基因突变重组与检测技术ppt课件.ppt

基因突变重组与检测技术 卫生部北京医院肖飞,临床基因扩增实验室检测培训课程,内容介绍,二、基因重组技术,三、基因突变的检测方法,1. 分子杂交技术,3. 高通量基因测序技术,一、基因突变的产生与后果,2. 基因测序技术,遗传中心法则回顾,第一节 基因突变的产生与后果,点突变 基因缺失 插入 基因异位或重排 表观遗传学,基因突变的种类,DNA分子中发生碱基对的 替换 、增添和 缺失，而引起的基因序列的改变,一、基因突变的定义,增添,缺失,替换,基因突变的原因和类型,类型,原因,自然突变,人工诱变,基因突变的特点和意义,意义：新基因产生的途径，是生物变异的根本来源，是生物进化的途径。,特点,普遍性: 生物界中普遍存在随机性: 可发生在生物个体发育任何时期不定向性： 突变无明显偏倚低频性: 自然状态下突变频率很低105-10-8多害少利性：多数有害,少数有利,点突变的实例：镰刀型细胞贫血症的形成,病人的血红蛋白的一条多肽链发生了什么变化？,脯氨酸谷氨酸谷氨酸, 脯氨酸缬氨酸谷氨酸 ,正常,异常,点突变的实例：镰刀型细胞贫血症,与肿瘤相关的常见点突变,肿瘤突变取样的特殊性,注意事项：必须从肿瘤组织中取样,Sample Selection byLaser Capture Microdissection,基因缺失,基因缺失可以是1-2个碱基，也可以是一个片段甚或一个外显子的缺失。基因片段的缺失可使该基因激活，转录异常，使基因正常的生物学功能丧失。在肿瘤发生中，多为抑癌基因的缺失。,常见的抑癌基因缺失包括： RB - the retinoblastoma gen p53 gene p16-INK4a,基因插入,基因插入多由病毒感染造成。,基因异位与重排,指细胞基因组中DNA顺序重新排列组合的现象,淋巴细胞白血病t(9;22): BCR - ABLt(12;21): TEL - AML1t(1;19): E2A - PBX1t(4;11): MLL - AF4髓细胞白血病Inv(16):CBF - MYH11t(8;22): AML - ETOt(9;22): BCR - ABL,ETV家族常见融合基因,表观遗传学,1. 概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。2. 特征: (1)可遗传；(2) 可逆性；(3) DNA不变3. 表观遗传学的现象：(1) DNA甲基化(2) 组蛋白修饰(3) MicroRNA(4) Genomic imprinting(5) 端粒酶,表观遗传学甲基化,表观遗传学组蛋白修饰,组蛋白（去）乙酰化 De/Acetylation组蛋白甲基化 Methylation组蛋白磷酸化 Phosphorylation组蛋白泛素化 Ubiquitination组蛋白糖基化 ADP-Rybosilation组蛋白与Swi/Snf复合体的结合 Swi/Snf complex, which, in vitro, uses the energy of ATP hydrolysis to disrupt histone-DNA interactions多数化学修饰的化学基团可以减少组蛋白的正电性，从而使其与DNA结合变疏松，使染色质结构发生变化。,表观遗传学microRNA,细胞核内转录后长片段的miRNA（Pri-miRNA),Drosha酶处理,70100个nt的发夹结构的RNA（pre-miRNA）,运输到胞质,Dicer剪切,1923个nt组成的成熟的miRNA,结合到由RNA介导的RISC或类似相同的复合物中，参与RNA干扰，由miRNA 和 靶基因mRNA的碱基配对引导RISC降解目的片段或是阻碍其翻译过程,表观遗传学microRNA,50的miRNAs位于或靠近肿瘤中易发生改变的染色体区域内.常见的断裂位点，靠近或在可能的癌基因或抑癌基因范围内最小扩增区域，可能包含癌基因最小杂合子缺失区域，通常认为抑癌基因定位在这些区域中脆性位点（FRA),FRA是容易发生姐妹染色质交换，易位，缺失，扩增的位点，或者质粒DNA和肿瘤相关病毒易插入位点,第二节 基因重组技术,整合 基因重组 转化 （自然） 转导 转座 质粒 基因工程 BAC （人工） YAC,基因重组,基因重组整合,整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。裂解： 噬菌体感染大肠杆菌的第二步 DNA利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将细菌涨破。,基因重组转化,转化： 由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。,细菌的转化,基因重组转化,病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。,转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。,基因重组转导,溶原菌中 DNA可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走一部分。后者称转导。带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。来源于宿主的基因称转导基因。,基因重组转位,转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。这些游动的基因称为转位子(transposon)。,基因工程技术,酶 目的基因 载体基因 宿主,基本要素,基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,质粒 (plasmid),特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。,克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体,目的基因,1. 化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3. cDNA文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第22章）,重组DNA技术中常用的工具酶-限制性核酸内切酶,定义限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,EcoRV,+,平端切口,粘端切口,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,重组DNA技术操作的主要步骤,大肠杆菌表达系统,酵母表达系统,哺乳细胞表达系统,几种不同的蛋白表达系统,重组DNA医药产品,目 录,酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他,人工染色体,染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。它需要3个关键序列，包括自主复制DNA序列（autonomously replicating sequence，ARS）着丝粒DNA序列（centromere DNA sequence，CEN)端粒DNA序列（ telomere DNA sequence, TEL）,人工染色体,将3个关键序列用分子生物学方法拼接起来就得到人造微小染色体（artificial minichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定、基因治疗以及研究染色体结构与功能关系等研究中得到了广泛的应用，具有极为重要的价值。目前，正在研究或应用的有：酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）哺乳动物人工染色体(mammalian artificial chromosome)。,酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome, YAC),第三节 基因突变的检测方法,分子杂交技术FISHSouthern blotNorthern blot芯片杂交,3. 高通量基因测序技术,2. 基因测序技术化学降解测序Sanger测序,前列腺癌细胞中TMPRSS2-ERG融合基因检测 （FISH法）,荧光原位杂交（FISH）,Southern和Northern blot原理和应用,Southern和Northern blot原理和应用,基因芯片原理,基因芯片原理,Gene probes（cDNA、DNA）,Ready-to-usemicroarray,or,arrayer,基因芯片原理,基因芯片原理,基因芯片原理,基因芯片原理,基因芯片原理,基因测序技术简介,他们给DNA 的测序带来了一场革命，分享了1980年的诺贝尔化学奖。后来Sanger法发展为自动化测序法，并为人类基因组测序做出了卓越贡献。,Fred Sanger 发明的末端合成终止法 (sanger法),Walter Gilbert发明的化学裂解法 Maxam-Gillbert法,Maxam-Gilbert化学裂解法,一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。,基因测序技术简介,G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。T+C反应：肼（低盐）C反应：肼（高盐） 测定DNA长度250bp。,碱基特异性化学切割反应：硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。,Maxam-Gilbert化学裂解法,末端合成终止法 (sanger法)原理,2,3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与普通dNTP不同之处在于其脱氧核糖的3位置少一个羟基，可在DNA聚合酶作用下通过其5三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但ddNTP因缺乏3羟基而不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，当正在增长的DNA链末端碱基为ddNTP时，则链延伸反应终止，不可能继续延伸。这样，在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离，结果将产生4类寡核苷酸，它们分别终止于模板链的每一个A、C、G或T的位置上。,末端合成终止法 (sanger法)原理,双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧苷三磷酸为循环测序反应的链终止剂。,末端合成终止法 (sanger法)原理,末端合成终止法 (sanger法)原理,末端合成终止法 (sanger法)原理,末端合成终止法 (sanger法)原理,末端合成终止法 (sanger法)原理,DNA甲基化的检测,DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的C转化为U，通过随后的PCR，将U转化为T，但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的 DNA的C发生上述转化，PCR后仍保持为C,融合基因的检测,淋巴细胞白血病t(9;22): BCR - ABLt(12;21): TEL - AML1t(1;19): E2A - PBX1t(4;11): MLL - AF4髓细胞白血病Inv(16):CBF - MYH11t(8;22): AML - ETOt(9;22): BCR - ABL,融合基因的测序结果,前列腺癌细胞中TMPRSS2-ERG融合基因检测 （测序法）,纯合子和杂合子的测序结果,异常测序结果的解读,含有插入或缺失突变,模板不纯,传统测序方法存在长度限制,高通量测序介绍,高通量测序的海量数据分析,基因组学研究大大降低了测序成本，同时提高了测序效率； 每个flow cell有8个通道一次单通道的测序可以获取至少500万个读数每次运行实验可读取10亿个碱基/flowcell 可精确读取重复序列 样本使用效率极高，所以对少量样本也可以极灵敏精确地检测 每次测序长度为200 bp左右,谢 谢,