-可见分光光度计 用TE作对照，石英比色皿 （3）浓度计算：OD 260 =1时 DNA的浓度 = 50g/ml DNA的浓度=稀释倍数(350)OD260 50 纯度计算： OD260/ OD280,操作步骤DNA的浓度、纯度测定,操作步骤,DNA分子量测定 （1）琼脂糖凝胶的制备 取0.7g 琼脂糖，放入锥形瓶中，加100ml 0.5倍TBE/TAE缓冲液，置微波炉加热至完全溶 化，取出摇匀，则为0.7%琼脂糖凝胶。待凝胶 冷却至60 ，加入EB，使终浓度为0.5g/ml。,操作步骤DNA分子量测定,操作步骤,（2）胶板的制备 将有机玻璃内槽、梳子等洗净烘干。 将有机玻璃放置于凝胶槽内，并放好梳子。 将60左右的琼脂糖凝胶液缓慢而连续地 倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层 均匀的胶板（注意：若有气泡产生，用小枪头吸出）。,操作步骤 （2）胶板的制备,操作步骤,待胶凝固后，取出梳子（竖直、迅速 拔出），取有机玻璃内槽（带胶板），放在 电泳槽内。 加电泳缓冲液至稍没过胶面（不要太 多或太少）。 （3）加样 用移液枪将样品DNA与上样缓冲液混匀。,操作步骤 待胶凝固后，取出梳子（竖直、迅,操作步骤, 将吸有混合液的枪头缓慢插入加样孔液面 以下，缓慢将液体加入（注意：加样后枪头离开 液面后再松开枪）。 注意：记录点样顺序及点样量 （4）电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源（DNA带负电）。 当溴酚蓝染料移动到距胶前沿12cm处，停 止电泳。,操作步骤 将吸有混合液的枪头缓慢插入加样孔液面,实验 八、聚合酶链式反应实验 随机扩增多态性DNA分析,实验目的相关知识及原理仪器、材料和试剂操作步骤实验结果,实验 八、聚合酶链式反应实验,实验目的,学习掌握PCR反应的基本原理与实验技术学习掌握PCR仪的使用方法,实验目的学习掌握PCR反应的基本原理与实验技术,相关知识及原理,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复 制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与两侧 互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火 和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。,相关知识及原理 聚合酶链式反应（polyme,操作步骤,1、在0.2m L Eppendorf管内配置20L反应体系： 反应物 体积/ L ddH2O 1 2 10 PCR缓冲 2.0 2.5 mmol/L dNTP 2.0 随机引物 1.0 模版DNA 2.0 Taq酶 1.0 （1U） 点动混匀，加10 L矿物油。,操作步骤1、在0.2m L Eppendorf管内配置20,操作步骤,2、按下述程序进行扩增反应条件：（1）94C 预变性 4min；（2）94C 变性 30sec；（3）36C 退火 40sec；（4）72C 延伸 100s ；（5）重复步骤（2）（4） 35次；（6）72C 延伸 7min。,操作步骤,操作步骤,3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配置1.4%琼 脂糖凝胶，取10 L扩增产物电泳。,操作步骤3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配置1.4%琼,实验结果,实验结果,实验 六、动物基因组DNA 的提取和检测,实验目的相关知识及原理仪器、材料和试剂操作步骤实验结果,实验 六、动物基因组DNA 的提取和检测实,实验目的,学习掌握从动物组织提取基因组 DNA的原理和方法，以及相对分 子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶 电泳技术。,实验目的 学习掌握从动物组织提取基因组,相关知识及原理,在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋 白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得 到哺乳动物基因组DNA，用此方法得到的 DNA长度为100150kb，适用于噬菌体 构建基因组文库和Southern分析。,相关知识及原理 在EDTA和SDS等去污剂存,仪器、材料和试剂,仪器 台式离心机 玻璃匀浆器 高压灭菌锅 恒温水浴器材料 兔肝,试剂 蛋白酶K 组织匀浆液 酶解液 RNA酶 TE溶液,仪器、材料和试剂仪器试剂,实验结果,提取的DNA应为一条带,实验结果提取的DNA应为一条带,实验 七、植物基因组DNA 的提取和检测,实验目的相关知识及原理仪器、材料和试剂操作步骤实验结果,实验 七、植物基因组DNA 的提取和检测实,实验目的,学习掌握从植物组织中提取DNA的 方法学习掌握液氮的使用,实验目的学习掌握从植物组织中提取DNA的,相关知识及原理,利用液氮对植物组织进行研磨破碎 细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋 白而破坏细胞膜，使蛋白变性而沉淀下 来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯 仿提取的方法去除蛋白，得到的DNA溶液 经乙醇沉淀。,相关知识及原理 利用液氮对植物组织进行研磨破,仪器、材料和试剂,仪器 低温离心机 恒温水浴器 台式离心机 琼脂糖凝胶系统,材料 试剂 CTAB提取缓冲液 TE,仪器、材料和试剂仪器材料,实验步骤,CTAB提取法：（1）称取0.5克植物材料放入预冷至-20的研钵中 （提前灭菌），加入少量石英沙，再倒入液氮 (分批加入)，研成粉末状，置于灭菌的10ml离 心管 中。（2）加入2ml 65预热的CTAB提取缓冲液充分混匀 后在65保温90min;,实验步骤 CTAB提取法：,实验步骤,CTAB提取缓冲液: 2%（w/v）十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）: 1.4M NaCl； 20mM EDTApH8.0； 100Mm Tris- HCl pH8.0 ； 2%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮（PVP）； 5%（v/v）巯基乙醇（使用前加入）（3）加入等体积氯仿：异戊醇（24 ：1）充分摇 匀后，4 6000r/min离心15 min。,实验步骤 CTAB提取缓冲液:,实验步骤,（4）用扩口吸头取上清液移入另一10ml离心管中， 加入2/3体积-20预冷的异丙醇，轻轻颠倒摇 匀后，-20放置20min , 在冷冻离心机上于 4 5000r/min离心10 min ,缓慢倾倒出上清 液。（5）在沉淀中加入1ml65预热的CTAB提取缓冲液 ，温浴1h,待沉淀充分溶解后，加入等体积氯 仿：异戊醇，充分混匀，4 6000r/min离心 10 min 。,实验步骤（4）用扩口吸头取上清液移入另一10ml离心管中，,基因工程大实验课件,实验步骤,（6）重复第4步；（7）用70 %乙醇洗沉淀两次，在室温晾干， 加入200l TE缓冲液溶解 DNA 2h。（8）配制0.7%的琼脂糖凝胶电泳分析，取 5l的样品电泳。,实验步骤（6）重复第4步；,实验结果,提取的DNA应为靠近点样孔的一条带，,实验结果提取的DNA应为靠近点样孔的一条带，,操作步骤,1、取0.4g兔肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后 置于4ml匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明 显组织块存在（冰浴操作）。2、将组织细胞移至10ml离心管中,4 4000 rpm离心1.5min,弃上清。3、沉淀加1ml无菌水迅速吹散，再加1ml酶解液， 翻转混匀（动作一定要轻）55水浴处理12 18h。,操作步骤1、取0.4g兔肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后,操作步骤,4、加RNase至终浓度100g/m（222l）,37水 浴2h。5、加入等体积酚(约2ml)抽提一次，（慢慢旋转 混匀，水平摇床摇10min），4 8000 rpm离 心10min。6、用扩口吸头移出含DNA的 水相（注意勿吸出 双相界面蛋白层），加等体积(约2ml)氯仿： 异戊醇（24：1）4 10min,8000 rpm离心 10min。（有时如果DNA含量过高，水相在下 层，实验时注意观察）,操作步骤4、加RNase至终浓度100g/m（222l）,操作步骤,7、用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，移入 10ml离心管，加入250l 5mol/l NaCI(终浓 度0.1-0.25mol/l),小心混匀（要充分）， 在向每管中加入2.5倍体积(约6ml)的无水乙 醇-20 2h。8、12000rpm离心15min，弃上清，70%冷乙醇洗 涤一次， 12000rpm离心15min，室温干燥， 加入100l TE缓冲液，轻摇混匀，存放4 过夜（或2h）。9、电泳鉴定（0.7%的琼脂糖凝胶）。,操作步骤7、用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，移入,仪器、材料和试剂,仪器 PCR仪 琼脂糖凝胶电泳系统材料 兔基因组DNA 随机引物,试剂 PCR缓冲（10） dNTP Taq酶 矿物油,仪器、材料和试剂仪器试剂,实验五、 DNA的酶切、连接 与转化,实验目的相关知识及原理仪器、材料和试剂操作步骤实验结果,实验五、 DNA的酶切、连接 与转化实验目,实验目的,学习掌握重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。学习掌握X-gal 等试剂的配制保存。,实验目的学习掌握重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。,相关知识及原理,重组子T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应: （1）酶 + ATP = 酶-AMP复合物 （2）酶-AMP复合物结合DNA切口上，使 DNA腺苷化 （3）形成新的磷酸二酯键，封闭切口蓝白斑选择（ Xgal 、IPTG ）、 互补,相关知识及原理重组子,仪器、材料和试剂,仪器 电热恒温水浴 台式/低温离心机 恒温摇床 恒温培养箱 恒温水浴,材料 DH5、TOP10 pUC18/19 植物DNA试剂 X-gal IPTG BamHI T4DNA连接酶,仪器、材料和试剂仪器材料,操作步骤,制备重组DNA （1）在灭菌的Eppendorf管（0.5ml）中,加入15l pUC18,2l酶切缓冲液，1l（2U）BamHI酶, 2l BSA （酶和缓冲液放在冰上),混合物总体 积20l，离心混匀，37 反应3h。（2）在另一无菌管中，加入植物DNA 1.5g，1l 酶切缓冲液，1l（ 2U） BamHI酶, 2l BSA ，无菌水6 .5l，混合物总体积10l,离心混 匀，37反应3h。,操作步骤制备重组DNA,操作步骤,（3）各取 2l酶解液做电泳分析。（4）剩余酶解液加入1/10体积的3mol/l KAc(PH5.2) 溶液，再加2倍体积的无水乙醇，置-20 冰 箱 2h（沉淀DNA）。12000rpm 4 离心15min, 弃上清，加70%乙醇洗沉淀物，再离心，去上 清，倒置干燥，加 5lTE溶液溶解。(替代方 案：剩余酶解液65 ,保温15min),操作步骤（3）各取 2l酶解液做电泳分析。,操作步骤,（5）将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4 DNA 连接酶缓冲液1l， T4DNA连接酶1l，14 保温14h。（6）制备感受态细胞（Top10）。（7）同时制备含100 g/ml氨苄青霉素的固体LB培养 基，待培养基冷却，培养基（90mm）中央滴加 40l 2%X-gal和7l 20%IPTG(Top10不加)， 用无菌涂棒使之均匀涂布于培养基表面，然后37 温浴直至液体全部消失。,操作步骤（5）将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4,操作步骤,（8）转化 第一组：5l(50ng)重组子+ 200l感受态细胞， 此管为转化实验组。 第二组：5l无菌水+ 200l感受态细胞悬液。（9）实验组、对照组分别取80l悬液均匀涂布在含 X-gal、Amp的固体LB培养基和含Amp的固体LB培 养基上；再取40l悬液均匀涂布普通固体LB培 养基上，37 过夜培养,操作步骤（8）转化,实验结果,含X-gal、Amp的固体LB培养基 白色菌落（重组子）和兰色菌落（pUC18） 兰色菌落（pUC18）或无菌落含Amp的固体LB培养基 有菌落 无菌落普通固体LB培养基 有菌落 无菌落,成功成功成功失败成功失败,实验结果含X-gal、Amp的固体LB培养基,实验 一、大肠杆菌感受态细胞的制备,实验目的相关知识及原理仪器、材料和试剂操作步骤实验结果,实验 一、大肠杆菌感受态细胞的制备实验目的,实验目的,了解制备感受态细胞的的意义掌握大肠杆菌感受态细胞的制 备方法和技术掌握感受态细胞的保存方法,实验目的了解制备感受态细胞的的意义,相关知识及原理,感受态感受态细胞原理：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2 等化学试剂法或电击法）的处理后，细 胞膜的通透性发生变化，成为能容许多 有外源DNA的载体分子通过的感受态细 胞基本方法：细菌经0 的低渗CaCl2处理，使细 菌处于感受态，然后加入甘油-70条件 下保存,相关知识及原理感受态,仪器、材料和试剂,材料 大肠杆菌DH5 TOP10试剂 0.1molL CaCl2溶液 LB培养基（液态）,仪器 超净工作台 电热恒温水浴 分光光度计 低温离心机 制冰机,仪器、材料和试剂材料仪器,操作步骤,（1）从 DH5(或TOP10)菌平板上挑取一单落， 接种于15ml LB液体培养基中，37振荡培 养12h左右。（2）取该菌悬液150l 转接于15ml LB液体培养 基中，37振荡培养2h左右（ OD6000.5）（3）将菌液转移到10ml离心管（每管8ml），放 冰上10min。,操作步骤（1）从 DH5(或TOP10)菌平板上挑取一单,（4）离心10min（4000r/min），回收细胞（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快 而稳） 。（5）倒净上清培养液(倒置1 min)，用1.6ml冰冷的 0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，立即放在 冰上30 min 。 （6）4离心10min（5000r/min），弃上清液，回收 细胞。,操作步骤,（4）离心10min（4000r/min），回收细胞（从这一,操作步骤,（7）用320ul冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻 悬浮细胞，立即放在冰上 。（8）分装细胞，每管170ul细胞悬液再加30ul甘 油（灭菌）。（9）作标记，-70保存。,操作步骤（7）用320ul冰冷的0.1mo1L CaCl2,实验 二、大肠杆菌的转化 及转化子的检测,实验目的相关知识及原理仪器、材料和试剂操作步骤实验结果,实验 二、大肠杆菌的转化 及转,实验目的,掌握感受态细胞转化的基本知识掌握大肠杆菌感受态细胞转化的方法了解感受态细胞转化的的意义,实验目的掌握感受态细胞转化的基本知识,相关知识及原理,转化原理:转化混合物中的外源DNA形成抗DNA酶的羟 基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。 转化是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受 体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基 因工程等研究领域的基本实验技术。转化方法：热击法、电转化法,相关知识及原理转化,仪器、材料和试剂,仪器 无菌超净台 电热恒温水浴 分光光度计 低温离心机 微型离心管 移液器,材料 感受态细胞 pUC18、pUC19试剂 CaCl2溶液 （0.1molL） LB培养基 氨苄青霉素,仪器、材料和试剂仪器材料,操作步骤,（1）分别取2个200l感受态细胞悬液 第一组转化实验组： 0.5l(50ng)pUC18/pUC19 + 200l感受态细胞 第二组受体菌对照组： 0.5l无菌水 + 200l感受态细胞悬液（2）将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min，于 42水浴中保温1.5min，然后迅速冰上冷却 2min。,操作步骤（1）分别取2个200l感受态细胞悬液,操作步骤,（3）立即向上述管中分别加入0.8ml LB液体培养 基（不需在冰上操作），使总体积到1ml， 该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37振 荡培养约1.5h（170rpm）。（4）取各样品培养液 0.1ml，分别接种于含抗菌 素LB平板培养基和普通LB平板培养基上，涂 匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微 凉一下再用，不要过烫）。,操作步骤（3）立即向上述管中分别加入0.8ml LB液体培养,（5）菌液完全被培养基吸收后，倒置培 养皿，于37恒温培养箱内培养过 夜(12-16小时)，出现菌落。,操作步骤,（5）菌液完全被培养基吸收后，倒置培操作步骤,实验结果,含抗生素LB平板培养基 第一组有菌落，第二组无菌落 第一组、第二组均无或有菌落 普通LB平板培养基 第一组、第二组均无菌落 第一组、第二组均有菌落,成功失败失败成功,实验结果含抗生素LB平板培养基,实验一、碱变性法提取 质粒DNA,实验目的相关知识及原理仪器、材料和试剂操作步骤实验结果,实验一、碱变性法提取 质粒DNA实验目的,实验目的,学习掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法和技能；学习掌握质粒DNA浓度、纯度的检测方法；学习掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法；,实验目的学习掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法和技能；,相关知识及原理,碱裂解法提取法是根据共价闭合环状DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。pH介于12.012.5范围内，线性的DNA双螺旋解开变性；质粒DNA的氢键会断，但两链彼此盘绕。当恢复到中性时，质粒DNA复性迅速而准确；线性染色体DNA复性不迅速，而且缠绕形成网状结构，通过离心使他们分离。,相关知识及原理碱裂解法提取法是根据共价闭合环状DNA与线性染,仪器、材料和试剂,仪器 恒温培养箱 摇床 电热恒温水浴 电泳仪 低温离心机 紫外线透射仪,材料 pUC 18/19试剂 溶液/ 胰RNA酶 TE缓冲液,仪器、材料和试剂仪器材料,操作步骤,（1）15ml的含氨苄氰霉素LB培养基中接入上一 实验得到的转化子，37 震荡培养8h,加入 氯霉素（终浓度150 g/ml），培养过夜。（2）取1.5ml培养物倒入离心管中，4000r/min离 心3min，吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干 燥。（3）将细菌沉淀悬浮于100 l溶液 （冰上预冷） 中，剧烈振荡，室温放置5 min。,操作步骤（1）15ml的含氨苄氰霉素LB培养基中接入上一,操作步骤,（4）加200 l溶液（新鲜配制），盖紧管皿， 快速颠倒离心管5次，混匀内容物，将离心 管放冰上5 min。（5）加150 l溶液（冰上预冷），盖紧管皿， 颠倒数次使其混匀，冰上放置10 min。（6）12000r/min，离心5 min，将上清液转至另 一离心管。,操作步骤（4）加200 l溶液（新鲜配制），盖紧管皿，,操作步骤,（7）向上清中加入等体积(约450 l) 酚：氯仿： 异戊醇（25：24 ： 1）（去蛋白），混合有 机相和水相，12000rpm,离心5 min，将上清用 移液器集中转移到另一离心管中（小心移液， 不要把分界面的蛋白质吸入）。（8）向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温 放置10min，12000rpm离心5min。去上清液， 把离心管倒扣在吸水纸上，吸干管壁液体。,操作步骤（7）向上清中加入等体积(约450 l) 酚：氯仿,操作步骤,（9）用4ml70%乙醇（-20 预冷）洗涤质粒 DNA沉淀，振荡并离心(12000rpm,5min)，倒 去上清夜，晾干。（10）加100l TE缓冲液，其中含有20 g/ml的 胰RNA酶(2l， 1mg/ml RNA酶)，使DNA完全 溶解，20 保存。,操作步骤（9）用4ml70%乙醇（-20 预冷）洗涤质粒,
