基因工程基本概念与工具酶课件.ppt

2.DNA重组技术与基本操作,2.DNA重组技术与基本操作,基因工程,1.基因工程概况2.DNA重组与工具酶 3.基因克隆载体4.目的基因5.重组DNA导入受体细胞6.重组子的鉴定,基因工程1.基因工程概况,第一节 基因工程概况,一、基因工程的基本概念 1. 基因(gene) : 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列总称，是遗传物质的最小功能单位。,第一节 基因工程概况一、基因工程的基本概念,2.重组DNA技术:,是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件,2.重组DNA技术:是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体,3.基因工程：,是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）； 下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 基因工程的核心是构建重组体DNA的技术，所以基因工程和重组DNA技术有时也就成为同义词。,3.基因工程：是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游,二、基因工程研究的理论依据是：,1.不同基因具有相同的物质基础： 不同生物的基因（DNA片段）原则上是可以互换的。2.基因是可以切割的 3.基因是可以转移的，而且是可以重组的4.多肽与基因之间存在对应关系 5.遗传密码是通用的6.基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代,二、基因工程研究的理论依据是：1.不同基因具有相同的物质基础,三、基因工程的基本过程：,（一）基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤：1.分离或合成基因（分离或PCR）。 2.通过体外重组将基因插人载体（由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体）;3.将重组DNA导人细胞（微生物、植物或动物）;4.扩增克隆的基因; 5.筛选重组体克隆，对克隆的基因进行鉴定或测序; 6.控制外源基因的表达; 7.得到基因产物或转基因动物、转基因植物.,三、基因工程的基本过程：（一）基因工程操作过程大致可归纳为,一个典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤：,提取供体生物的目的基因(或称外源基因)，酶解连接到另一DNA分子上(克隆载体)，形成一个新的重组DNA分子；将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化(transformation)；对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定；对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外源基因是否表达。,一个典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤：提取供体生物,基因工程-基本概念与工具酶课件,（二）基因工程上游操作的基本过程,（1） 从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称“切”）；,（二）基因工程上游操作的基本过程（1） 从供体细胞中分离出基,（二）基因工程上游操作的基本过程,（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子（简称“接”）；,（二）基因工程上游操作的基本过程（2）用DNA连接酶将含有外,（二）基因工程上游操作的基本过程,（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称“转”）；,（二）基因工程上游操作的基本过程（3）借助于细胞转化手段将D,（二）基因工程上游操作的基本过程,（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称“增”）；,（二）基因工程上游操作的基本过程（4）短时间培养转化细胞，以,（二）基因工程上游操作的基本过程,（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞（简称“检”）；,（二）基因工程上游操作的基本过程（5）筛选和鉴定转化细胞，获,（二）基因工程上游操作的基本过程,由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为：“切、接、转、增、检”五步；,（二）基因工程上游操作的基本过程 由此可见，基因工程的,四、 基因工程的四大要素,1 基因工程工具酶和DNA加工 限制性核酸内切酶 连接酶 末端修饰酶 等 2 基因克隆载体 常用载体：质粒和病毒 等3 目的基因 简单的说目的基因就是能表达优良性状的基因。4 受体细胞,四、 基因工程的四大要素1 基因工程工具酶和DNA加工,五 基因工程的支撑技术,核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术,五 基因工程的支撑技术核酸凝胶电泳技术,六、重组DNA技术与基因工程的基本用途,分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质,六、重组DNA技术与基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究,第二节 DNA重组与工具酶,1 DNA2 基因工程的工具酶3 DNA片段的连接重组,第二节 DNA重组与工具酶 1 DNA,一、DNA,核酸组成核酸的分类四种碱基核酸的功能 能携带遗传信息 DNA分子能在细胞内复制 DNA分子可转录合成RNA mRNA翻译合成蛋白质,一、DNA核酸组成,bp、 kb、Mb：,一个双链DNA分子的长度通常用互补核苷酸对的数目来表达，也就是通常所说的碱基对(base pair, bp)。对于大的DNA分子通常用多少千个碱基对来表示，即kb (kiIo base pairs)。当双链DNA分子超过几百万个诚基对时，就用百万碱基对，即Mb (mega base pairs)这个单位来描述它。,bp、 kb、Mb：一个双链DNA分子的长度通常用互补核苷酸,二 基因工程的工具酶,限制性内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶,二 基因工程的工具酶限制性内切酶,（一） 限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）,限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）： 简称限制酶。限制酶能够识别DNA大分子链上特定的核苷酸顺序，并能在某一特定部位将DNA断裂。它的发现和应用为从细胞基因组中分离目的基因提供了重要工具。,（一） 限制性内切核酸酶（restriction endon,1 限制性核酸内切酶的发现,1962年 Arber, W(瑞士).等 提出限制与修饰假说。 1968 Arber 等发现型限制性酶。 1968 Smith和Wilcox K.W.发现了类限制性酶 并阐明其性质。 1971 Nathans等首次制作酶切图谱。 因他们发现了限制性酶并应用于分子遗传学而获1978年度诺贝尔生理学和医学奖。,1 限制性核酸内切酶的发现 1962年 Arber, W(瑞,1962 , Arber, 1968 Smith 发现限制性酶,W. Arber (1929 ) H. O. Smith (1931 ) Biozentrum der Universitt Basel, Johns Hopkins University School Switzerland of Medicine,USA,1962 , Arber, 1968 Smith 发现限制性,2 限制性核酸内切酶的生物功能,识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用 hsd R：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限制性甲基化酶 hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hind II和Hind III,2 限制性核酸内切酶的生物功能识别双链DNA分子中的特定序列,3 限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,H i n d H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,3 限制性核酸内切酶的命名 属名,4 限制性内切酶的类型,4 限制性内切酶的类型,5 II 型限制性核酸内切酶的基本特性,识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,5 II 型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoRI 37 ,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,EcoRI等产生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-,PstI等产生的3 粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等产生的3 粘性末端5 G-C-T-C-T-,PvuII等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37 ,PvuII等产生的平头末端5 G-C-T-C-A-G-,同裂酶（Isoschizomers)：有一些来源不同的限制性内切酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶特称为同裂酶，如Hpa和Msp，BamH I和Bst I分别是一对同裂酶。产生同样的切刻，形成同样的末端同尾酶(Isocaudamer)：与同裂酶对应的一类核酸限制性内切酶，它们虽然来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，特称之为同尾酶。如BamH,Bcl,Bgl,Sau3A和Xho是一组同尾酶。,同裂酶（Isoschizomers)：有一些来源不同的限制性,6 影响限制性核酸内切酶活性的因素,1）DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶加大反应总体积延长反应时间,6 影响限制性核酸内切酶活性的因素1）DNA样品的纯度：,2）DNA样品的甲基化程度：,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响大肠杆菌中的dam甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR I等哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,2）DNA样品的甲基化程度：大肠杆菌中的dam甲基化酶在5,3）核酸内切酶的缓冲液性质：,高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象。如： EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者5AATT3,3）核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子,4）核酸内切酶的反应温度：,反应体系的温度是否是内切酶的最适反应温度。,4）核酸内切酶的反应温度：反应体系的温度是否是内切酶的最适反,7 限制性内切酶酶切DNA的方法,单酶切（完全酶切）环形DNA：酶切后产生与识别序列数相同的DNA片段，且片段的两个末端相同。线形DNA片段：产生n+1个DNA片段数，且有两个片段的一端仍保留原来的末端。双酶切（完全酶切）：两种不同的RE切同一种DNA分子。酶切结果？线形DNA分子，环形DNA分子，同尾酶,7 限制性内切酶酶切DNA的方法单酶切（完全酶切）,7 限制性内切酶酶切DNA的方法,部分酶切：RE对识别序列的不完全酶切原因有底物DNA的纯度、识别序列的甲基化、酶的用量不足、反应时间不够、反应缓冲液和温度不适宜等。,7 限制性内切酶酶切DNA的方法部分酶切：RE对识别序列的,8 类型限制性内切酶的主要用途,1）制作DNA分子的物理图谱；,8 类型限制性内切酶的主要用途1）制作DNA分子的物理图,基因工程-基本概念与工具酶课件,练习：根据以下描述绘制限制性内切酶图谱,现分离到某DNA片段，用BglII 和 BamHI 酶切后进行电泳检测，得到如下的电泳图。请根据电泳结果分析BglII 和 BamHI在该DNA片段上的位置。要求标注酶切位点及各片段的长度。,练习：根据以下描述绘制限制性内切酶图谱现分离到某DNA片段，,基因工程-基本概念与工具酶课件,2）产生新的嵌合DNA分子（ DNA的连接）,2）产生新的嵌合DNA分子（ DNA的连接）,基因工程-基本概念与工具酶课件,（二） DNA连接酶,1 定义：利用ATP 或NAD+作为能量，通过催化并排的两条DNA片段的5-P，3-0H之间形成一个磷酸二酯键，从而使两段DNA分子共价连接起来的特异的酶称DNA连接酶。或：DNA连接酶（Ligase）是一种能够催化在双股DNA链的3-OH和5-P之间形成磷酸二酯键的酶。,（二） DNA连接酶1 定义：,注意：,DNA连接酶并不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的 DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。可连接互补粘性末端或平末端以及缺口修复，不能连接单链DNA或裂口,注意：DNA连接酶并不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链,裂口（Gap）：单链的裂口，是双链DNA分子上某一条链失去一个或连续数个核苷酸所造成的单链断裂，称DNA的Gap。缺口（Nick）：是双链DNA分子上的单链断裂，是由相邻两个核苷酸之间失去磷酸二酯键所造成的单链断裂，称DNA的Nick。,裂口（Gap）：单链的裂口，是双链DNA分子上某一条链失去,2 DNA连接酶的三个条件：,需能过程，即需要ATP；（2个高能磷酸键） 被连接的两个片段，一端要提供游离的5-P，另一端提供游离的3-OH；5-P与3-OH的并排。,2 DNA连接酶的三个条件：需能过程，即需要ATP；（2,3 DNA连接酶的基本作用,1）修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键,DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,3 DNA连接酶的基本作用1）修复双链DNA上缺口处的磷酸,2）修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,T4-DNA连接酶,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,OH,P,nick,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,2）修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键T4-D,3）连接多个平头双链DNA分子：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,3）连接多个平头双链DNA分子：5 G-C-T-C-A,平头双链DNA片段的连接操作,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多,平头双链DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核,平末端DNA的连接方法：,1）直接利用T4 DNA 连接酶连接2）另外的常用方法：同聚物加尾；linker（衔接物）连接法；加Adapter方法（接头）。,平末端DNA的连接方法：1）直接利用T4 DNA 连接酶连接,提高平头末端连接效率的方法包括：,加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10% PEG8000(聚乙二醇） ，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM,提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘,（三） DNA聚合酶,DNA聚合酶催化的反应,（三） DNA聚合酶DNA聚合酶催化的反应,DNA聚合酶催化的反应,反应特点： 1）以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为底物催化合成DNA2）需要模板(3 5)、Mg2+ 和引物的存在3）不能从头合成新的DNA链（必须有3 -OH末端）4）催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端5）催化DNA合成的方向是5 3 6）产物DNA的极性与模板相对。,DNA聚合酶催化的反应反应特点：,5种： DNA聚合酶 I 、II、III、,5种： DNA聚合酶 I 、II、III、,1 大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）,53的DNA聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,35的核酸外切酶活性,1）大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本性质：,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-OH,5 ppp dN Mg2+,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,DNA pol I,1 大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）5,缺口平移标记法,2）大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+ 5 dNTP 5 ppp dA（a-32P-dATP）,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,制备32P标记的探针,DNase I,DNA pol I,缺口平移标记法2）大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途：5,2 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）,大肠杆菌DNA聚合酶 I 经枯草杆菌蛋白酶处理，获得的三分之二的大肽段，即为Klenow酶Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性,2 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）大肠,Klenow酶的基本用途：,补平由核酸内切酶产生的3隐蔽末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列,Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的3隐蔽末端,Klenow酶补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,dATP dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,Klenow酶补平由核酸内切酶产生的5粘性末端5 G,Klenow酶的基本用途： DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,a-32P-pppdA dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,Klenow酶的基本用途： DNA片段的同位素末端标记5,3 依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,反转录酶,Mg2+ dNTP,5TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,5TTTTTTTTTTTTTT,3cDNA,3 依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特,（四）核酸外切酶,单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+,（四）核酸外切酶单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVI,（四）核酸外切酶,双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3 端外切,（四）核酸外切酶双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoI,双链核酸外切酶：核酸外切酶（ Exo）核酸外切酶特异性地从5 端外切,双链核酸外切酶：核酸外切酶（ Exo）,（五）单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae）降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍Zn2+必需最适pH范围为4.0 - 4.3需要NaCl 10 - 300 mmol/L降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍,（五）单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：来自稻,S1核酸酶的主要功能：,S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,5 G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 3,5 dNMPs 或 5 NMPs,S1核酸酶的主要功能：S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或,S1核酸酶的主要功能：,S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A 5,nick,gap,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G,3 C-G-A-G-T-C,T-G-G-A-G-T 3,A-C-C-T-C-A 5,S1核酸酶的主要功能：S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻,S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1 mapping）,DNA,mRNA,杂交,S1,EcoRI,S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1 mappi,（六）末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）,TdT的基本特性：来自小牛胸腺,不需要模板的DNA聚合酶(53 )，随机掺入dNTPs,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Mg2+ dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,（六）末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）TdT的基本特性：来自小,TdT的基本特性：,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+ dATP,5 p,3 HO AAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAA OH 3,p 5,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+ dTTP,5 p,3 HO,TTTTTTTTTTTTTTTT OH 3,p 5,TTTTTTT TTTTTT,TdT的基本特性：5 p3 HOOH 3 p 5,来自小牛肠的碱性磷酸单酯酶（CIP）,来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）,5 p,OH 3,DNA or RNA,5 ppp dN,5 pppN,BAP / CIP,OH 3,5 HO,5 HO dN,5 HO N,（七）碱性磷酸单酯酶脱掉5磷酸基团,来自小牛肠的碱性磷酸单酯酶（CIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单,T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5-OH上加磷酸基,5 HO,3 HO,OH 3,OH 5,T4-PNP,Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）,5 p,3 HO,OH 3,p 5,用于探针的末端同位素标记：,（八） T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）,T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5-OH上加磷酸,小结：二 基因工程的工具酶,限制性内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸外切酶单链核酸内切酶：S1核酸酶末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）碱性磷酸酶T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）,小结：二 基因工程的工具酶限制性内切酶,三 DNA片段的连接重组,DNA连接酶DNA片段之间的连接具互补黏性末端片段之间的连接具平末端DNA片段之间的连接DNA片段末端修饰后进行的连接DNA片段加连杆后进行连接DNA重组,三 DNA片段的连接重组DNA连接酶,同种内切酶产生的粘性末端的连接,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,同种内切酶产生的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTA,同尾酶生产的粘性末端的连接,BamHI,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,GATCA,T,5,退火,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,T4-DNA ligase,5,5,BclI,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,5,5,同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCC,不同粘性末端的连接,BamHI,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,G,ACGTC,3,T4-DNA ligase,5,5,PstI,3,T4-DNA pol,切平,5,5,G,C,Klenow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,5,不同粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCCCTAG,人工粘性末端的连接 5突出末端,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,5 AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,Klenow,补平,Klenow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,GAATT,CTTAA 5,5,5 AATTC,TTAAG,TdT,TdT,dGTP,dCTP,GAATTGGGGGG,CTTAA,AATTC,GGGGGGTTAAG,GGATCCCCCCC,CCTAG,GATCC,CCCCCCCTAGG,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,5,5,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,退火,BamH I,BamH I,EcoR I,BamH I,人工粘性末端的连接 5突出末端5GCCTAGGATC,人工粘性末端的连接 3突出末端,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3,C,退火,Pst I,Pst I,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,Pst I,Sph I,人工粘性末端的连接 3突出末端CTGCA 3 GG,人工粘性末端的连接 平头末端,C 3,G,G,5,G 3,C,5,C,3 G,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dTTP,dATP,GTTTTTTTTTT 3,C,退火,C,3 TTTTTTTTTTG,CAAAAAAAAAA 3,G,G,3 AAAAAAAAAAC,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,S1,C,3,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,加热,人工粘性末端的连接 平头末端C 3 GG5 G,粘性末端的更换,BamHI,5,5,T4-DNA ligase,Klenow,补平,GATCC,5,G,5,G,CCTAG,5,5,5,GGATC,CCTAG,5,GATCC,CTAGG,5,5,GGATCGGAATTCCGATCC,CCTAGCCTTAAGGCTAGG,5,5,EcoR I,GGAATTCC,CCTTAAGG,EcoR I linker,粘性末端的更换BamHI5 5GGATCCCCTAGGT,重组率,重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。,DNA重组,重组率的定义,重组率 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子,提高重组率的方法,提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1,载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：,5,5,EcoRI,5,G,CTTAA p,AATTC,G,5 p,5,5,AATTC,G,5 HO,退火,5,G-A-A-T-T-C,C-T-T-A-A G,5,G A-A-T-T-C,C-T-T-A-A-G,OH,HO,OH,HO,碱性磷酸单酯酶,碱性磷酸单酯酶,提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1,提高重组率的方法,加装同聚尾末端：,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3,C,退火,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,提高重组率的方法加装同聚尾末端： CTGCA 3 GG3,小结,1.基因工程的基本概念2.DNA重组与工具酶 3.基因克隆载体4.目的基因5.重组DNA导入受体细胞6.重组子的鉴定,小结1.基因工程的基本概念,思考题：,1. DNA重组技术的定义。 2. DNA重组技术的基本步骤包括？3.基因工程的上游操作过程可简化为哪五步4.基因工程研究的理论依据是什么？5.基因工程的四大要素包括哪几方面？6.型限制性内切核酸酶的基本特性7.限制性内切酶酶切DNA的方法包括？影响限制性内切酶活性的因素有哪些？8.DNA连接酶（DNA ligase）：,思考题：1. DNA重组技术的定义。,