基因诊断和治疗ppt课件.ppt

基因诊断,王青,概 述,第一节,3,依据DNA生物学功能及分子遗传学中心法则，DNA（基因）在生物体蛋白质合成中起主要作用，一定结构的基因产生一定结构的蛋白质，一切生理和病理现象都直接或间接地受遗传基因控制。,基因诊断的理论依据,4,是指运用分子生物学和分子遗传学方法对生物体的基因组DNA片段及其转录产物进行定性和定量分析，从而对疾病作出诊断。,基因诊断的概念,分析手段,研究途径,研究目的,分子生物学、遗传学的技术和原理,1.对DNA序列分析鉴定；2.对mRNA分析定量。,在DNA水平分析、鉴定遗传性疾病所涉及基因的突变（置换、缺失或插入）,5,6,（一）高度的特异性（二）检测灵敏度及精确性高（三）可以早期快速诊断（四）检测材料来源广（五）被检测基因不一定要处于活化状态,基因诊断的特点,7,对患者基因或DNA本身直接进行分析，具有高度的特异性,基 因 诊 断,临 床 诊 断,血清学诊断,生化学诊断,以疾病表型改变为依据，非特异、出现时间较晚,（一）高度的特异性,疾 病 诊 断,8,待测标本用量少，PCR方法可以检出pg（10-12g）水平的靶基因。可从人类长达3106kb的基因组中检测单拷贝基因，并可检出某一基因的单碱基改变。,（二）检测灵敏度及精确性高,9,如结核性脑膜炎，常规培养鉴定需几周时间，痰涂片染色镜检阳性率低，而应用PCR方法确诊只需一个工作日。由于人体各种组织中得到的DNA都是一样的，因此，在妊娠早期取胎儿绒毛或在妊娠中期取羊水脱落细胞提取DNA，可进行遗传病的产前诊断。,（三）可以早期快速诊断,10,机体各种组织的有核细胞均有全套基因组DNA，都可以作为分析的材料，而不必考虑表达问题（如珠蛋白基因、苯丙氨酸羟化酶基因）。有的遗传病至今也不了解引起疾病的基因、基因产物和生化机理，但只要有与疾病连锁的遗传标志即可进行诊断。,（四）检测材料来源广,11,即使细胞中基因在静止状态时（如血斑、精液斑中的DNA），也可被测出。,（五）被检测基因不一定要处于活化状态,12,核酸杂交,聚合酶链反应,基本技术,基因诊断的原理,基因突变：DNA缺失、插入、移码突 变、点突变,13,已知基因的核酸序列(标记）,待测的单链基因组DNA,+,待测DNA中含已知基因序列,双链DNA（含标记物）,（一）核酸杂交,杂交信号检测,14,（二）聚合酶链反应（PCR）,15,（一）基因诊断检测的靶物 DNA（基因） 分析基因的结构 mRNA 从基因表达水平分析基因的功能,基因诊断的条件,16,基因探针,高度特异性,灵敏显示系统,（二）基因诊断检测的探针,探针:标记的已知序列核酸片段，包括 DNA, cDNA, RNA, Oligonucleotide,17,基因组探针,cDNA探针,寡核苷酸探针,RNA探针,从相应的基因转录获得mRNA，再通过逆转录而获得。,来自基因组DNA文库中有关的基因片段，经克隆或PCR扩增获得,在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段。,从病毒基因中分离；通过cDNA克隆或基因克隆经体外转录体系制备。,基因诊断的方法,Method of Gene Diagnosis,第二节,19,基因诊断的方法,核酸分子杂交技术聚合酶链反应（PCR）技术连接酶链反应（LCR）DNA序列分析基因芯片技术限制性片段长度多态性（RFLP）分析,20,一、核酸分子杂交技术,（一）原位（in situ）杂交（二）斑点印迹（ spot blot）杂交（三）Southern 印迹杂交（四）Northern 印迹杂交,21,原位（ in situ ）杂交,方法：不需提取DNA或RNA，直接用培养/采集的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固定载玻片上）和细菌菌落（复印至滤膜上）与标记核酸探针杂交。,用途：可测知特定基因的存在或表达状况，还可观察被测基因在细胞内或染色体上的定位。优点：不必提取核酸避免了抽提中核酸量的损失，因而比其他技术敏感的多，可在1%的细胞中检出目的核酸序列。,22,（二）斑点印迹（Spot blot ）杂交,方法：将提取的样本DNA或RNA，变性后，点样吸附在硝酸纤维膜(NC)/尼龙膜上，与探针杂交；或把细胞/病毒点在膜上，变性后杂交；或培养的菌落、菌斑原位吸附于膜上，变性后杂交。,用途：基因组中特定基因及其表达的定性、定量分析。优点：简便、快速、可在同一张膜上同时进行多样品检测。缺点：不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。,23,基 因 诊 断 技 术,斑 点 杂 交,点样,Probe-32P,检测,AB,1 2 3 4,24,方法：把DNA经限制性酶切割、凝胶电泳后，再转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，与标记核酸探针杂交。,（三）Southern印迹杂交,用途：用于基因组中特定的基因或序列的定性及定量分析，也常用于鉴定克隆DNA的特殊序列。优点：既可准确保持DNA序列在电泳图谱中的位置，又可检测出哺乳动物总基因组中特异的DNA顺序片段（单拷贝基因），并测定其分子量。,25,26,（四）Northern印迹杂交,方法：将RNA经变性(非碱变性)及电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或其他固相支持物上，与标记核酸探针进行杂交反应。,用途：是分析基因表达水平的主要技术。可用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性、定量分析，测知某一特定基因的表达情况。,27,二、聚合酶链反应（PCR）技术,（一） DNA PCR（二） RT-PCR （逆转录PCR）（三） 原位PCR（四） 多重PCR（五） 定量PCR（六） PCR-SSCP（单链构象多态性）,28,方法：以所需扩增的基因组DNA为模板，进行PCR反应。经扩增的DNA片段，通过电泳分离和染色（溴乙锭或荧光染色）后，可直接在所显示的带谱上进行诊断。,（一）DNA PCR,特点：通过PCR 2030次的循环，可使原来需10g的基因组DNA才能进行的单拷贝基因的探测，减少到ng水平。,29,优点：应用PCR方法，既不需Southern转移，又不必制作探针进行杂交及放射自显影等操作。且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时，故既简便又经济。,用途：用于检测单拷贝基因或DNA片段的存在，并常与核酸分子杂交结合，分析鉴定基因突变。,（一）DNA PCR,30,（二）逆转录 PCR （RT-PCR）,方法：用提取的mRNA或总RNA（含mRNA ）为模板，逆转录成cDNA后，再扩增cDNA。用途：是检测特定基因表达水平的主要方法，也是用于鉴别诊断RNA病毒的重要技术。,31,Reverse transcription-PCR(RT-PCR)原理,32,（三）原 位 PCR（in situ PCR）,方法：不需提取DNA/RNA，直接用组织切片和细胞进行PCR或RT-PCR反应。,特点：比原位杂交的灵敏度提高50100倍，但扩增效率不如液相PCR。用途：在组织、细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列。既能鉴定含靶序列的细胞，又能确定被测靶序列在细胞内或染色体上的位置。多用于检测病原体，尤其是对于潜伏性感染的病原体，可大大提高检出率。,33, 固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。 蛋白酶K消化处理：用60g/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K。 PCR扩增：在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增。有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置。 杂交：扩增后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。 观察：显微镜观察结果。,（三）原 位 PCR（in situ PCR）,34,（四）多 重 PCR,方法：在一次PCR反应中加入多对引物，同时扩增DNA链上的不同序列段。扩增产物经琼脂糖电泳和溴乙锭或荧光染色，即可直接在所显示的带谱上进行诊断。,用途：主要用于一些“超大”基因中大片段缺失的分析。举例：杜氏肌营养不良症（DMD）是由于DMD基因的9个外显子区段缺失所致，可设计相应的9对扩增引物来诊断。,35,基 因 诊 断 技 术, 多重PCR,在一个PCR体系中加入数对PCR引物，覆盖区域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失,E1 E2 E3,36,（五）荧光定 量 PCR,一种实时监控核酸扩增的技术, 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。用途：特定DNA/RNA序列的定量分析。,37,原理：不同的单链DNA（即使只差1个碱基）有不同的空间构象，即单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP），这种不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率不同，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。,（六）PCR-SSCP（单链构象多态性）,38,方法：在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增产物用甲酰胺等变性成单链DNA，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后根据电泳带位置的差异进行诊断。,（六）PCR-SSCP（单链构象多态性）,用途：是检测基因未知突变的常用技术，而且适宜于大量样本的筛选，能简便、快速、灵敏地检测有无点突变或多态性（但如欲阐明突变的碱基性质，则需作序列分析）。,39,40,ASO（allel-specific oligonueleotide）：等位基因特异的寡核苷酸探针。当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成ASO探针，用同位素或非同位素标记来进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。,（七）PCR-ASO,41,用于探测点突变时一般需要合成两种探针：探针1：与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；探针2：与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交。,（七）PCR-ASO,42,PCR-ASO ：即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO作点杂交。优点：既简化了方法，又节约了时间，且只要极少量的基因组DNA就可进行。,（七）PCR-ASO,43,用ASO检测苯丙酮尿症（PKU）家系,44,原理：在LCR体系中，需设计两对寡核苷酸探针，使第一个探针的3-端与第二个探针的5-端相邻，并使两个探针分别与待测DNA完全互补。耐热DNA连接酶就可以在第一次热变性、退火后，将两个寡核苷酸探针连接起来。,连接酶链反应（ligase chain reaction，LCR）又称连接扩增反应（ligation amplification）。,三、连接酶链反应（LCR）,45,如待测DNA在两寡核苷酸接头处有一碱基突变（置换、缺失或插入），则两寡核苷酸接头处与待测DNA就会出现一个碱基错配，在变性和退火后不再发生连接反应，最终也不会有突变位点周围序列的扩增；相反，野生型基因在LCR后会发生相应序列的扩增。通过聚丙烯酰胺电泳就可显示其差别。,三、连接酶链反应（LCR）,因此，通过LCR反应，可明确区分寡核苷酸是否与模板DNA完全互补，检测基因点突变。,46,47,优点：LCR连接反应温度接近寡核苷酸熔解温度（Tm），识别单核苷酸错配底物的互补特异性极高，其识别点突变的特异性高于PCR。,三、连接酶链反应（LCR）,应用： 人类单碱基突变遗传病的产前诊断； 人群中单基因病多态性的快速筛检； 法医学中个体DNA的准确鉴定； 微生物亚种和亚型的鉴定。,48,四、DNA序列分析,方法：多采用DNA自动测序仪测序。可先将样品DNA进行PCR扩增，再将产物纯化后进行测序。,用途：直接分析待测基因核苷酸序列。举例：美国ABI 310型基因分析仪，具有DNA测序、PCR片段大小分析和定量分析功能。,49,方法：将疾病特征性的基因片段作为靶基因固定于芯片上，从病人的血清抽提出mRNA，经逆转录PCR后标记作为探针，与芯片杂交，最后对结果进行扫描分析。,优点：具有自动化、高信息通量等特点，其灵敏度、检出率高于传统PCR，解决了传统印迹技术操作复杂、自动化程度低和检测效率低等问题。,五、基因芯片技术,50,病原体检测芯片：如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）和艾滋病病毒（HIV）检测芯片。疾病诊断芯片：如肝癌诊断芯片、糖尿病诊断芯片等。基因表达谱芯片：如白血病基因表达谱芯片（可用于白血病的分型和病情预测）。,五、基因芯片技术,51,52,原理：由于基因缺失、重排或碱基置换，使DNA分子中原有的某种限制性内切酶的识别位点发生改变（消失或增加），所以酶切后产生与正常等位基因不同长度的片段，且往往同某种疾病有连锁关系，因而可作为这种疾病的诊断指标。,六、限制性片段长度多态性(RFLP)分析,53,人PAH基因的Msp1多态性位点,54,RFLP分析PKU家系,正常：与23kb连锁；突变：与19kb连锁； 杂合子： 19kb23kb片段,55,基因诊断的应用,第三节,56,一、遗传病的基因诊断,57,遗传病的基因诊断方法,58,遗传病基因诊断举例,1. 基因缺失型遗传病地中海贫血（简称地贫）,59,发病机理,人类血红蛋白（Hb）由珠蛋白和血红素构成。人类的珠蛋白主要有、等几种，各由相应的基因来调控。如果调控的基因存在缺陷，将导致相应蛋白生成障碍，产生相应的地中海贫血。例如，调控珠蛋白的基因缺陷造成珠蛋白生成障碍（不能形成Hb四聚体，RBC体积缩小，运氧能力下降），导致地贫，如此类推。其中以和地贫（常染色体隐性遗传病）较为常见。,60,地中海贫血的基因诊断,Southern杂交法：当用基因探针与地贫患者基因组DNA进行Southern杂交时，可出现以下四种情况： 1条14kb和1条10kb的带 地贫2（基因4缺1）； 只有1条单拷贝（正常人为双份）的14kb带 地贫1，（基因4缺2 ）； 只有1条10kb的带中间型地贫，又称血红蛋白H病（基因4缺3 ）； 无任何杂交带 Barts水肿胎（4个基因完全缺失 ）,61,斑点杂交法：直接用探针进行斑点杂交，自显影后根据斑点深浅的不同可以对地贫作出诊断。PCR诊断法：在基因缺失范围内设计一对引物，然后PCR扩增胎儿的DNA，如Bart水肿胎，则无扩增产物，电泳后无任何带纹，从而建议进行人工流产，但此法不能诊断其它类型的地贫（除非另设计引物作PCR）。,62,63,2. 点突变型遗传病镰状细胞贫血（HbS）,64,1949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红细胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。,65,镰状细胞贫血,镰状细胞性贫血在美国是最常见的遗传性血液疾病，大约有72,000个美国人受到影响或在非洲后裔美国人中的概率为1/500（大约8%非洲后裔美籍人是携带者）。以发生疼痛、慢性溶血性贫血和严重感染为特征。通常开始于儿童期。,66,镰状细胞贫血的发病机理,已知突变基因是编码珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG，从而使缬氨酸（Val）取代了甘氨酸（Glu） 。突变导致产生结构不正常的Hbs血红蛋白, 在某些条件下（如低氧或高浓度血红蛋白），其不正常的Hbs簇聚集，把受扰乱的RBCs变成镰刀形。镰状红细胞弹性下降，阻塞微循环，结果就产生疼痛甚至损伤肾、心、肺等组织。,67,68,诊断方法一,RFLP：使用限制酶Mst切割链，它能切割正常链中的CCTGAGG序列，但不能切割突变了的CCTGTGG（AT）。因突变消除了一个切点，内切酶片段长度发生了改变（1.15kb1.35kb），电泳后，根据条带长度的不同就可区别正常的A基因和镰变了的S基因。,69,PCR-RFLP：先PCR扩增含有突变位点的-珠蛋白基因片段，扩增产物再用特定限制性酶消化，经琼脂糖凝胶电泳、EB染色后直接观察不同的电泳条带，即可作出判断。扩增产物（294bp）酶切后： AA（正常）：2条带（103bp 、191bp） SS（HBS纯合子）：1条带（294bp） AS（HBS杂合子）：3条带（294、103、191bp）,70,ASO：合成两种探针：一种与正常A基因序列完全一致，能与之稳定地杂交；另一种与突变基因序列一致，能与s基因稳定地杂交，但不能与正常A基因杂交。根据杂交结果就可把发生了突变的S基因检测出来。,71,PCR-ASO法：即先PCR扩增长约110bp的基因片段，然后再与ASO探针杂交，可减少目的基因DNA用量，并降低与基因组DNA杂交时的非特异性信号。,72,LCR：预先不需对目的DNA进行扩增，对A与S差异的检测特异性强、灵敏度高。,73,第十三章 基因治疗,基因治疗的概念,基因治疗是指用正常基因校正或置换治病基因的一种治疗方法，把目的基因导入人体，通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达或低表达、或已异常突变而不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法,(一)基因置换,指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入基因置换基因组内的原有缺陷基因,（二）基因修正,指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留矫正突变碱基，精确的原位修复最理想，难以实现,78,基因编辑方法CRISPR-Cas9,（三）基因补偿,将目的基因导入病变细胞或其他细胞，通过目的基因的表达产物补偿缺陷基因的不足或缺失。,（四）基因失活,采取特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某个基因使之不表达，以达到治疗疾病的目的。1.反义核酸技术2.核酶,一、基因治疗的必要条件,（1）用传统治疗无效或效果不佳；（2）发病的分子机制已阐明，且目的基因已经克隆且对其产物有详尽的了解，；（3）目的基因能在体外操作，能有效的导入靶细胞；能在靶细胞中一段时间或长期稳定驻留；（4）导入基因能有适度表达；（5）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害；（6）目的基因的表达不需严格控制，或能够人为控制；（7）人类的基因治疗需经过严格审批,与基因工程的步骤同,（一）目的基因的选择和制备,（二）靶细胞的选择,1、选择靶细胞应考虑因素（1）组织特异性细胞；（2）易获得、寿命长（3）离体细胞易受外源遗传物质转化；（4）易成活,2、常用 靶细胞（1）造血细胞（2）皮肤成纤维细胞（3）肝细胞（4）血管内皮细胞（5）淋巴细胞（6）肌肉细胞（7）肿瘤细胞（8）其他细胞,（三）基因的导入（基因转移技术）,体内法：体内直接导入基因法 回输法：靶细胞介导的基因治疗,基因导入的方式,非病毒载体法(物理、化学法)病毒载体法（生物法) 病毒性载体 逆转录病毒载体 腺病毒载体 腺相关病毒载体 痘苗病毒载体 单纯疱疹病毒载体 非病毒性载体,基因转移的非生物学方法,化学法（一）脂质体转染法（二） 磷酸钙共沉淀法（三） DEAE-葡聚糖转染技术（四）受体介导基因转移技术物理法（一）显微注射法 （二）电穿孔（三）颗粒轰击（基因枪）技术,（四）转染靶细胞的筛选和导入基因的鉴定,利用抗性标记或荧光标记筛选PCRDOT BLOT免疫组化生物活性检测,1 原位修复有缺陷的基因2 基因替代疗法3 重新开放已关闭的基因4 基因抑制5 基因封闭6 引入特定基因以提高免疫力,基因治疗的主要策略,